凡納濱對蝦肝胰臟原代細(xì)胞培養(yǎng)體系的優(yōu)化

■ 鄭玉忠 劉亞群 劉 昂 楊培奎 查廣才 莊東紅， 張振霞

(1.韓山師范學(xué)院生物系，廣東潮州 521041；2.汕頭大學(xué)廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東汕頭 515063）

凡納濱對蝦（Penaeus vannamei），亦稱南美白對蝦，是國際公認(rèn)高養(yǎng)殖、高產(chǎn)量的三大優(yōu)良蝦種（凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦和中國對蝦）之一。凡納濱對蝦抗病力強(qiáng)、耐鹽性廣、適應(yīng)能力強(qiáng)、生長快、產(chǎn)肉率高，是世界水產(chǎn)市場的熱銷品種，1988年引入我國后迅速掀起養(yǎng)殖熱潮，目前的凡納濱對蝦產(chǎn)量占全國對蝦產(chǎn)量的80%以上。

隨著凡納濱對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴(kuò)張，高密度的養(yǎng)殖、種質(zhì)的退化和環(huán)境污染的加劇等不利因素誘發(fā)了大規(guī)模的病害；因此，抗生素等藥物被普遍用在對蝦病害的防治中。但是抗生素的濫用，導(dǎo)致病原物產(chǎn)生抗藥性，甚至產(chǎn)生新型病害，進(jìn)而導(dǎo)致對蝦遭受更嚴(yán)重的病害或種質(zhì)衰退。同時(shí)，抗生素在對蝦體內(nèi)的殘留又會造成食品安全問題，影響人的健康。

對蝦原代細(xì)胞培養(yǎng)是研究對蝦病害的致病機(jī)理、診斷和防控技術(shù)的重要手段。肝胰臟恰恰是對蝦最為關(guān)鍵和核心的器官，參與消化、吸收、儲存、代謝等重要生理活動，特別在啟動對蝦免疫反應(yīng)中起重要作用。如能建立肝胰臟細(xì)胞培養(yǎng)條件，培養(yǎng)能夠繼代的肝胰臟原代細(xì)胞，將有利于構(gòu)建對蝦病害研究和藥物篩選體系。盡管國內(nèi)外不少專家學(xué)者在對蝦細(xì)胞的體外培養(yǎng)上進(jìn)行了大量的探索和研究，但目前對蝦的細(xì)胞培養(yǎng)仍然處于原代培養(yǎng)水平，永生性的細(xì)胞性一直未建立。因此，本研究擬用改進(jìn)的對蝦細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對凡納濱對蝦肝胰臟細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化，提高肝胰臟細(xì)胞存活率，建立和完善成熟高效的對蝦原代細(xì)胞培養(yǎng)體系，然后進(jìn)一步建立對蝦永生性細(xì)胞系。

1 儀器與材料

1.1 儀器

pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；HH-2恒溫水浴鍋(江蘇金壇市宏華儀器廠)；311型直熱式CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾上海儀器有限公司)；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)；TKA-GenPure超純水系統(tǒng)(廣東丹利科技有限公司)；BG-stirrer 1DB磁力攪拌器(北京百晶生物技術(shù)有限公司)；TS100倒置顯微鏡[尼康儀器(上海)有限公司]；Olympus相差顯微鏡；FA2204B電子天平；無菌眼科剪；培養(yǎng)瓶。

1.2 材料與試劑

選擇體色正常、健康活潑、體重適中的凡納濱對蝦，在循環(huán)池中配于人工海水(鹽度為8.0‰)，在25℃室溫通氣養(yǎng)殖。

MTT購自北京Solarbio公司；DMEM、MEM、L-15培養(yǎng)基粉劑及Grace培養(yǎng)液均購自GIBCO公司；M199培養(yǎng)液購自HyClone公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司；青鏈霉素混合液(100×)購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 培養(yǎng)基及試劑的配制

DMEM、MEM培養(yǎng)基：取整包DMEM、MEM培養(yǎng)基粉末，溶于900 ml超純水，pH值調(diào)至7.4～7.6，定容至1 L，無菌條件下0.22μm微孔濾膜過濾滅菌，冷凍保存。

L-15培養(yǎng)基：取整包L-15培養(yǎng)基粉末，溶于450 ml超純水，pH值調(diào)至7.4～7.6，定容至500 ml，無菌條件下0.22μm微孔濾膜過濾滅菌，冷凍保存。

D-HANKS 緩沖液：稱取 NaCl 8 g、KCl 0.4 g、Na2HPO40.48 g、KH2PO40.6 g、NaHCO30.35 g，溶于900 ml超純水，定容至1 L。

MTT試劑：稱取MTT 0.5 g，溶于100 ml磷酸緩沖液(PBS)，pH值調(diào)至7.4。0.22μm濾膜過濾，4℃避光保存。在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)

取20μl細(xì)胞懸液于血球計(jì)數(shù)板上，在Olympus相差顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

2.2 對蝦肝胰臟原代細(xì)胞培養(yǎng)

2.2.1 肝胰臟原代細(xì)胞分離

將循環(huán)水池中飼養(yǎng)一周的成年凡納濱對蝦浸泡于4℃預(yù)冷70%的乙醇中5 min，滅菌D-hanks緩沖液沖洗2～3次，酒精棉球擦凈體表。取對蝦肝胰臟于無菌小燒杯中，D-hanks沖洗2～3次后用無菌眼科剪及鑷子剔除結(jié)締組織。在5 ml含2 000 IU/ml青霉素、2 000μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中浸泡40 min后(期間更換一次培養(yǎng)基)，棄去培養(yǎng)基，用無菌眼科剪剪成1 mm3組織塊，轉(zhuǎn)移至10 ml無菌離心管，加入5 ml培養(yǎng)基并充分吹打，靜置5～10 min。取上層培養(yǎng)基1 ml轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管，加入青鏈霉素并調(diào)至1 000 IU/ml青霉素、1 000μg/ml鏈霉素，按試驗(yàn)需求加入一定比例的FBS，調(diào)節(jié)至所需細(xì)胞濃度。每孔體積200 μl接種到96孔板，置于26～28 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.2 MTT法測定肝胰臟細(xì)胞存活率

上述原代細(xì)胞用培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔5×105個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μl，置于26～28 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加MTT溶液20μl，孵育4 h，終止培養(yǎng)。5 000 r/min離心5 min，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。在酶標(biāo)儀上595 nm測定OD值并記錄結(jié)果。

2.3 原代肝胰臟細(xì)胞的顯微觀察

原代肝胰臟細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)及細(xì)胞類型如圖1所示。

圖1 倒置顯微鏡觀察原代培養(yǎng)肝胰臟細(xì)胞(400×)

對蝦肝胰臟由四種類型細(xì)胞組成，分別為：胚性細(xì)胞(E,embryo cells)、纖維細(xì)胞(F,fibrillar cells)、吸收細(xì)胞(R,resorptive cells)、泡狀細(xì)胞(B,blister-like cells)。泡狀細(xì)胞(又稱分泌細(xì)胞)的功能是分泌消化酶類，成熟分泌細(xì)胞中的液泡大，集中于細(xì)胞頂部，電鏡下可以觀察到很多平行排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)用以旺盛合成消化酶類（B）。吸收細(xì)胞的功能是吸收營養(yǎng)物質(zhì)，其中的大脂滴就是脂類物質(zhì)的儲存形式（R）。纖維細(xì)胞通常被認(rèn)為是分泌細(xì)胞分泌后細(xì)胞體萎縮過程的殘留形態(tài)（F）。胚性細(xì)胞是一種保持分化潛能的細(xì)胞，細(xì)胞可分化成分泌細(xì)胞或吸收細(xì)胞，其活性相對要弱一些，故沒有出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器分化（E）。

2.4 不同培養(yǎng)條件對肝胰臟細(xì)胞生長的影響

培養(yǎng)12 h后，利用MTT法觀察五種培養(yǎng)基(DMEM、MEM、GRACE、2×L-15和M199)對肝胰臟細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：采用2×L-15培養(yǎng)基肝胰臟細(xì)胞存活率最高，達(dá)到62.9%；GRACE培養(yǎng)基最低，為52.4%；五種培養(yǎng)基維持細(xì)胞存活率的高低排名為2×L-15＞DMEM＞MEM=M199＞GRACE(圖2)。結(jié)果說明2×L-15培養(yǎng)基具有最優(yōu)培養(yǎng)效果。

圖2 不同培養(yǎng)基對肝胰臟細(xì)胞存活率影響

同時(shí)，將不同pH值 (6.8、7.2、7.6和8.0)、滲透壓(Na-Cl添加量：0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%和2.0%)、FBS(添加量：0%、5%、10%、20%、30%和40%)添加至2×L-15的培養(yǎng)基，MTT法測定肝胰臟細(xì)胞懸浮培養(yǎng)12 h后的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：肝胰臟細(xì)胞存活率在測定范圍內(nèi)，隨pH值增加呈先增后降的趨勢；pH值為7.6時(shí)，肝胰臟細(xì)胞存活率最高，達(dá)到68.2%；pH值為6.8時(shí)，肝胰臟細(xì)胞存活率最低，為57.1%(圖3)。隨NaCl添加量的增加呈先增后降的趨勢；當(dāng)NaCl添加量為1.2%時(shí)，培養(yǎng)基滲透壓約為706 mmol/kg，肝胰臟細(xì)胞存活率最高，達(dá)到67.2%；當(dāng)NaCl添加量為0%時(shí)，肝胰臟細(xì)胞存活率最低，僅為57.5%(圖4)。肝胰臟細(xì)胞存活率并沒有因添加FBS有顯著提升，其最高細(xì)胞存活率出現(xiàn)在添加量為5%～10%時(shí)，分別為63.3%和61.6%，且FBS添加量超過10%其細(xì)胞存活率反而被抑制，低于未添加FBS組(圖5)。因此，肝胰臟原代細(xì)胞培養(yǎng)最優(yōu)條件是：pH值為7.6，NaCl添加量為1.2%，F(xiàn)BS添加量為5%。

圖3 不同pH值對肝胰臟細(xì)胞存活率影響

圖4 不同滲透壓對肝胰臟細(xì)胞存活率影響

圖5 不同濃度FBS對肝胰臟細(xì)胞存活率影響

3 討論

通過比較在幾種培養(yǎng)基下的細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)，2×L-15更適合凡納濱對蝦肝胰臟細(xì)胞的原代培養(yǎng)，且以2×L-15為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH值調(diào)至7.6，1.2%NaCl以調(diào)節(jié)滲透壓，加入5%FBS時(shí)為最優(yōu)培養(yǎng)體系。在對蝦細(xì)胞培養(yǎng)的研究工作中，不同研究者所用的培養(yǎng)基不盡相同，其中以L-15使用最為廣泛。Manohar等采用改進(jìn)的L-15培養(yǎng)基將斑節(jié)對蝦肝胰臟細(xì)胞成功培養(yǎng)至45 d。王宏偉以M199為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH值7.6時(shí)細(xì)胞聚集成團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，多數(shù)細(xì)胞貼壁，生長良好。Ludeman等將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至6.8～7.2在培養(yǎng)凡納濱對蝦肝胰臟原代細(xì)胞時(shí)，也取得了不錯的效果。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2×L-15添加1.2%NaCl，其滲透壓約為706 mmol/kg時(shí)，能夠促進(jìn)肝胰臟細(xì)胞存活；與Hu等培養(yǎng)中國明對蝦淋巴組織采用的滲透壓為(720±10)mmol/kg接近，略低于Chen等培養(yǎng)斑節(jié)對蝦淋巴組織時(shí)選擇的滲透壓(760±10)mmol/kg。對蝦細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用最多的是胎牛血清，多數(shù)學(xué)者選擇的血清添加濃度為10%～20%。但本研究發(fā)現(xiàn)，5%～10%FBS更適合凡納濱對蝦肝胰臟細(xì)胞的培養(yǎng)，過高的FBS添加量會抑制肝胰臟細(xì)胞的存活。盡管本研究基于L-15培養(yǎng)基優(yōu)化了凡納濱對蝦肝胰臟細(xì)胞的培養(yǎng)條件，但是培養(yǎng)效果并不理想，因此需進(jìn)一步探究對蝦細(xì)胞生長所必需的營養(yǎng)成分和理化條件，以獲得適于對蝦細(xì)胞生長的理想培養(yǎng)基。