植物毛狀根的誘導(dǎo)及應(yīng)用

王成龍，周美亮，邵繼榮，吳燕民

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安625001）

發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacteriu m r hizogenes）是一種根瘤菌科的革蘭氏陰性菌。其侵染植物后，會(huì)使植物產(chǎn)生大量的不定根，這些不定根不斷分支，表現(xiàn)出毛狀，稱之為毛狀根（Hair y Roots）［1］，具有生長迅速、生長周期短、無向地性、多分支且根毛生長旺盛的特點(diǎn)。毛狀根在培養(yǎng)過程中，不需添加任何外源激素即可大量增殖，且產(chǎn)出的毛狀根遺傳性穩(wěn)定，有效成分含量高，生化特性不易改變［2］?；诿珷罡陨淼奶攸c(diǎn)，若以牧草為受體，利用發(fā)根農(nóng)桿菌對現(xiàn)有牧草品種進(jìn)行改良，進(jìn)而可以培育出更加優(yōu)良的品種，對于牧草新品種的創(chuàng)制以及草業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展都有著有極為重要的意義。

1 植物毛狀根的誘導(dǎo)

1.1 毛狀根的特點(diǎn)

相較于其他植物組織，毛狀根主要具備以下幾方面的特點(diǎn)：1）毛狀根可以在無激素的培養(yǎng)基上正常生長。發(fā)根農(nóng)桿菌含有Ri質(zhì)粒，其感染植物傷口后，會(huì)促使傷口處細(xì)胞合成特殊的酚類小分子化合物，進(jìn)而誘導(dǎo)Ri質(zhì)粒的Vir 區(qū)基因活化。從而將Ri質(zhì)粒上的T－DNA 區(qū)整合到植物基因組中。T－DNA上含有合成激素的相關(guān)基因，當(dāng)其整合到植物的基因組并進(jìn)行表達(dá)后，植物細(xì)胞本身的激素代謝平衡被打破，最終使得毛狀根可以在無激素的培養(yǎng)基上正常生長；2）毛狀根具有極強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性。與根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物所不同的是，利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物不會(huì)產(chǎn)生嵌合體。通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根均來源于單一的植物細(xì)胞，含有與親本完全相同的一套染色體，這樣就保證了其在遺傳方面的穩(wěn)定性［3］；3）毛狀根生長迅速且次生代謝產(chǎn)物合成旺盛。植物次生代謝產(chǎn)物的積累與細(xì)胞的分化速度密切相關(guān)，由于毛狀根的數(shù)量按指數(shù)模式增長，所以毛狀根生長速度很快，生物量倍增所需時(shí)間較短，故而其次生代謝產(chǎn)物的合成也相當(dāng)旺盛；4）發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)毛狀根的植物多為雙子葉植物，單子葉植物被誘導(dǎo)形成毛狀根的報(bào)道還為數(shù)不多。已成功誘導(dǎo)出毛狀根的單子葉植物仍都處于實(shí)驗(yàn)室理論研究，實(shí)踐應(yīng)用還不廣泛，還需要進(jìn)行深入的研究。但是，通過根瘤農(nóng)桿菌侵染的單子葉植物已涵蓋鳶尾科、禾本科等單子葉植物［4－8］。目前，發(fā)根農(nóng)桿菌已經(jīng)在玉米（Zea mays）、水稻（Or yza sativa）等單子葉植物上成功誘導(dǎo)出毛狀根［9－12］。同時(shí)，百脈根（Lotus cor nicul atus）、紫花苜蓿（Medicago sativa）等豆科牧草更是實(shí)現(xiàn)了由發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化［13－14］。這些研究成果的取得也從分子水平上證明了單子葉植物可以作為農(nóng)桿菌侵染的受體，進(jìn)而可以為發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)單子葉植物毛狀根的產(chǎn)生奠定堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

1.2 毛狀根誘導(dǎo)的機(jī)理

1.2.1 發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒 發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根的分子機(jī)理與之含有的Ri質(zhì)粒有著密切的關(guān)系。Ri質(zhì)粒主要 由Ori 區(qū)Vir區(qū)和T－DNA區(qū)三部分組成。發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根是一個(gè)復(fù)雜的過程，是三部分基因共同作用的結(jié)果。

Ri質(zhì)粒Vir 區(qū)基因負(fù)責(zé)接收外界信號(hào)，在T－DNA的剪切和轉(zhuǎn)移過程中扮演著極為重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)，Vir 區(qū)位于復(fù)制起點(diǎn)和T－DNA 區(qū)之間大約20 kb，具有很高的保守性，并與Ti質(zhì)粒的Vir 區(qū)同源。其包含有Vir A、Vir B、Vir C、Vir D、Vir E、Vir F、Vir G 7個(gè)基因，起共調(diào)控作用［15－16］。

發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T－DNA 區(qū)則包含兩類基因，分別是為其提供營養(yǎng)來源的冠癭堿合成基因以及決定致病表型的Rol基因群。根據(jù)其冠癭堿合成基因的不同，可將發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒分為4種類型，分別是甘露堿型、黃瓜堿型、農(nóng)桿堿型以及異黃瓜堿型。其中，農(nóng)桿堿型菌株由于其較強(qiáng)的誘導(dǎo)能力，使其比其他類型的發(fā)根農(nóng)桿菌有更為廣泛的宿主范圍，可以用于誘導(dǎo)大多數(shù)的植物材料產(chǎn)生毛狀根［17－20］。

農(nóng)桿堿型發(fā)根農(nóng)桿菌的T－DNA 區(qū)域是不連續(xù)的，分TL－DNA 和TR－DNA 兩部分。TL－DNA 上含有與根的形態(tài)發(fā)生及再生植株某些形態(tài)特征有關(guān)的Rol基因群，其通過改變激素平衡或改變細(xì)胞對生長素及細(xì)胞分裂素的敏感性而影響毛狀根的發(fā)生。在某些情況下，Rol基因的催化效果甚至可以完全調(diào)控植物細(xì)胞產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物。其中Rol B 最為重要，Rol A 基因產(chǎn)物在植物細(xì)胞次生代謝中起刺激作用，Rol C 在植物次生代謝中較為穩(wěn)定，其主要作用是促進(jìn)次級(jí)代謝通路的激活［21－23］。TR－DNA 上帶有農(nóng)桿堿合成酶基因（Ags）和生長素合成酶基因（t ms－1 和t ms－2），后者指導(dǎo)IAA的合成，負(fù)責(zé)為植物細(xì)胞提供生根所必須的植物激素，因此，誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根是激素自養(yǎng)型的。

然而，甘露堿型和黃瓜堿性的T－DNA 區(qū)域是連續(xù)的，與農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒的TR－DNA 沒有明顯的同源性，但具有與TL－DNA 高度同源的片斷。其區(qū)域中不含生長素合成相關(guān)基因。因此，此類發(fā)根農(nóng)桿菌不能誘導(dǎo)毛狀根的形成［24］。

1.2.2 毛狀根誘導(dǎo)的分子機(jī)制 首先，發(fā)根農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，會(huì)停留于細(xì)胞間隙。之后，農(nóng)桿菌會(huì)促進(jìn)受傷的植物組織經(jīng)莽草酸合成途徑產(chǎn)生乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮等可溶性小分子酚類化合物，這些小分子酚類化合物將作為信號(hào)分子，促進(jìn)農(nóng)桿菌向植物組織的轉(zhuǎn)移［25］。同時(shí)，這些信號(hào)分子在Vir A 基因產(chǎn)物（一種結(jié)合在膜上的受體蛋白）的介導(dǎo)下，使得Vir G 蛋白的磷酸化結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而激活其他Vir 區(qū)基因，促使T－DNA 的復(fù)制T－鏈蛋白復(fù)合體的形成。而后，T－鏈蛋白復(fù)合體在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助下通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，最終進(jìn)入植物細(xì)胞核，將T－DNA 整合進(jìn)植物的基因組之中，并在植物中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，使植物在傷口附近生長出毛狀根［26］。

2 毛狀根的應(yīng)用

由于毛狀根具有生長迅速、遺傳穩(wěn)定以及次生代謝產(chǎn)物合成旺盛等特點(diǎn)。故而，毛狀根常被用于作物品種改良，次生代謝物的生產(chǎn)以及環(huán)境污染的修復(fù)等諸多方面。

2.1 毛狀根用于作物品種改良

通過基因工程技術(shù)將外源基因?qū)朊珷罡?，之后利用植物再生的方法獲得轉(zhuǎn)基因植株，從而可以實(shí)現(xiàn)對作物品種的改良，培育出具有優(yōu)良性狀的作物新品種。利用轉(zhuǎn)基因毛狀根實(shí)現(xiàn)植物的再生與培養(yǎng)條件密切相關(guān)，其可以通過加入適當(dāng)?shù)闹参锛に貋韺?shí)現(xiàn)經(jīng)由體細(xì)胞胚胎途徑的再生［27－28］。

2.1.1 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的方法 目前，借助發(fā)根農(nóng)桿菌將外源基因轉(zhuǎn)移到目標(biāo)植物體上，主要有以下幾種方法：1）直接接種法：直接將已活化好的菌液通過注射的方法接種到植物幼苗的莖尖或莖稈上，在一段時(shí)間的培養(yǎng)后，注射處就可以觀察到毛狀根的產(chǎn)生。根據(jù)菌株的種類，寄主的生理狀態(tài)以及培養(yǎng)條件的不同，誘導(dǎo)出毛狀根的時(shí)間也不近相同，通常在侵染后的2～4周會(huì)觀察到毛狀根的出現(xiàn)。2）外植體接種法：外植體接種法是目前應(yīng)用較多的方法，因發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)毛狀根的遺傳轉(zhuǎn)化與根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化機(jī)理相似，故而其被多數(shù)學(xué)者應(yīng)用到試驗(yàn)之中［29］。外植體接種法主要是利用宿主植物的子葉、下胚軸、幼嫩的莖等部位作為外植體，之后將其浸泡在發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，再經(jīng)過共培養(yǎng)、抗性篩選等步驟，最后得到脫菌的轉(zhuǎn)基因毛狀根［30］。3）原生質(zhì)體共培養(yǎng)法：原生質(zhì)體共培養(yǎng)法則是利用無壁或處于壁再生階段的原生質(zhì)體對農(nóng)桿菌的敏感性來達(dá)到遺傳轉(zhuǎn)化的目的。該法首先通過原生質(zhì)體與發(fā)根農(nóng)桿菌混合培養(yǎng)，經(jīng)歷抗性篩選，得到轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，之后通過再生植株的培養(yǎng)，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)化的再生植株。但是，此方法只適合于原生質(zhì)體再生效率較高的植物種類，故與前兩者相比，存在一定的局限性。

2.1.2 利用發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行作物品種改良的優(yōu)勢及成果 相對于傳統(tǒng)的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的毛狀根進(jìn)行作物品種改良具有一定的優(yōu)越性。首先，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，為了不影響植物的再生，人們通常會(huì)去除其Ti質(zhì)粒中T－DNA 區(qū)的癌基因，即所謂的“解除武裝”。而利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的毛狀根進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，無需“解除武裝”，這便使得轉(zhuǎn)化后的陽性細(xì)胞更易產(chǎn)生再生植株。其次，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化可能產(chǎn)生“嵌合體”，但發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根均來源于同一細(xì)胞，不會(huì)產(chǎn)生“嵌合體”，得到的陽性轉(zhuǎn)基因毛狀根分化率高、倍性穩(wěn)定、增長迅速。

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，已有包括煙草（Nicotiana tabacu m）、咖啡（Cof f ea）、苜蓿、豌豆（Pisu m sativu m）在內(nèi)的多種植物，成功實(shí)現(xiàn)了通過毛狀根誘導(dǎo)出再生植株，但培養(yǎng)條件因物種而異［31－36］。同時(shí)，科研人員還發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)基因毛狀根獲得的再生植株通常還表現(xiàn)出許多可遺傳的變異性狀，如植株矮化，節(jié)間縮短，花型葉型改變等［37－41］。若將這一特性利用于景觀花卉植物的育種中，將會(huì)有很高的應(yīng)用前景。并且，通過轉(zhuǎn)基因毛狀根獲得的再生植株還會(huì)表現(xiàn)出根系發(fā)達(dá)且須根生長旺盛等特點(diǎn)。若將這一特性應(yīng)用于抗旱植物的培育中，同樣會(huì)有很好的應(yīng)用前景。

2.2 利用毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物

眾所周知，植物中含有大量對人類有益的化學(xué)成分，諸如多酚、多糖、萜類、黃酮、生物堿等。通常，親本植株能合成的次生代謝物均可利用毛狀根來生產(chǎn)，且次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量往往高于植物自身所能合成的量［42－43］。因而，這是一條利用生物技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的有效途徑。植物毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)為生產(chǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、植物中含量低、自然資源缺乏的次生代謝物提供了一條新的方法，具有很高的應(yīng)用前景（表1）。

2.2.1 毛狀根生產(chǎn)次生代謝物的優(yōu)勢 利用植物毛狀根進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)具有其他傳統(tǒng)方法難以比擬的優(yōu)勢。傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)方法不僅生產(chǎn)周期長，產(chǎn)量不穩(wěn)定，而且還要受到生產(chǎn)環(huán)境、病蟲害等多種因素的影響，很難獲得預(yù)期的產(chǎn)量。同時(shí)，傳統(tǒng)的植物細(xì)胞培養(yǎng)方法也存在一定的不足，常會(huì)遇到諸如細(xì)胞生長緩慢，需要添加激素維持等問題，同時(shí)其次生代謝物的產(chǎn)量有限，生產(chǎn)能力也不穩(wěn)定。但是，毛狀根體系卻具有生長迅速、遺傳穩(wěn)定以及次生代謝產(chǎn)物合成旺盛等優(yōu)點(diǎn)，這是工業(yè)化生產(chǎn)所夢寐以求的。

表1 植物毛狀根用于次生代謝物的生產(chǎn)Table 1 Plants hairy roots for the production of secondary metabolites

2.2.2 毛狀根生產(chǎn)次生代謝物的成果 Moyano等［44］科研人員，利用發(fā)根農(nóng)桿菌將煙草的腐胺N－二甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）基因轉(zhuǎn)入曼陀羅（Datur a str amoniu m）和天仙子（Hyoscyamus niger）毛狀根之中，催化莨菪烷生物堿合成通路中的首個(gè)關(guān)鍵步驟，進(jìn)而通過轉(zhuǎn)基因毛狀根的生長以達(dá)到托烷類生物堿的大量積累。迄今為止，通過毛狀根可以培養(yǎng)生產(chǎn)出的次生代謝產(chǎn)物已涵蓋生物堿類、甙類、黃酮類、醌類、多糖類等多種物質(zhì)。同時(shí)，已有包括喜樹堿、銀杏酚、葛根素、類黃酮在內(nèi)的幾十種重要醫(yī)藥用成分實(shí)現(xiàn)了通過毛狀根來生產(chǎn)［45－47］。而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，紫草（Lithosper mu m canescens）、長春花（Cathar anthus roseus）、甜菜（Beta vul garis）等植物更是實(shí)現(xiàn)了毛狀根生產(chǎn)的工業(yè)化［48－50］。

2.3 植物毛狀根用于環(huán)境修復(fù)

2.3.1 毛狀根用于環(huán)境修復(fù)的可行性 對于污染物的去除，傳統(tǒng)方法都存在一定的缺點(diǎn)，如效率低，成本高，有些還會(huì)產(chǎn)生有毒的副產(chǎn)品，而植物修復(fù)技術(shù)則主要是利用植物來清理受污染的土壤和水［51］。近年來，利用植物根系修復(fù)污染的土壤和地下水，越來越受到人們的關(guān)注。其基本的吸收機(jī)制是通過毛狀根廣泛的接觸面積來吸收有毒的物質(zhì)并進(jìn)行分解。通過分析不同的生物系統(tǒng)對污染環(huán)境的修復(fù)，學(xué)者們認(rèn)為，毛狀根體系在環(huán)境修復(fù)方面具有很高的研究價(jià)值和應(yīng)用前景［52］。由于毛狀根與植物根系本身有很大的生化相似性，而且其環(huán)境兼容性強(qiáng)，生產(chǎn)成本低，可以被多次利用，故而毛狀根應(yīng)用于環(huán)境修復(fù)已被人們廣泛認(rèn)可（表2）。

2.3.2 毛狀根用于污水治理 酚類物質(zhì)作為一類主要的化學(xué)污染物，具有高毒性和致癌性，是一種對人體和動(dòng)物都極為有害的物質(zhì)。為了去除污水中的這一有害物質(zhì)，人們進(jìn)行了許多的嘗試。目前，酚類物質(zhì)的去除主要是利用溶劑萃取，活性炭吸附，化學(xué)氧化和微生物降解。煙草的轉(zhuǎn)基因毛狀根對苯酚具有極大的耐受性，可以用于污水中苯酚污染的去除［53］。有文獻(xiàn)報(bào)道，誘導(dǎo)產(chǎn)生的胡蘿卜（Daucus car ota）毛狀根能夠在120 h之內(nèi)去除施加于培養(yǎng)基中90%以上的外源酚類物質(zhì)［54］。Coniglio等［55］研究發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)的去除源于毛狀根中過氧化物酶的作用。同時(shí)，在酚為底物的甘藍(lán)型油菜（Br assica napus）毛狀根中，中性和堿性過氧化物酶相比酸性過氧化物酶表現(xiàn)出較高的親和力和催化效率［55］。油菜和番茄（Lycopersicon esculentu m）的毛狀根已經(jīng)被用于去除水中的酚類污染物，其最高去除效率分別可達(dá)到95%和70%。油菜的毛狀根可以高效的去除污水中的污染物，在250 mg·L－1的酚類污染液中去除效率可達(dá)80%［56］。煙草毛狀根可以在短時(shí)間內(nèi)高效去除其培養(yǎng)環(huán)境中的2，4－二氯酚，在2，4－二氯酚初始濃度為250 mg·L－1的培養(yǎng)基中，其去除效率可以達(dá)到98%，在培養(yǎng)環(huán)境中添加10 mg·L－1過氧化氫，作用時(shí)間60 min，可以達(dá)到最高的去除效率［57］。同時(shí)，歐洲油菜的毛狀根也可以清除廢水中的2，4－二氯酚，其清除效率更高，清除培養(yǎng)基中98%的2，4－二氯酚僅需30 min［58］。

表2 植物毛狀根用于修復(fù)污染Table 2 Examples of plant hair y roots used to remediate pollutants

2.3.3 毛狀根用于重金屬污染的治理 由于重金屬污染物不能被生物或化學(xué)降解，而且易在食物鏈中傳遞，最終危害人類，故重金屬污染的治理刻不容緩［59］。研究發(fā)現(xiàn)，利用轉(zhuǎn)基因毛狀根對重金屬的富集作用，可以較好的完成對重金屬污染的治理。天藍(lán)遏藍(lán)菜（Thl aspi caer ulescens）是一種公認(rèn)的超富集植物，相同的鎘濃度下，天藍(lán)遏藍(lán)菜毛狀根對于鎘的吸附水平是非超富集植物毛狀根的1.7倍。其毛狀根可以在最大鎘濃度為890μmol·L－1的濃度下生長，而非超富集植物毛狀根在濃度為178 μmol·L－1下便不能生存［60］。

2.3.4 毛狀根用于其他污染物的治理 利用毛狀根進(jìn)行環(huán)境修復(fù)是一種廉價(jià)和環(huán)保的技術(shù)，其同樣可以用于其他污染物的處理。向日葵（Helianthus annuus）毛狀根可以在其自身相關(guān)酶的催化下，迅速消除水溶液中的四環(huán)素和土霉素，這表明向日葵毛狀根具有修復(fù)這兩種抗生素污染的潛力［61］。芥菜（Br assica j uncea）的毛狀根具有吸收和降解DDT的能力，在利用含有C14的DDT 處理24 h后，培養(yǎng)基中僅檢測到總施加量12%～13%的放射性，這表明DDT 被毛狀根有效吸收［62］。

2.4 植物毛狀根生產(chǎn)外源蛋白

與傳統(tǒng)生產(chǎn)手段相比，利用毛狀根生產(chǎn)外源蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn)：毛狀根在密閉的環(huán)境中培養(yǎng)，這就避免了外源基因和活性蛋白在環(huán)境中的傳播；同時(shí)，其在受控的條件下生長，這就避免了產(chǎn)生的蛋白質(zhì)對外界環(huán)境的污染。

早先，Sunil等［63］報(bào)道了利用馬鈴薯（Sol anum tuber osu m）毛狀根表達(dá)乙肝表面抗原（HBs Ag），其乙肝表面抗原產(chǎn)量超過整個(gè)馬鈴薯植株的9倍，在毛狀根鮮重中高達(dá)97.1 ng·g－1。Woods等［64］報(bào)道，在本式煙（Nicotiana tabacu m）毛狀根中轉(zhuǎn)入人類乙酰膽堿酯酶基因，產(chǎn)生的乙酰膽堿酯酶占總可溶性蛋白的3.3%，大約是親本中表達(dá)水平的3倍。還有報(bào)道稱在煙草毛狀根中可以表達(dá)人類表皮生長因子（h EGF），其含量達(dá)2μg·g－1。目前，經(jīng)過研究更是實(shí)現(xiàn)了小鼠免疫球蛋白在煙草毛狀根中的表達(dá)［65－67］。

2.5 為根系相關(guān)理論研究提供素材

由于某些次生代謝與根的形態(tài)分化有關(guān)，而毛狀根具有多分支且根毛生長旺盛的特點(diǎn)，故其可以作為植物根系相關(guān)理論研究以及某些次生代謝物生物合成途徑研究的理想材料。例如，在研究植物次生代謝途徑方面，科研工作者可以通過對毛狀根進(jìn)行不同激素及不同環(huán)境條件等方面的脅迫處理，從而對次生代謝產(chǎn)物合成途徑及其關(guān)鍵酶的表達(dá)進(jìn)行分析，進(jìn)而揭示出相關(guān)的代謝機(jī)理。Ca macho等［68］在研究腐胺的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)其在煙草毛狀根中的代謝過程涉及到一種名為精氨酸脫羧酶的關(guān)鍵酶，但精氨酸脫羧酶介導(dǎo)的腐胺合成途徑并非像以往學(xué)者所認(rèn)為的那樣，在代謝中優(yōu)先合成煙堿。

同時(shí)，毛狀根也可以作為研究植物根部相關(guān)病蟲害的理想材料。2007年，Qu和Christ［69］首次利用馬鈴薯毛狀根接種病源微生物粉痂菌（Spongospor a subterr anea），從而對馬鈴薯粉痂病病源微生物的寄生特性進(jìn)行研究。Wubben 等［70］利用棉花毛狀根為試驗(yàn)材料，進(jìn)行了抗線蟲棉花品種在抗蟲機(jī)理方面的研究。

3 問題與展望

3.1 植物毛狀根誘導(dǎo)的現(xiàn)存問題

現(xiàn)今，植物毛狀根由于其自身的優(yōu)點(diǎn)，越來越受到科研工作者的關(guān)注。與此同時(shí)，其自身也存在著一些潛在的問題仍需要引起人們的注意。1）在利用毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的過程中，近緣植物毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的積累模式不近相同。Moyano等［44］在研究中發(fā)現(xiàn)，莨菪烷生物堿含量都隨著曼陀羅和埃及莨菪（Hyoscyamus muticus）毛狀根的增長而增加，然而在曼陀羅的毛狀根中莨菪堿和東莨菪堿都有一定量的積累，而在埃及莨菪毛狀根中只有莨菪堿水平的增加。這一結(jié)果表明，在兩個(gè)相關(guān)物種的同一代謝通路中其調(diào)控也存在著一定的差異。2）發(fā)根農(nóng)桿菌所侵染的宿主基因型也可能影響導(dǎo)入基因的表達(dá)。例如在（S33和S50）兩種基因型的百脈根毛狀根中，其單寧生物合成量都趨于下降，而在另一種基因型（S41）的百脈根毛狀根中，其單寧含量卻大幅增加［71］。3）次級(jí)代謝通路中關(guān)鍵酶的過表達(dá)也并非都會(huì)引起次級(jí)代謝產(chǎn)物的增加。例如，將兩個(gè)紫草素合成關(guān)鍵酶基因?qū)氲阶喜菝珷罡?。結(jié)果表明，即使在兩種關(guān)鍵酶高表達(dá)的情況下，紫草素的含量也未見明顯增加［49］。同時(shí)，在毛狀根的繼代培養(yǎng)中還可能會(huì)出現(xiàn)染色體減少的現(xiàn)象［72］。4）單子葉植物成功誘導(dǎo)毛狀根的例子還較少。這主要是因?yàn)?，單子葉植物本身并不是發(fā)根農(nóng)桿菌的天然宿主。同時(shí)，刺激發(fā)根農(nóng)桿菌Vir 基因信號(hào)分子介導(dǎo)的酚類物質(zhì)不能在單子葉植物微管系統(tǒng)內(nèi)運(yùn)輸，其僅能在特定的發(fā)育時(shí)期和特定部位的細(xì)胞中產(chǎn)生，進(jìn)而影響了毛狀根的誘導(dǎo)［73］；另一方面，不同生理狀態(tài)下的細(xì)胞對農(nóng)桿菌的敏感性也存著差異。有些禾本科的單子葉植物，其薄壁細(xì)胞在發(fā)育旺盛期便失去了分化能力，且受傷區(qū)域周圍細(xì)胞木質(zhì)化程度較高，這便使得其處于感受態(tài)的細(xì)胞較少，從而阻礙了發(fā)根農(nóng)桿菌對毛狀根的誘導(dǎo)［72］。

3.2 植物毛狀根的發(fā)展前景

首先，應(yīng)進(jìn)一步明確毛狀根的次級(jí)代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制。植物次級(jí)代謝物的合成途徑非常復(fù)雜，往往有幾個(gè)甚至十幾個(gè)酶參與。故而，使用一些相關(guān)的新技術(shù)，例如：反向遺傳學(xué)，代謝組學(xué)分析，轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組，以及結(jié)合生物信息學(xué)的分析，進(jìn)一步探索植物毛狀根的次級(jí)代謝規(guī)律，尋找最優(yōu)的培養(yǎng)條件是提高生產(chǎn)效率的關(guān)鍵。同時(shí)，應(yīng)繼續(xù)摸索單子葉植物毛狀根誘導(dǎo)的條件，提高單子葉植物毛狀根的誘導(dǎo)率，為次生代謝產(chǎn)物的生物合成以及工業(yè)生產(chǎn)創(chuàng)造條件；其次，開發(fā)新型生物反應(yīng)器和探索新的培養(yǎng)方法。毛狀根生長時(shí)易形成團(tuán)狀，成團(tuán)的毛狀根便限制了液體培養(yǎng)基的進(jìn)入。相對于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，其混合及培養(yǎng)環(huán)境的控制比較困難。同時(shí)，毛狀根的抗切變能力較低，不適宜強(qiáng)烈的攪拌，因此摸索一套合適的培養(yǎng)工藝，并開發(fā)大容量的適于培養(yǎng)毛狀根的新型生物反應(yīng)器顯得極為重要。同時(shí)，毛狀根的良好增長還受到多種因素的制約，包括培養(yǎng)基中碳源濃度、離子濃度、激素濃度以及農(nóng)桿菌侵染外植體的選擇等。故而，根據(jù)相應(yīng)的生產(chǎn)需求摸索合理的培養(yǎng)方法也是必不可少的。

同時(shí)，需對轉(zhuǎn)基因毛狀根的生物安全性做進(jìn)一步探究。植物毛狀根培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展歷史雖短，但發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒作為植物基因工程載體已顯示出顯著的優(yōu)越性。隨著研究的深入，其勢必成為比Ti質(zhì)粒更理想的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。同時(shí)，由于涉及到基因轉(zhuǎn)移，因而在生物工程日益發(fā)展的今天，其生物安全性問題也應(yīng)受到必要的關(guān)注。雖然到目前為止，并未有研究表明外源基因的導(dǎo)入會(huì)對人類、家畜的健康產(chǎn)生威脅，但是進(jìn)一步完善轉(zhuǎn)基因植物安全評價(jià)體系，探究轉(zhuǎn)基因植物對人類自身健康以及自然環(huán)境的影響顯得十分必要［47］。應(yīng)該看到，新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)與常規(guī)育種手段本質(zhì)上都是基因轉(zhuǎn)移過程，區(qū)別在于常規(guī)手段局限于種內(nèi)或近緣種間，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基因來源更為廣泛，涵蓋動(dòng)植物基因乃至微生物基因。本質(zhì)上講，轉(zhuǎn)基因技術(shù)僅是擴(kuò)大了可利用基因資源的范圍，但同時(shí)我們也不得不承認(rèn)，就當(dāng)今科技而言，人們并不能完全準(zhǔn)確的預(yù)測出一個(gè)外源基因在新的遺傳背景中會(huì)產(chǎn)生怎樣的作用。因此，對于轉(zhuǎn)基因毛狀根的生物安全性還應(yīng)該進(jìn)行更深層次地探討。

最后，在今后的研究中應(yīng)繼續(xù)探索發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)單子葉植物毛狀根的條件。眾所周知，玉米、水稻及小麥（Triticu m aestivu m）等主要糧食作物以及許多牧草都是單子葉植物。發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)單子葉植物毛狀根的研究存在巨大的應(yīng)用前景。為了提高單子葉植物毛狀根誘導(dǎo)的成功性，我們應(yīng)著眼于以下方面：1）選擇合適生長時(shí)期的合適外植體作為發(fā)根農(nóng)桿菌侵染的受體；2）改進(jìn)侵染手段，嘗試侵染時(shí)利用超聲波或添加表明活性劑，以增加發(fā)根農(nóng)桿菌與外植體的相互作用。同時(shí)，加入適量的酚類物質(zhì)以促進(jìn)農(nóng)桿菌對受體細(xì)胞的侵染。相信隨著分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)的快速發(fā)展，基礎(chǔ)理論研究的進(jìn)一步深入，通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的單子葉植物將會(huì)越來越多。如將毛狀根技術(shù)應(yīng)用于牧草重要農(nóng)藝性狀的遺傳改良以及抗旱耐鹽牧草新品種的培育，這將為草業(yè)科學(xué)研究領(lǐng)域提供一種新的技術(shù)手段，植物毛狀根的應(yīng)用前景勢必會(huì)更加廣闊。

致謝：該論文是第二屆全國草業(yè)生物技術(shù)大會(huì)評選出的優(yōu)秀論文，并得到中國草業(yè)生物技術(shù)專業(yè)委員會(huì)提供的版面費(fèi)支持。

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