褪黑素對PANC-1細胞增殖的影響及機制探討

謝俏，董麗鳳，徐有青，崔培林

(1北京市垂楊柳醫(yī)院，北京100022;2首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院)

胰腺惡性腫瘤對化療及放療的反應性差，因此 預后較差，為惡性程度較高的腫瘤之一。褪黑素是由松果體分泌的一種多功能的吲哚胺，近年多項研究證實其具有抑癌作用。Notch信號通路是一個高度保守的信號通路，Notch信號通路不僅可以決定細胞分化，而且在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。2010年11月～2011年7月，我們觀察了褪黑素對人胰腺癌細胞(PANC-1細胞)增殖的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 褪黑素、細胞及試劑 褪黑素;PANC-1細胞;高糖DMEM培養(yǎng)基，噻唑藍(MTT)，95%乙醇，胎牛血清，γ內(nèi)分泌酶抑制劑(DAPT)，DMSO，兔抗人NICD1，抗 β-actin 抗體，鼠抗兔 IgG，TRIzol，發(fā)光液。

1.2 PANC-1細胞分組及褪黑素干預 取PANC-1細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細胞分為以下幾組:①對照1組:取對數(shù)生長期的PANC-1細胞，用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。②褪黑素處理組:取對數(shù)生長期的PANC-1細胞，用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h后，將PANC-1細胞的完全培養(yǎng)基中分別加入濃度為1 000 000、1 000、1 nmol/L的褪黑素(用95%的乙醇稀釋褪黑素)，培養(yǎng)24 h。取以上2組處理細胞進行細胞增殖率和Notch活性片段NICD1表達的檢測。③對照2組:取對數(shù)生長期的PANC-1細胞，用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。④DAPT組:選取對數(shù)生長期的PANC-1細胞，用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h后，在 PANC-1細胞完全培養(yǎng)基中加10 μmol/L DAPT，培養(yǎng)24 h。

1.3 PANC-1細胞增殖率計算 取約3×104個細胞，接種于96孔板中，細胞貼壁后取于對數(shù)生長期時，將細胞分成對照1組、褪黑素組和對照2組、DAPT組，按照分組情況在培養(yǎng)基中加褪黑素、DAPT培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加MTT(5.0 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清，每孔加入 DMSO 150 μL，避光振蕩15 min，應用全自動酶標儀檢測490 nm處各孔的吸光度值(A值)，實驗重復3次，通過公式計算細胞增殖率，即細胞增殖率=A對照組/A實驗組×100%。

1.4 PANC-1細胞NICD1蛋白檢測 采用Western blotting法。將細胞分成對照1組、褪黑素組和對照2組、DAPT組，按分組情況處理后取約2.6×107個細胞，懸于細胞裂解液中冰浴30 min，裂解細胞，以12 000 r/min離心15 min，提取蛋白質(zhì)，定量后取90 μg蛋白與5×加樣緩沖液混勻，100℃變性5 min，冷卻后上樣。恒壓電泳2 h，4℃下將樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBST洗滌3次，5 min/次。加入兔抗人NICD1(1∶1 000)，4 ℃過夜，TBST洗滌3次，5 min/次。加入抗兔二抗(1∶3 000)，室溫振蕩孵育2 h，TBST 洗滌3 次，5 min/次。加入化學發(fā)光液，暗室中顯影2 min，TBST洗滌，晾干。以β-actin作為內(nèi)參照。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

對照1組細胞增殖率為0.38% ±0.03%，褪黑素組加入1、1 000、1 000 000 nmol/L的褪黑素后細胞增殖率分別為 0.36% ± 0.02%、0.32% ±0.02%、0.26% ±0.01%，對照1 組與褪黑素組加入1 000、1 000 000 nmol/L的褪黑素后增殖率比較，P均 ＜0.05。對照 2組細胞增殖率為 0.43% ±0.02%，DAPT 組細胞增殖率為 0.30% ±0.02%，兩組比較，P＜0.05。對照1組NICD1相對表達量為0.47 ± 0.05，褪黑素組加入 1、1 000、1 000 000 nmol/L的褪黑素后NICD1相對表達量分別為0.32±0.04、0.33 ±0.05、0.21 ±0.03，對照 1 組與褪黑素組加入1 000 000 nmol/L的褪黑素后NICD1相對表達量比較，P均＜0.05。對照2組NICD1相對表達量為0.63±0.05，DAPT組 NICD1相對表達量為0.38 ±0.03，兩組比較，P ＜0.05。

3 討論

胰腺癌是一種惡性程度高、診斷和治療困難的消化道惡性腫瘤，約90%為起源于腺管上皮的導管腺癌，其發(fā)病率和病死率高。胰腺癌5年生存率不足1%，是預后最差的惡性腫瘤之一。PANC-1細胞是從人胰腺癌中分離出來的腫瘤細胞，本實驗中用PANC-1細胞模擬胰腺癌的體外模型。

褪黑素是人體內(nèi)重要的抗腫瘤天然屏障，很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展均與褪黑素相關。大量研究表明，褪黑素的抗腫瘤活性可能與其免疫調(diào)節(jié)、抗增殖、抗氧化和抗血管新生機制相關。目前已有研究［1，2］表明，褪黑素的生物學機制可能與腫瘤進展相關，但是沒有直接數(shù)據(jù)表明褪黑素對胰腺癌細胞有增殖抑制作用。我們前期的研究表明，褪黑素可以抑制不同腫瘤的生長，促進腫瘤化療方案的發(fā)展。研究［3］證實，Notch信號通路參與胰腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展。由此我們假設褪黑素與Notch信號通路的相關性。

高濃度的褪黑素可以抑制PANC-1細胞的增殖，但低濃度(幾乎為生理濃度)的褪黑素不能明顯抑制細胞的增殖。本實驗結(jié)果與我們前期的實驗結(jié)果一致。我們前期研究［4］發(fā)現(xiàn)，褪黑素對人類臍靜脈內(nèi)皮細胞的抗增殖作用可能有兩種機制，一種是阻斷細胞循環(huán)，另外一種是誘導細胞凋亡。褪黑素(生理水平的10倍以上)可以阻斷PANC-1細胞進入有絲分裂的S期，因此減少細胞數(shù)，抑制細胞增殖。褪黑素從以下三個方面參與細胞凋亡過程:①褪黑素抑制免疫細胞的凋亡;②褪黑素阻斷神經(jīng)細胞凋亡;③褪黑素增加腫瘤細胞的凋亡率。這些研究結(jié)果均提示褪黑素的作用可能與細胞的類型、不同功能狀態(tài)下的細胞或其他因素如藥物濃度有關［5，6］。本實驗表明，褪黑素的作用劑量為關鍵因素，結(jié)合前期實驗，提示褪黑素的作用劑量和作用時間對其效應有決定性意義。同樣作用24 h，高濃度的褪黑素可以導致PANC-1細胞凋亡增加，但是接近生理濃度(1 nmol/L)的褪黑素卻不能有上述作用。

Notch信號通路在胰腺癌細胞的增殖以及凋亡中起重要作用［7］。γ內(nèi)分泌酶切割跨膜蛋白從而激活Notch信號通路，釋放的細胞內(nèi)部分向細胞核遷移，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而導致許多基因的表達［8］。DAPT可以抑制Notch信號通路的激活，還可以抑制細胞增殖，從而導致癌癥細胞的凋亡。用siRNA下調(diào)Notch1的表達可以抑制細胞的增殖，從而導致體外胰腺癌細胞凋亡［9，10］。本實驗中用 DAPT處理PANC-1細胞后，增殖率明顯下降。由此我們推斷，抑制Notch信號通路可以抑制胰腺癌細胞的增殖，即Notch通路可以促進胰腺癌細胞增殖。高濃度褪黑素可以抑制胰腺癌細胞的增殖，Notch通路的抑制劑DAPT同樣可以抑制胰腺癌細胞的增殖。我們猜測高濃度的褪黑素可以通過Notch信號通路影響胰腺癌細胞的增殖。

我們在PANC-1細胞中檢測到NICD1的表達，這表明Notch信號通路在胰腺癌細胞中是處于持續(xù)激活狀態(tài)的。這與近年來的研究提示Notch信號通路在胰腺癌中高表達一致［11～15］。在 PANC-1細胞中檢測到Notch1的活性片段也證實了Notch信號通路作為促癌基因在胰腺癌進展中起關鍵作用。本實驗選取不同濃度的褪黑素對胰腺癌細胞作用24 h后，檢測NICD1的表達情況提示，生理濃度(低濃度)的褪黑素可以抑制NICD1的表達，這可以解釋正常生理條件下不會患胰腺癌。由此推測胰腺癌的發(fā)生在某種程度上可能與褪黑素濃度下降相關。褪黑素生理節(jié)奏紊亂即分泌高峰延遲，可能會導致包括胰腺癌在內(nèi)的上消化道系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生［16］。高濃度的褪黑素可以顯著下調(diào)NICD1的表達，高濃度的褪黑素同樣可以顯著抑制PANC-1細胞的增殖，由此我們推斷，褪黑素通過抑制Notch通路進而抑制胰腺癌細胞的增殖。

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