維生素D對(duì)動(dòng)物鈣結(jié)合蛋白等基因表達(dá)的調(diào)控

■ 李 沖 吳峰洋 陳賽娟 劉亞娟 谷子林，3

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)山區(qū)研究所，河北保定 071001；3.河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北保定 071001）

維生素D是一種脂溶性維生素，是一種重要的動(dòng) 物所需的營(yíng)養(yǎng)素，已知的有10種形式，其中最主要的是VD3，又稱(chēng)為膽鈣化醇。維生素D通過(guò)多種途徑對(duì)動(dòng)物基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，同時(shí)影響了動(dòng)物的生長(zhǎng)免疫等方面。在動(dòng)物日糧的添加量中，傳統(tǒng)的模式均是以維生素不缺乏為基礎(chǔ)的添加，實(shí)際研究表明，較高水平的營(yíng)養(yǎng)素對(duì)DNA的維持反應(yīng)如基因表達(dá)、DNA合成與修飾等都是必要的[1]。日糧中的維生素D進(jìn)入體內(nèi)，主要以催化劑和輔酶的形式參與生理活動(dòng)，保證各組織和器官的正常功能，同時(shí)研究表明，維生素D對(duì)多種基因的表達(dá)有調(diào)控作用。Paul等研究表明，讓慢性腎病人口服維生素D2可以降低PTH的水平[2]。1,25(OH)2D3作用于靶細(xì)胞后會(huì)產(chǎn)生非基因效益和基因效益兩種不同的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，目前對(duì)維生素D的研究不僅局限于宏觀上對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)、免疫及發(fā)育等方面，在基因表達(dá)水平的研究使得維生素D更受到重視。

1 維生素D在生命活動(dòng)中的意義

維生素D是一種脂溶性維生素，屬于固醇類(lèi)衍生物，是人和動(dòng)物必需的營(yíng)養(yǎng)元素。最早在1930年由德國(guó)的A.Windaus教授首先確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，直到1936年正式確定其化學(xué)特性。維生素D可以在體內(nèi)合成并長(zhǎng)期貯存。主要包括5種化合物，VD2和VD3是最主要的兩種形式，兩種維生素D來(lái)源不同。VD2來(lái)源于植物，是由其體內(nèi)的麥角固醇經(jīng)過(guò)紫外線照射后轉(zhuǎn)變得到，而VD3是由動(dòng)物皮下7-脫氫膽固醇在紫外照射下經(jīng)光化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變而成。維生素D3進(jìn)入體內(nèi)后由于其本身不存在活性，不能直接發(fā)揮作用，需要進(jìn)一步代謝才能參與生理活動(dòng)。VD3的代謝產(chǎn)物包括1α,(OH)D3、25α,(OH)D3和1,25(OH)2D3。其生物學(xué)效價(jià)大體為維生素D3≤25α,(OH)D3≤1,25(OH)2D3，可見(jiàn)其中活性最強(qiáng)的是1,25(OH)2D3[3]。維生素D3進(jìn)入體內(nèi)后，首先進(jìn)入肝臟細(xì)胞，在25-羥化酶的催化下脫氫生成25(OH)D3[4]，再進(jìn)入腎臟，經(jīng)過(guò)1-α-羥化酶的作用，轉(zhuǎn)化為活性最強(qiáng)的1,25(OH)2D3[5-6],機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)羥化酶的活性來(lái)調(diào)節(jié)1,25(OH)2D3的合成，進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)到腸道、骨骼和甲狀腺等靶細(xì)胞中再依賴(lài)維生素D受體發(fā)揮生理功能。研究表明，1,25(OH)2D3進(jìn)入腸道細(xì)胞后，與VDR結(jié)合使其構(gòu)象改變，活化VDR與類(lèi)視黃酸X受體結(jié)合，二者結(jié)合形成的異二聚體則進(jìn)一步與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的VD應(yīng)答原件結(jié)合，促進(jìn)相關(guān)靶基因的表達(dá)，與鈣轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的改變影響鈣的吸收[7]。1,25(OH)2D3通過(guò)促進(jìn)腸道對(duì)鈣磷的吸收，腎小管對(duì)鈣磷的重吸收，協(xié)同PTH促進(jìn)骨脫鈣，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，保證骨骼的正常發(fā)育。李萬(wàn)佳[8]研究結(jié)果顯示，日糧中的VD能夠促進(jìn)獺兔免疫器官的發(fā)育和生長(zhǎng)，同時(shí)還能系統(tǒng)地提高抗氧化性。

2 維生素D對(duì)動(dòng)物基因表達(dá)的影響

2.1 維生素D對(duì)鈣結(jié)合蛋白基因表達(dá)的影響

鈣結(jié)合蛋白是一種與Ca2+有高度親和力的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在催化性能上除了包括有活性的酶類(lèi)，如生物膜上與鈣離子運(yùn)輸有關(guān)的ATP酶等，還包括無(wú)活性的鈣結(jié)合蛋白CaBP，如調(diào)鈣蛋白CaM和肌鈣蛋白C等，它們發(fā)揮生物學(xué)作用都是通過(guò)與Ca2+的結(jié)合使自身構(gòu)象改變來(lái)實(shí)現(xiàn)。CaBP-D9k和CaBPD28k都是維生素D依賴(lài)型的鈣結(jié)合蛋白，目前發(fā)現(xiàn)的CaBP-D28k主要分為兩種：一種在鳥(niǎo)類(lèi)體內(nèi)，一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)。不同的是前者的CaBP-D28k存在四個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，而后者只有兩個(gè)結(jié)合部位，主要參與Ca2+運(yùn)輸和吸收[9]。哺乳動(dòng)物中，CaBP-D28k在腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中濃度較高，而CaBP-D89k主要集中于小腸。這兩種蛋白由不同的基因控制，但都受到1,25(OH)2D3水平的調(diào)節(jié)。1,25(OH)2D3對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用依賴(lài)維生素D受體(VDR)和一些轉(zhuǎn)錄因子(TF)的共同作用。VDR分為膜受體(mVDR)和核受體(nVDR)，其中nVDR屬于核受體超家族成員，是1,25(OH)2D3發(fā)揮效應(yīng)的主要蛋白，在幾乎所有的有核細(xì)胞中均能表達(dá)，并廣泛存在于各個(gè)組織細(xì)胞。VDR蛋白的結(jié)構(gòu)有五個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)和配體結(jié)合區(qū)(LBD),其中LBD區(qū)是1,25(OH)2D3的特異性結(jié)合區(qū)域，結(jié)合后的VDR發(fā)生被PKC和酪蛋白激酶磷酸化的變化[10]。然后受激活的VDR與視黃酸X受體(RXR)發(fā)生異二聚化反應(yīng)形成異二聚體，該復(fù)合物通過(guò)其DBD區(qū)結(jié)合在鈣結(jié)合蛋白基因的特定序列片段(VDR應(yīng)答元件)，引起啟動(dòng)子DNA發(fā)生彎曲。磷酸化后的VDR由于其構(gòu)象發(fā)生了改變，使其本身與其他相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生作用，再加上RNA聚合酶的作用開(kāi)啟了啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，從而加速轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)鈣結(jié)合蛋白的合成[11]。

2.2 維生素D對(duì)鈣結(jié)合蛋白的非基因性調(diào)節(jié)

1,25(OH)2D3還會(huì)通過(guò)非基因效應(yīng)對(duì)Ca2+吸收進(jìn)行調(diào)節(jié)，即與一個(gè)膜蛋白受體（1,25D3-MARSS結(jié)合蛋白）結(jié)合[12]。研究發(fā)現(xiàn)，1,25D3-MARSS結(jié)合蛋白屬于二硫化物異構(gòu)酶家族的應(yīng)激蛋白，可作為能夠調(diào)節(jié)血鈣和血磷的PTH激素的受體[13]。1,25(OH)2D3與MARRS結(jié)合后通過(guò)G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生第二信使cAMP,進(jìn)而激活蛋白激酶A。通過(guò)PKA通路釋放的β-葡萄糖苷酸酶能夠提高瞬時(shí)受體電位通道蛋白6（TRPV6）的活性，進(jìn)而對(duì)Ca2+進(jìn)行調(diào)節(jié)[14]。除此之外，與膜受體結(jié)合后G蛋白的激活還使得與其相關(guān)聯(lián)的Ca2+通道打開(kāi)，形成的Ca2+流能夠激活磷酸肌醇酶PIC，PIC是一種磷脂酶，能夠斷裂PIP2中磷酸基與甘油之間化學(xué)鍵的斷裂生成IP3和DAG。IP3能夠促進(jìn)鈣庫(kù)中Ca2+的釋放，而DAG是提高蛋白激酶C活性的第二信使，PKC進(jìn)一步加速了Ca2+的內(nèi)流[11]。另一方面，1,25(OH)2D3與膜受體結(jié)合后形成的Ca2+流激活磷脂酶A2，磷脂酶A2能夠增加膜的通透性，又促進(jìn)了Ca2+的跨膜[15]。

2.3 維生素D對(duì)甲狀旁腺素受體（PTHR）基因表達(dá)的影響

甲狀旁腺素(PTH)由甲狀旁腺分泌，是調(diào)節(jié)血鈣和血磷的主要激素之一，對(duì)無(wú)機(jī)離子的重吸收起重要作用，同時(shí)還能激活腎臟內(nèi)的1,25-羥化酶的活性，促進(jìn)1,25(OH)2D3的轉(zhuǎn)化。1,25(OH)2D3能夠使甲狀旁腺素受體(PTHR)基因轉(zhuǎn)錄成mRNA的水平降低，該過(guò)程是在大鼠造骨細(xì)胞中通過(guò)抑制P2增強(qiáng)子活動(dòng)實(shí)現(xiàn)的[16]。

2.4 維生素D對(duì)骨保護(hù)素（OPG）基因表達(dá)的影響

1997年,美國(guó)加州分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Simonet等鑒別出一種被稱(chēng)為osteoprotegerin(OPG)能調(diào)節(jié)骨吸收的糖蛋白，是一種腫瘤壞死因子受體超家族的新成員，在體內(nèi)轉(zhuǎn)基因鼠的肝臟中表達(dá)OPG可以導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)硬化[17]。臨床研究表明，1,25(OH)2D3能抑制成骨細(xì)胞OPG mRNA表達(dá)，并隨其濃度的增加抑制作用增強(qiáng)；同時(shí)，另一方面促進(jìn)RANKL mRNA表達(dá)，并隨濃度增高作用增強(qiáng)；1,25(OH)2D3還可以抑制成骨細(xì)胞OPG蛋白的合成，這種作用隨濃度的升高而減少；長(zhǎng)期應(yīng)用1,25(OH)2D3可以降低骨質(zhì)疏松患者的脊椎和髖部骨折的發(fā)生率[18]。

3 維生素D對(duì)其他基因的調(diào)控

由腎臟分泌的24-羥化酶是將有活性的1,25(OH)2D3轉(zhuǎn)化為沒(méi)有活性的維生素D，依據(jù)24-羥化酶的自身反饋調(diào)節(jié)，當(dāng)過(guò)多的1,25(OH)2D3合成時(shí)，就會(huì)誘導(dǎo)24-羥化酶基因的表達(dá)，生成的24-羥化酶進(jìn)一步使得1,25(OH)2D3減少，從而維持VD在體內(nèi)的平衡[19]。在對(duì)OB細(xì)胞的研究中，中低濃度的1,25(OH)2D3能夠促進(jìn)骨保護(hù)素OPG基因mRNA的表達(dá)，而高濃度則起到抑制的作用[20]。在對(duì)大鼠的研究中，GSH大鼠中BMP2基因的mRNA的表達(dá)比正常SD大鼠降低，主要原因?yàn)?,25(OH)2D3能與VDR復(fù)合后結(jié)合在BMP2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，抑制了基因轉(zhuǎn)錄[21]。