非糜爛性反流病患者食管上皮細胞鈣黏蛋白的表達及細胞間隙的改變

劉榮泉，傅奕，鄭英，陳浮，徐曉鈴，喬敏，朱海杭(揚州大學臨床醫(yī)學院，揚州蘇北人民醫(yī)院，江蘇揚州500;揚州大學醫(yī)學院)

非糜爛性反流病患者食管上皮細胞鈣黏蛋白的表達及細胞間隙的改變

劉榮泉1，傅奕2，鄭英2，陳浮1，徐曉鈴1，喬敏1，朱海杭1
(1揚州大學臨床醫(yī)學院，揚州蘇北人民醫(yī)院，江蘇揚州225001;2揚州大學醫(yī)學院)

摘要:目的探討非糜爛性反流病(NERD)患者食管上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達變化及細胞間隙的改變。方法采用免疫組化染色法檢測43例份NERD食管下段上皮組織與26例正常食管下段上皮組織中的E-cadherin，在光鏡下觀察切片并采集圖像，采用圖像分析系統(tǒng)測量細胞間隙。結(jié)果E-cadherin在NERD食管上皮組織中異常表達36例(失表達4例、不完整性表達32例)，異常表達率83.7%;在正常食管上皮組織中異常表達5 例(失表達0例、不完整性表達5例)，異常表達率19.2%;二者相比，P＜0.01。NERD患者食管鱗狀上皮細胞間隙［(1.23±0.04)μm］大于正常食管鱗狀上皮細胞間隙［(0.68±0.06)μm］，二者相比，P＜0.01。結(jié)論E-cadherin 在NERD患者食管上皮組織中低表達，導致細胞間隙增寬，可能是NERD發(fā)病的機制之一。

關(guān)鍵詞:胃食管反流;上皮細胞鈣黏蛋白;細胞間隙;免疫組織化學

非糜爛性反流病(NERD)是指具有反流癥狀，而內(nèi)鏡下沒有食管黏膜異常表現(xiàn)的一種常見慢性病。美國一項互聯(lián)網(wǎng)調(diào)查的流行病學資料顯示，成年人胃食管反流病(GERD)發(fā)病率達26%，而NERD占GERD的70%左右［1］。NERD的發(fā)生與抗反流屏障功能失調(diào)有關(guān)，包括下食管括約肌松弛、食管內(nèi)反流物清除障礙、食管黏膜防御能力下降等。上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)為細胞間連接的重要組成部分，與緊密連接蛋白(TJ)相連，共同維持細胞功能［2，3］。食管鱗狀上皮細胞間隙增寬是NERD的早期形態(tài)學表現(xiàn)，可為正常人細胞間隙的2～3倍。本文對NERD患者食管上皮組織中E-cadherin的表達變化及鱗狀上皮細胞間隙的改變進行研究，以探討其與NERD的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料2013年3～9月蘇北人民醫(yī)院收治的有反流、胸痛等癥狀的患者43例，均經(jīng)胃鏡及病理學檢查診斷為NERD。其中，男25例、女18例，年齡25～77(52.2±13.4)歲。另選擇無反流癥狀非GERD者26例作對照，男13例、女13例，年齡35～65(51.8±9.4)歲。均在距離食管下端3～5 cm處取上皮組織標本活檢。

1.2E-cadherin檢測采用免疫組織化學染色En-Vision法(二步法)。組織標本用10%甲醛固定24 h，石蠟包埋、切片、脫蠟，梯度乙醇至水，PBS(pH 7.4)沖洗3次，微波法熱抗原修復，檸檬酸(pH 6)緩沖液，3% H2O2去離子水37℃孵育10 min。PBS沖洗3次，除去PBS液，每張切片加1滴E-cadherin抗體(博士)，冰箱4℃過夜，PBS沖洗3次，除去PBS液，每張切片加1滴E-cadherin Anti-Rabbit IgG，溫箱37℃孵育60 min，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加2滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察1～3 min。自來水沖洗，蘇木素復染1 min，自來水沖洗返藍。切片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察其表達部位及類型。結(jié)果判斷: E-cadherin正常表達于上皮細胞，呈完整的胞膜表達;鏡下見棕黃色顆粒狀為其表達陽性，以染色強度分別計0～3分(無染色計0分、輕度染色計1分、中等染色計2分、強染色計3分)，再以細胞膜完整表達、不完整表達＜50%、不完整表達≥50%、失表達分別計3、2、1、0分，兩項得分相加，0分為失表達，1～3分為不完整性表達，4～6分為完整性表達，失表達與不完整性表達為E-cadherin異常表達。

1.3細胞間隙測量另取切片行HE染色后，選取基底上層或棘層的細胞核居中、核仁明顯的細胞，光鏡(×400)觀察并采集圖像。采用盲法對每例切片隨機選擇10個不同視野共取10張照片，采用IPP圖像分析系統(tǒng)每張相片測量10個細胞間隙，計算測量得到的100個細胞間隙的平均值，然后計算平均值。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料用珋x±s表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料以百分比表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1E-cadherin在NERD食管上皮組織與正常食管上皮組織中的表達比較E-cadherin在NERD食管上皮組織中異常表達36例(失表達4例、不完整性表達32例)，異常表達率83.7%;在正常食管上皮組織中異常表達5例(失表達0例、不完整性表達5例)，異常表達率19.2%;二者相比，P＜0.01。

2.2NERD食管鱗狀上皮與正常食管鱗狀上皮細胞間隙比較NERD食管鱗狀上皮細胞間隙為(1.23±0.04)μm，正常食管鱗狀上皮細胞間隙為(0.68±0.06)μm，二者相比，P＜0.01。

3　討論

食管黏膜防御主要為上皮屏障，由細胞膜、橋粒蛋白(DP)和TJ組成，TJ由跨膜蛋白、胞質(zhì)附著蛋白、細胞骨架蛋白相連組成［4］。E-cadherin是鈣依賴性黏附蛋白家族中的重要成員，是黏著連接的一個組成部分，與TJ、DP共同維持細胞屏障;其基因位于第16號染色體長臂，為跨膜黏蛋白，其羧基末端駐留在細胞質(zhì)中，而氨基末端位于細胞間隙，在Ca2+參與下通過胞質(zhì)連環(huán)素與細胞骨架蛋白相連，介導細胞間及細胞與細胞外基質(zhì)的黏附作用;在建立和維持上皮組織細胞間連接阻力及滲透性中起主要作用［5］。Jovov等［5］研究發(fā)現(xiàn)，缺乏E-cadherin蛋白的白鼠模型中食管黏膜存在細胞間隙增寬，說明E-cadherin蛋白與食管黏膜的細胞間隙增寬有一定關(guān)系。

在病理情況下，如炎性因子作用，酸堿、膽汁刺激等，可引起食管上皮E-cadherin分布異常、表達減少甚至溶解，影響其功能，破壞上皮細胞間的極性和完整性，細胞間的黏附作用減弱或消失，導致細胞間隙增寬，進而使內(nèi)皮層通透性升高［6］。反流性食管炎和NERD食管黏膜細胞間隙都存在增寬［7］，其通透性增大［8］。有研究認為上皮細胞間隙增寬是NERD的客觀結(jié)構(gòu)指標［9］。經(jīng)質(zhì)子泵抑制劑治療后，NERD食管黏膜上皮細胞間隙可恢復正常［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照者相比，NERD食管上皮組織中E-cadherin異常表達率高，為蛋白量下降或失表達所致，這與國外報道［5］結(jié)果相符;且細胞間隙增寬明顯，與正常對照者相比差異有統(tǒng)計學意義。因此，從分子學基礎上可以認為NERD發(fā)病與E-cadherin的異常表達有關(guān)。從本研究結(jié)果來看，NERD患者由于E-cadherin表達異常，導致細胞連接結(jié)構(gòu)和功能異常，細胞間隙增寬，使得黏膜通透性升高，H+、胃蛋白酶、膽汁酸等易透過上皮層，作用于黏膜下的神經(jīng)末梢，從而引起燒心、反酸、胸痛等癥狀。因此，NERD的發(fā)生可能與E-cadherin表達異常，使得細胞間隙增寬，細胞間通透性增高有關(guān)。

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·綜述·

(收稿日期:2014-09-25)

文章編號:1002-266X(2015) 21-0088-02

文獻標志碼:B

中圖分類號:R571

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.036