空心蓮子草銨轉(zhuǎn)運(yùn)體Ap AMT1；3 基因的 克隆及功能鑒定

宋志忠，楊順瑛，郝東利，岳光振，蘇彥華

（1.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210008；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，江蘇 南京210014；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育最關(guān)鍵的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素之一，其占植物干重的1%～5%。氮素是蛋白質(zhì)、核酸和核蛋白的重要組成成分，也是葉綠素的主要成分，從而影響光合作用［1－2］。在土壤尤其是淹水條件下，銨是主要的無機(jī)氮存在形式［3－4］。無論是在土壤還是在水體中，銨是植物優(yōu)先吸收的氮素營(yíng)養(yǎng)［5－6］，而過量的銨會(huì)對(duì)植物的正常生長(zhǎng)造成毒害［7］。

銨吸收主要由整合在細(xì)胞膜上的特定的銨轉(zhuǎn)運(yùn)體（A MT）完成。近年來，銨轉(zhuǎn)運(yùn)體已經(jīng)在多種生物中如細(xì)菌、真菌、藻類、植物和動(dòng)物中得以鑒定。銨轉(zhuǎn)運(yùn)體主要分為A MT1 及A MT2 兩大亞家族［8］。部分AMT1家族的成員，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中 的At AMT1；1、At AMT1；2 和At AMT1；3［6，9］，歐洲油菜（Brassica napus）中的Bn AMT1；2［10］，百脈根中（Lotus j aponicus）的Lj AMT1；1、Lj AMT1；2 及Lj AMT1；3［11－12］，番 茄（Lycopersicon esculentum）中 的Le AMT1；1、Le AMT1；2 及Le AMT1；3［13－14］，楊 樹（Populus trichocarpa）中 的Pt AMT1；2、Pt AMT1；5、Pt AMT1；6、Pt AMT2；1 和Pt AMT2；2［15］，以 及 水 稻（Or yza sativa）中的Os A MT1；1、Os AMT1；2、Os－A MT1；3和Os A MT2；1［16－17］，其功能都在酵母或蛙卵中得以鑒定。

在擬南芥中，At AMT1；1、At AMT1；2、At AMT1；5及At AMT2；1 主要在根部和地上部表達(dá)，而At AMT1；3 和At AMT1；4 則分別在根部和花粉特異表 達(dá)［2，9，18］。在 氮 饑 餓 條 件 下，At AMT1；1 及At AMT1；3 表達(dá)豐度增加［6，19］，T－DNA插入突變體研究表明，At A MT1；1 和At AMT1；3 雙突變使得的吸收相對(duì)于野生型下降了約70%［20］，表明在高親和的條件下，At A MT1；1 和At A MT1；3 對(duì)的吸收起到了非常重要的作用。此外，番茄和百脈根中AMT1亞家族成員的表達(dá)特征也得到了研究［11－13，21］。

空心蓮子草（Alter nanther a philoxeroides）是一種水生雜草，因其繁殖速度快及富鉀能力強(qiáng)而聞名［22］，對(duì)極端條件尤其是受氮嚴(yán)重污染的水體或海岸帶有超強(qiáng)的適應(yīng)能力，對(duì)日益富營(yíng)養(yǎng)化的水體有潛在的修復(fù)能力。然而，對(duì)其銨吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究甚少。本研究通過RACE 克隆技術(shù)從空心蓮子草中分離了一個(gè)銨轉(zhuǎn)運(yùn)體Ap AMT1；3，利用半定量PCR 及定量PCR 對(duì)其表達(dá)特征進(jìn)行分析，并通過異源酵母功能互補(bǔ)對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證以期為探索空心蓮子草銨的吸收反饋調(diào)控機(jī)制及在富營(yíng)養(yǎng)化水體植物修復(fù)方面奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

空心蓮子草采自南京玄武湖畔，用1／4 MS營(yíng)養(yǎng)液［23］培養(yǎng)繁殖于溫室中。試驗(yàn)用苗在1／4 MS營(yíng)養(yǎng)液中添加1 mmol·L－1NH4Cl培養(yǎng)，缺銨處理?xiàng)l件不添加NH4Cl。溫室條件為16 h 光照／8 h 黑暗，溫度為光照條件下28℃，黑暗條件下23℃，每?jī)商旄鼡Q一次營(yíng)養(yǎng)液。酵母試劑中的克隆載體p MD19－T購自Ta Ka Ra公司，酵母表達(dá)載體p YES2購自Invitrogen 公司。YNB 培養(yǎng)基（Yeast Nitr ogen Base w／o Ammoniu m Sulfate and Amino Acids，本研究所用YNB 培養(yǎng)基均不含硫酸銨和氨基酸）購于Difco公司，D－半乳糖、精氨酸、氯化銨和甲基胺（Methylammoniu m，Me A＋）購于Sig ma公司，PCR 擴(kuò)增高保真酶Pri meSTAR?購自Ta Ka Ra公司，T4DNA 連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶KpnⅠ和NotⅠ購于New England Biolabs公司，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 RNA 提取及第一鏈c DNA合成

普通的分子生物學(xué)操作方案參照文獻(xiàn)［24］。利用RNAiso Plus Kit（Ta Ka Ra，Kyoto，Japan）分離純化總RNA。第一條單鏈c DNA 的合成參照the Pri mescript 1st Strand c DNA Synt hesis Kit（Ta Ka－Ra），用于擴(kuò)增保守區(qū)或基因全長(zhǎng)CDS的模板。

1.3 AMT1；3全長(zhǎng)c DNA 的克隆

通過生物信息學(xué)分析，以At A MT1；1氨基酸序列為參考序列，在NCBI上通過Blast P 比對(duì)，檢索到已報(bào)道植物A MT 成員的氨基酸序列，然后通過氨基酸序列比對(duì)，選定植物A MT 氨基酸水平的高度保守區(qū)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物對(duì)（表1），通過PCR 擴(kuò)增保守區(qū)片段，獲得1 條640 bp 的保守區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1 A）。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證及編碼產(chǎn)物比對(duì)為A MT 的保守區(qū)，分別設(shè)計(jì)序列特異性引物（表1），用于3′－RACE或5′－RACE擴(kuò)增。

3′和5′RACE 克隆過程參照文獻(xiàn)［22］。末端RACE 克隆所需的模板按照SMARTerTMRACE c DNA Amplification Kit（BD Biosciences Clontech）試劑盒操作：以1μg 總RNA 為 模 板，以3′－（5′－）CDS Pri mer A 為錨定引物，通過反轉(zhuǎn)錄獲得3′－（5′－）RACE－ready first－strand c DNA。根據(jù)上述保守區(qū)設(shè)計(jì)的特異性引物GSPs，通過巢式PCR 進(jìn)行RACE擴(kuò)增：第一輪，以3′－（5′－）RACE－ready firststrand c DNA 為模板，UPM／GSPout為引物對(duì)擴(kuò)增；第二輪，以第一輪產(chǎn)物為模板，以NUP／GSPin為模板進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得3′－端RACE的1 520 bp（圖1B）和5′－端RACE 的1 200 bp的特異性片段（圖1C），連接p GEM－T 載體送北京華大基因測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證后，拼接獲得A MT1；3 基因的全長(zhǎng)c DNA，通過DNAstar軟件尋找其ORF，并在NCBI通過Blast P比對(duì)，明確其編碼產(chǎn)物為銨離子轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白。根據(jù)基因ORF 序列設(shè)計(jì)上下游引物，擴(kuò)增獲得1條1 389 bp的目的片段（圖1D）。

表1 Ap AMT1；3 全長(zhǎng)c DNA克隆及q RT－PCR引物Table 1 Primer pairs used f or c DNA cloning and q RT－PCR of Ap AMT1；3

圖1 Ap AMT1；3 末端RACE及全長(zhǎng)ORF克隆Fig.1 RACE cloning and f ull－length open reading frame amplification of Ap AMT1；3

1.4 q RT－PCR分析

通 過NCBI／Pri mer－BLAST 在 線 服 務(wù) 器 設(shè) 計(jì)Ap AMT1；3 基因的特異性表達(dá)引物，以水稻Actin基因作為內(nèi)參（引物序列見表1），由上海Invitrogen生物公司合成。q RT－PCR 在Light Cycler 480Ⅱ（Roche）實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行，熒光染料使用SYBR Green（Ta Ka Ra，大 連）。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，35 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃，5 s，59 ℃，35 s，38 個(gè) 循環(huán)；72 ℃，15 s，1 個(gè) 循 環(huán)。定 量PCR 的 表 達(dá) 量 用相對(duì)表達(dá)量表示，通過2－△Ct法來計(jì)算。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物重復(fù)。

1.5 進(jìn)化樹分析

利用在線軟件CLUSTAL W（http：／／www.ebi.ac.uk／Tools／msa／clustal w2／）的Neighbor－joining 方法及通過對(duì)植物A MT 蛋白的多重序列比對(duì)構(gòu)建進(jìn)化樹。用于構(gòu)建進(jìn)化樹的A MT1家族成員在NCBI網(wǎng)站上通過BLAST 已報(bào)道A MT1 成員的氨基酸序列獲得。Ap A MT1；3 跨膜結(jié)構(gòu)域通過TMHMM（http：／／www.CBS.dk）和HMMTOP（http：／／www.enzim.hu／hmmtop／server／hmmtop.cgi）在 線 軟 件 預(yù)測(cè)完成。

1.6 p YES2－Ap AMT1；3 表達(dá)載體構(gòu)建

設(shè)計(jì)構(gòu)建p YES2－Ap A MT1；3 表達(dá)載體的引物（表1），上游引物引入KpnⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物引入SalⅠ酶切位點(diǎn)，由上海Invitrogen 生物公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物通過KpnⅠ／SalⅠ（TOYOBO，上海）雙酶切作用后，利用T4DNA 連接酶（New England Biolabs，美國(guó)）克隆到同樣雙酶切的p PAB404載體質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆并經(jīng)酶切驗(yàn)證正確后，送去測(cè)序再次驗(yàn)證其序列正確。

1.7 酵母功能互補(bǔ)

通過電轉(zhuǎn)化方法將空載體p YES2及重組載體p YES2－Ap AMT1；3 轉(zhuǎn) 入 酵 母 菌 株31019b（MATa meplΔmep2Δ：：LEU2 mep3Δ：：Kan MX2 ura3）［25］。電擊后加入1 mL預(yù)冷的1 mol·L－1山梨醇，30 ℃溫育2 h，于酵母選擇性培養(yǎng)基（0.17% YNB ＋2 mmol·L－1精氨酸＋2% D－半乳糖＋2%瓊脂）平板上30 ℃黑暗培養(yǎng)3 d；挑取單菌落在酵母液體選擇培養(yǎng)基中30 ℃震蕩培養(yǎng)36 h，經(jīng)PCR 鑒定為陽性的 單 菌 落 即 為 重 組 酵 母p YES2－Ap A MT1；3／31019b。重組酵母菌株在YNB 液體選擇性培養(yǎng)基上 培 養(yǎng) 至OD600至1.0，經(jīng)10 倍 梯 度 稀 釋 成10－1、10－2、10－33個(gè)濃度，分別取4個(gè)濃度梯度的菌液5 μL 點(diǎn) 樣 于 以2 mmol·L－1精 氨 酸 或2 mmol·L－1NH4Cl為唯一氮源、p H 為5.8的固體培養(yǎng)基（0.17% YNB＋2% D－半乳糖＋2%瓊脂）上，于30 ℃黑暗培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)狀況并拍照。轉(zhuǎn)空載體pYES2 的31019b 酵 母p YES2／31019b為對(duì)照［26］。

1.8 統(tǒng)計(jì)和作圖

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 13.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析（SPSS，Chicago，IL，USA），用Origin 8.0 軟件作圖，所有圖表都通過Adobe Photoshop 7.0整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 空心蓮子草Ap AMT1；3 基因的克隆

銨轉(zhuǎn)運(yùn)是氮代謝的一個(gè)關(guān)鍵過程，而銨的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)由特定的銨轉(zhuǎn)運(yùn)體完成［21］。為了進(jìn)一步了解空心蓮子草銨吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的分子基礎(chǔ)，本研究利用RACE技術(shù)成功獲得了空心蓮子草Ap AMT1；3 的全長(zhǎng)c DNA 序列（GenBank Accession No.JQ917908），克隆過程如圖1所示，具體描述見1.3。

2.2 Ap AMT1；3 基因的特征分析

Ap AMT1；3 基因CDS大小為1 389 bp，蛋白分子質(zhì)量為50.00 k D，跨膜預(yù)測(cè)軟件T MH MM 和H MMTOP分析表明，Ap A MT1；3 有11個(gè)跨膜區(qū)（圖2），和已經(jīng)報(bào)道的A MT1 型的銨轉(zhuǎn)運(yùn)體類似［15，21，27］。進(jìn)化 樹 分 析 表 明，Ap A MT1；3 屬 于 植物A MT1 家族的成員，在進(jìn)化關(guān)系上與番茄Le AMT1；3 緊密聚類在一起（圖3），預(yù)示其具有相似的基因功能或表達(dá)模式。基因結(jié)構(gòu)克隆結(jié)果表明，Ap AMT1；3 的基因組序列中沒有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，這和除百脈根Lj AMT1；1［11］以外的其他的AMT1型家族成員的情況一致。

2.3 Ap AMT1；3 的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果表明，Ap A MT1；3 主要在地上部表達(dá)（圖4），在莖和葉中的表達(dá)豐度明顯高于根中的表達(dá)豐度。AMT1 基因的表達(dá)豐度與植物的氮素營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)密切相關(guān)，在缺銨條件下，無論在地上部還是地下部，Ap AMT1；3 的表達(dá)豐度都大大增強(qiáng)（圖4B），表明銨饑餓大大增強(qiáng)了Ap A MT1；3在整個(gè)植株體內(nèi)的表達(dá)豐度。

2.4 Ap AMT1；3 的酵母功能鑒定

酵母菌株31019b 能夠在小于5 mmol·L－1作為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)［28］。重組p YES2－Ap AMT1；3／31019b菌株和轉(zhuǎn)化空載體的菌株p YES2／31019b都能夠在酵母選擇性培養(yǎng)基（0.17%YNB＋2 mmol·L－1精氨酸＋2% D－半乳糖＋2%瓊脂）上正常生長(zhǎng)（圖5 A），而在2 mmol·L－1NH4Cl為唯一氮源、p H 為5.8的篩選培養(yǎng)基（0.17% YNB＋2%D－半乳糖＋2%瓊脂）上，只有重組菌株p YES2－Ap AMT1；3／31019b能夠恢復(fù)生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化空載體的菌株不能生長(zhǎng)（圖5B），表明Ap AMT1；3 具有吸收銨的功能，能夠介導(dǎo)銨的吸收。

圖2 已報(bào)道植物Ap AMT1；3的氨基酸比對(duì)及跨膜區(qū)分析Fig.2 Tr ansmembrane domain analysis of Ap AMT1；3

3 討論與結(jié)論

空心蓮子草，通稱水花生，莧科（Amarant haceae）蓮子草屬（Alter nanther a）多年生宿根草本植物，是一種外來雜草，生長(zhǎng)迅速、抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)于水生和陸生環(huán)境［28］。雖然對(duì)生態(tài)環(huán)境有負(fù)面影響，然而，由于空心蓮子草在飼料、綠肥、中藥、食用菌培養(yǎng)料有著重要的利用價(jià)值［29－30］及其超強(qiáng)的富鉀能力而受到重視［31］。研究報(bào)道，空心蓮子草種植對(duì)污水中N、P 和Cl等有較好的凈化效果，也能有效降低COD，對(duì)懸浮物也有一定去除效果［32］。是水體中要的N 素存在形式［33］，為了深入研究空心蓮子草在修復(fù)N 污染水體方面的潛力，本研究通過RACE技術(shù)從空心蓮子草中成功克隆了一個(gè)銨轉(zhuǎn)運(yùn)體（圖1D），具有11 個(gè)跨膜區(qū)（圖2），且不含內(nèi)含子。進(jìn)化樹分析表明，該銨轉(zhuǎn)運(yùn)體歸類于A MT1亞家族，命名為Ap A MT1；3（圖3）。酵母功能互補(bǔ)研究表明，Ap AMT1；3 能夠介導(dǎo)銨的吸收（圖5B）。

已有報(bào)道表明，擬南芥的At AMT1；3，番茄的LeAMT1；1 及LeAMT1；2 主 要 定 位 在 根 部［6，11－12］。而Ap AMT1；3 主要在地上部表達(dá)（圖4 A），與番茄的Le AMT1；3 及 百 脈 根 的Lj AMT1；1－1；3 類似［12－13，21］，這種相似的表達(dá)模式也反映出其與在進(jìn)化關(guān)系上與番茄Le AMT1；3 聚類密切（圖3）。Ap AMT1；3也存在于根部，表明除具有銨吸收功能以外，可能還具有將銨從地下部運(yùn)至地上部調(diào)配體內(nèi)銨的能力及運(yùn)輸光呼吸產(chǎn)生的NH3的能力。A MT1家族基因的轉(zhuǎn)錄水平與植物的氮素營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)緊密相關(guān)，銨饑餓極大增強(qiáng)了Ap A MT1；3在整個(gè)植株體內(nèi)的表達(dá)水平（圖4B），這有可能是空心蓮子草在氮素營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下產(chǎn)生“饑餓響應(yīng)”以適應(yīng)內(nèi)部代謝機(jī)制的一個(gè)線索，與擬南芥、百脈根等有著類似的響應(yīng)模式［12，20－21］。

圖3 Ap AMT1；3與其他植物AMT1家族成員的進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis bet ween Ap AMT1；3 and other AMT1 f amily members f ound in plants

圖4 Ap AMT1；3 的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of Ap AMT1；3

圖5 Ap AMT1；3 的酵母功能互補(bǔ)驗(yàn)證Fig.5 Yeast functional complementation test of Ap AMT1；3

本研究為分析空心蓮子草NH4＋的吸收和利用提供了新的基因資源，將有助于進(jìn)一步了解水生植物的銨吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，也為富營(yíng)養(yǎng)化水體的植物修復(fù)提供一些分子層面的理論支持。

［1］ Aerts R，Chapin F S.The mineral nutrition of wild plants revisited：A re－evaluation of processes and patter ns［J］.Advances in Ecological Research，1999，30：1－67.

［2］ Ludewig U，Neuhauser B，Dynowski M.Molecular mechanisms of ammoniu m transport and accu mulation in plants［J］.FEBS Letters Plant Transporters and Channels，2007，581：2301－2308.

［3］ Bloom A J，Sukrapanna S S，Warner R L.Root respiration associated with ammonium and nitrate absorption and assi milation by barley［J］.Plant Physiology，1992，99：1294－13011.

［4］ Kronzucker H J，Siddiqi M Y，Glass A D M.Root discri mination against soil nitrate and the ecology of forest succession［J］.Nature，1997，385：59－61.

［5］ Dortch Q.The interaction bet ween ammoniu m and nitrate uptake in phytoplankton［J］.Marine Ecology Progress Series，1990，61：183－202.

［6］ Gazzarrini S，Lejay L，Gojon A，Ninnemann O，F(xiàn)ro mmer W B.Three f unctional transporters f or constitutive，diur nally regulated and starvation－induced uptake of ammoniu m into Ar abidopsis roots［J］.Plant Cell，1999，11：937－947.

［7］ Britto D T，Kronzucker H J.NH4＋toxicity in higher plants：A critical review［J］.Jour nal of Plant Physiology，2002，159：567－584.

［8］ Guether M，Neuh?user B，Balestrini R，Dynowski M，Ludewig U，Bonfante P.A mycorrhizal－specific ammonium transporter from Lotus j aponicus acquires nitrogen released by arbuscular mycorrhizal fungi［J］.Plant Physiology，2009，150：73－83.

［9］ Ninnemann O，Jauniaux J C，F(xiàn)ro mmer W B.Identification of a high affinity NH4＋transporter fro m plants［J］.The EMBO Jour nal，1994，13：3464－3471.

［10］ Pearson J N，F(xiàn)innemann J，Schjoerring J K.Regulation of the high－affinity ammoniu m transporter（Bn AMT1；2）in the leaves of Br assica napus by nitrogen status［J］.Plant Molecular Biology，2002，49：483－490.

［11］ Salvemini F，Marini A M，Riccio A，Patriarca E J，Chiurazzi M.Functional characterization of an ammonium transporter gene fro m Lotus j aponicus［J］.Gene，2001，270：237－243.

［12］ D’Apuzzo E，Rogato A，Si mon－Rosin U，El Alaoui H，Barbulova A，Betti M，Di mou M，Katinakis P，Marquez A，Marini A M，Udvardi M K，Chiurazzi M.Characterization of three f unctional high－affinity ammoniu m transporters in Lotus j aponicus with differential transcriptional regulation and spatial expression［J］.Plant Physiology，2004，134：1763－1774.

［13］ Lauter F R，Ninnemann O，Bucher M，Ries meier J W，F(xiàn)rommer W B.Preferential expression of an ammonium transporter and of t wo putative nitrate transporters in root hairs of tomato［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93：8139－8144.

［14］ Ludewig U，von Wiren N，F(xiàn)ro mmer W B.Uniport of NH4＋by the root hair plasma membrane ammoniu m transporter Le AMT1；1［J］.The Journal of Biological Chemistry，2002，277：13548－13555.

［15］ Couturier J，Montanini B，Martin F，Brun A，Blaudez D，Chalot M.The expanded family of ammonium transporters in the perennial poplar plant［J］.New Phytologist，2007，174：137－150.

［16］ Sonoda Y，Ikeda A，Saiki S，von Wirén N，Yamaya T，Yamaguchi J.Distinct expression and f unction of three ammoniu m transporter genes（Os AMT1；1－1；3）in rice［J］.Plant Cell Physiology，2003，44：726－734.

［17］ Suenaga A，Moriya K，Sonoda Y，Ikeda A，von Wiren N，Hayakawa T，Yamaguchi J，Ya maya T.Constitutive expression of a novel－type ammoniu m transporter Os A MT2 in rice plants［J］.Plant Cell Physiology，2003，44：206－211.

［18］ Yuan L，Graff L，LoquéD，Koji ma S，Tsuchiya Y N，Takahashi H，von Wirén N.At A MT1；4，a pollen－specific high－affinity ammonium transporter of the plasma membrane in Ar abidopsis［J］.Plant Cell Physiology，2009，50（1）：13－25.

［19］ Gansel X，Munos S，Tillard P and Gojon A.Differential regulation of the NO3－and NH4＋transporter genes At Nrt2；1 and At Amt1；1 in Ar abidopsis：Relation with long distance and local controls by N status of t he plant［J］.Plant Jour nal，2001，26：143－155.

［20］ Yuan L，LoquéD，Koji ma S，Rauch S，Ishiyama K，Inoue E，Takahashi H and von Wirén N.The organization of high－affinity ammoniu m uptake in Ar abidopsis r oots depends on t he spatial arrangement and biochemical properties of A MT1－type transporters［J］.Plant Cell，2007，19：2636－2652.

［21］ von Wirén N，Gazzarini S，Gojon A，F(xiàn)or mmer W B.The molecular physiology of ammonium uptake and retrieval［J］.Current Opinion in Plant Biology，2000（3）：254－261.

［22］ Song Z Z，Su Y H.Distinctive potassiu m－accu mulation capability of alligator weed（Alter nanther a philoxer oides）links to high－affinity potassiu m transport facilitated by K＋－uptake systems［J］.Weed Science，2013，61：77－84.

［23］ Murashige T，Skoog F.A revised mediu m for the rapid growth and bioassays with tobacco cultures［J］.Physiologia plantarum，1962，15：473－497.

［24］ Sambrook J，Russell D W.Molecular Cloning：A Laboratory Manual［M］.3r d ed.Cold Spring Har bor，NY，USA：Cold Spring Har bor Laboratory，2001.

［25］ Marini A M，Soussi－Boudekou S，Vissers S，Andre B.A family of ammonium transporters in Saccharomyces cerevisiae［J］.Molecular and Cellular Biology，1997，17：4282－4293.

［26］ LoquéD，Mora S I，Andrade S L A，Pantoja O，F(xiàn)ro mmer W B.Pore mutations in ammoniu m transporter A MT1 with increased electrogenic ammoniu m transport activity［J］.The Jour nal of Biological Chemistr y，2009，284（37）：24988－24995.

［27］ Schwacke R，Schneider A，van der Graaff E，F(xiàn)ischer K，Catoni E，Desi mone M，F(xiàn)rommer W B，F(xiàn)lugge U I，Kunze R.ARA MEMNON，a novel database f or Ar abidopsis integr al membrane proteins［J］.Plant Physiology，2003，131：16－26.

［28］ 婁遠(yuǎn)來，鄧淵鈺，沈紀(jì)冬，李亞浩.我國(guó)空心蓮子草的研究現(xiàn)狀［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（4）：46－48.

［29］ 陳振武，沈武孝.空心蓮子草治療帶狀皰疹50例［J］.江西中醫(yī)藥（增刊），1994，25：16－17.

［30］ 肖紅，楊占秋，文莉.空心蓮子草口服治療乳鼠流行性出血熱病毒感染的研究［J］.中國(guó)病毒學(xué)，1996，11（4）：348－351.

［31］ 胡篤敬，楊敏元，劉國(guó)華.高鉀植物研究［J］.湖南農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1980（4）：5－13.

［32］ 龐金華，沈瑞芝，程平宏.三種植物對(duì)COD 的耐受極限與凈化效果［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，1997，16（5）：209－213.

［33］ Xie Y X，Xiong Z Q，Xing G X，Sun G Q，Zhu Z L.Assessment of nitrogen pollutant sources in surface waters of Taihu Lake region［J］.Pedosphere，2007，17：200－208.