高產(chǎn)纖維素酶菌的篩選及鑒定

■吳珊珊 趙 靜 陳建軍

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000）

纖維素是地球上最古老、最豐富的天然高分子，是人類最寶貴的天然可再生資源，已廣泛應(yīng)用于食品、動物飼料、洗滌等工業(yè)生產(chǎn)中。

纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖。不溶于水及一般有機溶劑，是植物細胞壁的主要成分。纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，占植物界碳含量的50%以上。棉花的纖維素含量接近100%，為天然的最純纖維素來源。一般木材中，纖維素占40%～50%，還有10%～30%的半纖維素和20%～30%的木質(zhì)素。對β-內(nèi)切葡聚糖酶的克隆始于20世紀70年代。纖維素酶是水解纖維素生成纖維二糖及葡萄糖的一類酶的總稱。纖維素酶并不是一種單一組分的酶，而是由許多高協(xié)同作用的水解酶組成的復(fù)合酶體系，根據(jù)其催化反應(yīng)功能的不同可分為：內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。纖維素的完全水解，是這3種酶的協(xié)同作用，內(nèi)切葡聚糖酶隨機切割纖維素多糖鏈內(nèi)部的無定型區(qū)，產(chǎn)生不同長度的寡糖和新鏈的末端。我國擁有豐富的纖維素資源，但因大量農(nóng)業(yè)廢棄物不能及時有效利用，造成了資源的浪費，同時也污染了環(huán)境。利用纖維素酶將其分解轉(zhuǎn)化，可解決環(huán)境污染問題，有效實現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用。此外，合理利用纖維素資源，對開發(fā)飼料資源，生產(chǎn)生物能源，減輕人類對化石能源的消耗具有重大意義。

目前,農(nóng)村中大量的纖維素利用率很低，如畜禽飼料中含有大量的纖維素,除某些反芻動物具有分解纖維素能力外，大部分畜禽不具備此能力。在青貯飼料中添加纖維素酶可使纖維素分解促進乳酸發(fā)酵。另外，添加纖維素酶后，由于纖維素被消化，乳酸發(fā)酵能力提高，貯存性能也提高。在飼料中添加纖維素酶后，飼喂幼雞、仔豬及一般虛弱動物時,喂養(yǎng)效果明顯；飼喂蛋雞可提高產(chǎn)卵量；飼喂乳牛不僅可以使體重增加，而且提高產(chǎn)乳量。因此，在當(dāng)?shù)刈匀粭l件下篩選出纖維素酶高產(chǎn)菌株可以用于農(nóng)村小規(guī)模形式的青貯飼料、畜糞處理，這樣既可以提高纖維素的利用率以促進家畜養(yǎng)殖，也可以減輕農(nóng)村中廢棄植物體焚燒導(dǎo)致對大氣的污染。從自然界中分離純化纖維素酶高產(chǎn)菌株并測定各菌株的最適發(fā)酵時間可以提高纖維素酶的酶活力，進而提高纖維素的利用率，促進工農(nóng)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

樣品采自新鄉(xiāng)市周邊的稻稈堆積土壤、腐木堆積土壤，共12份，去除3 cm表層土后，取樣于無菌三角瓶中。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 ml，pH值7.0。

馬鈴薯固體培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然。

馬鈴薯去皮，切成小塊兒，煮沸30 min，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂，用玻璃棒攪拌到全部溶解，再定容至1 000 ml。

平板分離培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉 5.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、氯化鈉 10.0 g、瓊脂 20.0 g、蒸餾水 1 000 ml，115℃滅菌30 min，pH值自然。

改良細菌剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀0.5 g/l、(NH4)2SO42 g/l、MgSO4·7H2O 0.25 g/l、微晶纖維素粉1.88 g/l、剛果紅0.2 g/l、瓊脂18 g，pH值自然,121℃滅菌20 min。

1.1.3 樣品材料的處理

首先經(jīng)過加熱干燥后，取5.0 g樣品放入盛有95 ml無菌水的錐形瓶中,在27℃、200 r/min條件下充分振蕩 30 min,搖勻,靜置。

1.2 試驗方法

1.2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩

把土壤樣品取5 g放入三角瓶中，加95 ml蒸餾水，加玻璃珠搖勻，取其上清液l ml加入到9 ml無菌水中,稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的濃度梯度,然后通過常規(guī)的稀釋法或劃線法接種涂布于纖維素平板分離培養(yǎng)基之上，30℃恒溫培養(yǎng)1 d,菌落計數(shù),然后挑選菌落形態(tài)差異比較明顯的菌落,重復(fù)劃線接種于相應(yīng)的瓊脂平板上,直至純化得到單菌落,然后轉(zhuǎn)接于相應(yīng)的瓊脂斜面上,以備后用。

把培養(yǎng)出來的菌株,分別接種到剛果紅培養(yǎng)基上,保持對應(yīng)關(guān)系,進行培養(yǎng)。若菌株產(chǎn)纖維素酶,則會在菌落周圍出現(xiàn)清晰的透明圈,依據(jù)透明圈直徑的大小選擇產(chǎn)酶菌株。用游標卡尺測量菌落周圍水解透明圈的直徑和菌落直徑,并以兩者的比值大小作為初步判斷分解能力的指標,將比值較大的菌落挑取到選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng),作進一步產(chǎn)酶水平的測定和纖維素酶高產(chǎn)菌株的篩選。

1.2.2 菌株的純化

對上一步初選出的能產(chǎn)纖維素酶的菌在牛肉膏蛋白胨平板上進行劃線分離,得到純化的菌株。

1.2.3 菌株的復(fù)篩

對純化好的菌株在各平板培養(yǎng)基上點種,同初篩的方法進行復(fù)篩菌株,選擇生長速度快、比值較大并且相對穩(wěn)定的菌株。

1.2.4 剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基觀察水解圈大小

用點接的方法把各個菌株接于剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h，觀察水解圈大小。

1.2.5 顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察

先在載玻片上滴加一滴生理鹽水，把菌落用接種環(huán)挑起后，涂于生理鹽水中央直徑1 cm左右，混勻，把載玻片放在酒精燈上來回加熱烘干固片，然后滴加草酸銨結(jié)晶紫染色60 s，水洗，再加革蘭氏碘液覆蓋60 s，用95%酒精脫色30 s，水洗，最后用番紅復(fù)染2 min，干燥，鏡檢。

1.2.6 菌株的鑒定

形態(tài)鑒定：在平板上挑菌體少許，涂于載玻片上，置于顯微鏡下觀察。16SrRNA鑒定：用細菌通用引物進行16SrDNA PCR擴增。PCR反應(yīng)體系(25μl)為Ex Taq 0.25 μl,10×buffer 2.5 μl,dNTPs 2 μl,引物（上游引物:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；下游引物：GGTTACCTTGTTACGACTT)各0.3 μl,DNA 模板0.5 μl，ddH2O 19μl。PCR反應(yīng)條件:94℃ 3 min；94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,35個循環(huán)；72℃ 5 min。真菌擴增通用引物(上游引物ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG,下游引物 CCGATCCCTAGTCGGCATAG）進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，測得的序列在NCBI中用BLAST進行序列比對。

1.2.7 CMC酶活力測定

酶活力測定方法：①繪制葡萄糖標準曲線。按照張龍翔的方法測定并繪制標準曲線。②粗酶液的制備:取發(fā)酵液于4℃ 、5 000 r/min離心10 min,得上清液。③DNS法測酶活力:取4支帶有20 ml刻度的試管,1支做空白對照,3支做平行樣品管,每支試管中加1 ml酶溶液,樣品管置于50℃水浴鍋中預(yù)熱2 min，對照管置于沸水浴10 min，然后在4支試管中加入4 ml已預(yù)熱至50℃的1%羧甲基纖維素鈉為底物的溶液,樣品管置于50℃水浴準確計時5 min取出。每管立即加入1 ml 2 mol/l氫氧化鈉溶液和2 ml DNS顯色液,搖勻后樣品管與對照管都置于沸水浴準確計時3 min取出,流水迅速冷卻,并用蒸餾水定容20 ml，搖勻后用分光光度計于485 nm處測定吸光度值。在上述條件下定義為1 min產(chǎn)生1μg葡萄糖為1個酶活單位。

1.2.8 革蘭氏染色

①涂片固定；②草酸銨結(jié)晶紫染1 min；③自來水沖洗；④加碘液覆蓋涂面染約1 min；⑤水洗，用吸水紙吸去水分；⑥加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，20 s后水洗，吸去水分；⑦蕃紅染色液（?。┤旧? min后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

1.2.9 代謝指紋分析

將篩選出來的6株菌株做一系列生理生化指標的測定。如：淀粉水解試驗，甲基紅試驗，過氧化氫酶試驗，V-P試驗，乳糖、葡萄糖、蔗糖的利用試驗。以上鑒定方法均參照文獻陳金春微生物試驗教程。

1.2.10 發(fā)酵條件的研究

以篩選出來的最大酶活力的菌株作為研究對象,用麩皮作為固態(tài)發(fā)酵的原料，在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上分別單獨改變上述3個參數(shù)其中之一,其他參數(shù)不變。發(fā)酵溫度設(shè)26、28、30、32、34、36 ℃ 6個水平,發(fā)酵時間設(shè)12、24、36、48、60、72、84 h 7個水平,含水量設(shè)20.0%、30.0%、40.0%、50.0%、60.0%5個水平，每個水平設(shè)3組平行,研究上述3種參數(shù)變化對酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩

對純化后獲得的12株候選菌株利用剛果紅水解圈試驗進行了初步鑒定，結(jié)果如圖1所示，其中6株菌水解圈要明顯大于其他菌，通過測量水解圈直徑，可以看到2、4、5、6、7、9、10、11、12號水解圈比較大，1、3、8號基本沒有水解圈，其中2、5、9、10、11、12水解圈最大（見表1），這6株菌作為初篩候選菌株進行進一步的鑒定。

圖1 剛果紅染色水解圈大小的比較

表1 水解圈直徑大小

2.2 候選菌株的形態(tài)學(xué)鑒定（見圖2）

如圖2所示，2號菌株菌體細胞呈桿狀，無莢膜，菌落大，表面粗糙，扁平，不規(guī)則；5號菌株也是桿狀，無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性；9號菌株革蘭氏染色呈陽性；10號菌株細胞形態(tài)和排列呈桿狀，革蘭氏陽性；11號菌株菌體微小，革蘭氏陽性，呈桿狀；12號菌株呈不定型棉絮狀或致密叢束狀，其菌落表面的顏色呈綠色。

2.3 指紋代謝分析（見表2）

從表2可以看出，候選菌株中，2、5、9、10、11、12號菌株淀粉水解試驗為陽性，說明其可以分泌淀粉酶；6株菌過氧化氫酶試驗均為陽性，說明它們都是具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡；甲基紅試驗中，5、10、11號菌株呈陽性，可以產(chǎn)酸；V-P試驗中，2、5、9、10、11號菌株呈陽性，說明菌株中含有丙酮酸脫羧酶；6株菌株都能利用葡萄糖，說明葡萄糖可以作為其生長的碳源；除了2、5號菌株不能利用乳糖，12號菌株不能利用蔗糖，其他菌株均可以利用乳糖和蔗糖，那么，乳糖和蔗糖也可以作為它們生長的基質(zhì)；除12號菌株外，其余菌株革蘭氏染色均為陽性。

圖2 各種菌株的油鏡形態(tài)觀察

表2 指紋代謝分析

2.4 電泳檢測結(jié)果（見圖3）

圖3 電泳檢測圖

由圖3可知，6種候選菌株片段大小均為1 500 bp左右，經(jīng)回收后測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI比對發(fā)現(xiàn)2號為蠟狀芽孢桿菌（同源性達99%），5號為枯草芽孢桿菌（同源性達100%），9號為巨大芽孢桿菌（同源性達99%），10號為地衣芽孢桿菌（同源性達99%）,11號均為微小桿菌（同源性達98%），12號為綠色木霉（同源性達98%）。

2.5 固態(tài)發(fā)酵后的酶活力

把2、5、9、10、11、12號這6株菌分別用于固態(tài)發(fā)酵，我們選擇米糠和麥麩作為原料，結(jié)果如表3所示，6株菌發(fā)酵后的酶活力均極顯著高于對照組。不管是用麩皮還是米糠，所有產(chǎn)酶菌株中地衣芽孢桿菌的酶活力均是最強的，故本研究將地衣芽孢桿菌作為產(chǎn)酶的候選菌株。

表3 不同菌株發(fā)酵后酶活力的大小

2.6 地衣芽孢桿菌發(fā)酵麩皮條件的優(yōu)化

為了摸索候選菌株產(chǎn)酶的最優(yōu)條件，我們以麩皮作為發(fā)酵原料，比較了溫度、時間及含水量的變化對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖4所示，當(dāng)其他條件不變，發(fā)酵溫度為30℃ 時（圖4a），酶活力達到最大值，隨著溫度的增加，酶活力開始降低；而酶活力隨發(fā)酵時間延長不斷提高，但當(dāng)發(fā)酵時間達到60 h后，酶活力達到最大值，此后隨時間的延長酶活力逐漸降低（圖4b）；圖4c則顯示當(dāng)其他條件不變,水分含量為40%時，酶活力處于最大值。因此，確定最適發(fā)酵條件為：溫度30℃，初始水分含量40%，發(fā)酵時間60 h。

圖4 不同培養(yǎng)條件對酶活力的影響

3 討論與結(jié)論

徐昶等在高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件研究中報道了一株灰綠曲霉，其產(chǎn)纖維素酶的能力很高。此后，又有許多研究證實了這一結(jié)果。很多真菌都可以分解出產(chǎn)纖維素的酶，不過，真菌產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物的含量極低，同時真菌在多次傳代后，生物特性退化，其代謝產(chǎn)物不穩(wěn)定。本試驗篩選分離出的目的菌是細菌，細菌易培養(yǎng)、易控制、生產(chǎn)成本低、生長快、不受原料的限制、發(fā)酵產(chǎn)物較單一、有效成分易分離，對工業(yè)化的生產(chǎn)有一定的推動作用，為用細菌產(chǎn)纖維素酶提供了新的思路。在以前的諸多報道中，篩選出來產(chǎn)纖維素酶的菌后，關(guān)于工業(yè)化生產(chǎn)的研究相對較少，而本研究中，用了麩皮和米糠兩種纖維素含量豐富的原料，進行了產(chǎn)酶能力的比較，并最終選擇麩皮作為基質(zhì)，優(yōu)化了培養(yǎng)條件，為以后試驗菌株真正用于生產(chǎn)實踐奠定了基礎(chǔ)。

在本研究中，用剛果紅染色觀察水解圈的大小初步篩選出6株產(chǎn)酶能力強的菌株，對它們進一步進行形態(tài)學(xué)的鑒定、16SrDNA的測定以及產(chǎn)酶能力的測定，篩選出一株最優(yōu)的目的菌，通過對試驗菌發(fā)酵溫度、時間及含水量的初步優(yōu)化，獲得其固態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)化條件為：培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時間60 h、水分含量40%。該結(jié)果與他人的報道相一致，如封曄等報道的米曲霉和黑曲霉的最優(yōu)發(fā)酵溫度是35℃，最優(yōu)發(fā)酵時間是48 h，隨著溫度的增加，酶逐漸失活，酶活力也隨之下降：隨著時間的增加，次級代謝產(chǎn)物積累，酶活力也會降低；而本研究中，最優(yōu)含水量是40%，如果水分過多，會影響培養(yǎng)基內(nèi)部的透氣性，使培養(yǎng)基內(nèi)部散熱難，也可能造成雜菌污染，導(dǎo)致酶活力降低。

本文篩選出一株酶活力高的地衣芽孢桿菌。據(jù)報道，地衣芽孢桿菌細胞形態(tài)和排列呈桿狀、單生，可調(diào)整菌群失調(diào)達到治療目的，可促使機體產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)、殺滅致病菌。能產(chǎn)生抗活性物質(zhì)，并具有獨特的生物奪氧作用機制，能抑制致病菌的生長繁殖。地衣芽孢桿菌的良好特性正在被人們所廣泛認識。在人們越來越關(guān)注食品安全的今天，地衣芽孢桿菌制劑作為新一代新飼料添加劑必將具有廣闊的前景。

（參考文獻17篇，刊略，需者可函索）