• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人臍帶組織間充質(zhì)干細胞對小鼠腫瘤的趨化作用

    2015-04-04 07:59:49房敬超張曉龍張晴曹蕾姜愛娜李茜協(xié)和干細胞基因工程有限公司天津300384中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院血液病醫(yī)院血液學研究所實驗血液學國家重點實驗室
    山東醫(yī)藥 2015年21期
    關(guān)鍵詞:間充質(zhì)干細胞肝腫瘤淋巴瘤

    房敬超,張曉龍,張晴,曹蕾,姜愛娜,李茜(協(xié)和干細胞基因工程有限公司,天津300384;中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院血液病醫(yī)院血液學研究所,實驗血液學國家重點實驗室)

    人臍帶組織間充質(zhì)干細胞對小鼠腫瘤的趨化作用

    房敬超1,張曉龍2,張晴2,曹蕾1,姜愛娜1,李茜1
    (1協(xié)和干細胞基因工程有限公司,天津300384;2中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院血液病醫(yī)院血液學研究所,實驗血液學國家重點實驗室)

    摘要:目的觀察人臍帶組織間充質(zhì)干細胞(MSCs)對小鼠B系惡性淋巴瘤和肝癌的趨化作用。方法通過酶切、連接等方法構(gòu)建pLenti-fLuc慢病毒表達載體,利用293T細胞包裝慢病毒顆粒,并感染人臍帶組織華通氏膠來源的MSCs(WJ-MSCs),使其表達螢火蟲熒光素酶(fLuc)。分別于NOD/SCID小鼠中建立BJAB淋巴瘤細胞皮下移植模型及BALB/c裸鼠中建立HepG2肝癌原位移植瘤模型,經(jīng)尾靜脈將MSCs-fLuc注射至荷瘤小鼠體內(nèi),采用體內(nèi)生物發(fā)光成像系統(tǒng)觀察MSCs-fLuc向腫瘤部位的遷移情況。結(jié)果成功構(gòu)建慢病毒表達載體pLenti-fLuc,且經(jīng)慢病毒感染可在WJ-MSCs中穩(wěn)定表達。成功建立BJAB淋巴瘤細胞皮下移植瘤模型,MSCs-fLuc經(jīng)小鼠尾靜脈注射24 h后選擇性地定位于腫瘤部位。成功建立BALB/c裸鼠的HepG2肝癌皮下原位移植瘤模型,MSCs-fLuc經(jīng)尾靜脈注射2 d后遷移并聚集于肝臟。結(jié)論WJ-MSCs具有向小鼠淋巴瘤和肝癌歸巢的能力,此為以MSCs為載體的腫瘤靶向治療提供了實驗基礎。

    關(guān)鍵詞:淋巴瘤;肝腫瘤;間充質(zhì)干細胞;生物發(fā)光成像;趨化作用;小鼠

    間充質(zhì)干細胞(MSCs)為一群異質(zhì)性的非造血干細胞,具有高度增殖活性和多向分化潛能,廣泛分布于全身多種組織[1~6]。MSCs具有低免疫源性、分離純化方便、易于基因改造以及向腫瘤部位歸巢等特點[7~9],已成為腫瘤靶向治療的理想載體?;铙w動物體內(nèi)光學成像系統(tǒng)(IVIS)通過靈敏的光學檢測儀器可以直接監(jiān)控生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為,相比傳統(tǒng)的動物實驗所得的數(shù)據(jù)更加真實可信。為了研究MSCs在體內(nèi)對腫瘤的趨化作用,2013年6月~2014年9月,我們用螢火蟲熒光素酶(fLuc)標記了人臍帶華通氏膠來源的間充質(zhì)干細胞(WJMSCs),并觀察其對小鼠B系惡性淋巴瘤和肝癌的趨化作用。

    1 材料與方法

    1.1材料pGL3-basic載體、慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP及包裝載體pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G由本室保存;大腸桿菌DH5α購自北京康為世紀生物科技有限公司。

    1.2WJ-MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定從手術(shù)臺上取下的人臍帶在24 h內(nèi)進行處理,用含雙抗的PBS沖洗臍帶,將其剪成1 cm長的小塊,沖洗干凈;剝離臍帶動靜脈血管壁,取華通氏膠部分,剪碎至0.5 cm3大小,依次擺放于預先濕潤的T-75塑料培養(yǎng)瓶中倒置培養(yǎng); 4~8 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,次日添加1 mL 含10%FBS及2 mmol/L L-谷氨酰胺的DF-12培養(yǎng)基,連續(xù)添加3 d,第4天全量換液,以后每周換液兩次;培養(yǎng)10~14 d后,去除組織塊,用含0.125%胰酶及0.01%EDTA的細胞消化液消化細胞,進行初次原瓶傳代,待細胞長至60%~70%融合時,二次傳代(3×103/cm2)或凍存。取第3~5代的WJMSCs用于實驗。收集對數(shù)生長期的WJ-MSCs,冷PBS洗滌3次,將細胞分別重懸于20 μL直標抗體CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE中,4℃孵育1 h,PBS洗滌3次后重懸于400 μL PBS中,流式細胞儀檢測WJ-MSCs相應表型的陽性率。

    1.3慢病毒表達載體pLenti-fLuc的構(gòu)建按照質(zhì)粒小提試劑盒(DP103-03,天根生化科技有限公司)操作步驟,利用Nhe I、BamH I雙酶切慢病毒表達載體pLenti-R和含fLuc報告基因的載體pGL3-basic。1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物,并用瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒純化回收得到載體大片段和編碼熒光素酶的小片段。用T4快速連接酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)連接兩片段,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)菌,挑取單克隆于2-YT(含氨芐青霉素100 μg/mL)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12~16 h。小提質(zhì)粒,用Nhe I和BamH I雙酶切鑒定,并于-80℃凍存鑒定正確的克隆。

    1.4慢病毒的包裝及感染W(wǎng)J-MSCs按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(DP117,天根生化科技有限公司)的操作步驟同時提取3種慢病毒包裝質(zhì)粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV和pVSV-G以及慢病毒表達載體pLenti-fLuc。胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞,按2×106/mL的細胞密度接種5 mL至10 cm培養(yǎng)板中,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。按照LipofectaminTM2000操作步驟,將4種質(zhì)粒pPACKH1-GAG(6 μg)、pPACKH1-REV(2 μg)、pVSV-G(2 μg)以及pLenti-fLuc(2 μg)共同轉(zhuǎn)染至293T細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后收集293T細胞培養(yǎng)上清,4℃離心(4 000 r/min,10 min)去除細胞碎片,并用0.45 μm濾器過濾。病毒上清直接用于感染細胞或-80℃中保存。取第3~5代的WJ-MSCs 按8×103個/cm2的密度接種于T-75培養(yǎng)瓶中。次日,將WJ-MSCs培養(yǎng)基換為含病毒上清的DF-12培養(yǎng)基(按MOI=8將病毒上清與新鮮含10% FBS的DF-12培養(yǎng)基混合成8 mL,同時加入polybrene,終濃度為8 μg/mL),12 h后終止感染。WJ-MSCs經(jīng)慢病毒感染后第4天,熒光顯微鏡下觀察CopGFP熒光,0.125%胰酶消化后收集細胞用于體內(nèi)實驗,或液氮凍存。

    1.5MSC-fLuc中報告基因fLuc的表達檢測用含fLuc報告基因的慢病毒顆粒按照MOI=8感染W(wǎng)JMSCs,使其穩(wěn)定表達fLuc。取24孔板1塊,分別加入5×102、1×103、5×103、1×104、5×104、1×105、5 ×105個細胞,并設PBS空白對照。每孔加入終濃度為150 μg/mL的D-luciferin,30 s后在IVIS上檢測生物發(fā)光情況。

    1.6荷瘤小鼠模型的建立

    1.6.1BJAB移植瘤模型的建立選用雌性6周齡NOD/SCID小鼠(中國協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物中心提供) 6只,體質(zhì)量18~20 g,于SPF級環(huán)境下飼養(yǎng),并對小鼠行γ射線(260 cGy/只)照射。BJAB細胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基中,收集對數(shù)生長期的BJAB細胞,冷PBS洗滌2次,調(diào)整細胞密度為2.5×107/mL,于小鼠右前肢根部背側(cè)皮下接種BJAB細胞,每只小鼠接種200 μL,待腫瘤生長至200~300 mm3時進行實驗。

    1.6.2HepG2肝癌皮下原位移植瘤模型的建立選用雌性5周齡BALB/c裸鼠(中國協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物中心提供) 15只,體質(zhì)量18~20 g,于SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)。取其中5只皮下接種前5 h對小鼠行γ射線照射。HepG2肝癌細胞培養(yǎng)于含10% FBS 的DMEM完全培養(yǎng)基中,取對數(shù)生長期的HepG2肝癌細胞經(jīng)胰酶消化后用冷PBS洗滌2次,調(diào)整細胞密度為2.5×107/mL。用帶21 G針頭的1 mL注射器于小鼠右后肢根部背側(cè)皮下接種HepG2細胞,每只小鼠接種200 μL。接種后約2周左右腫瘤成長至1 cm3。原位移植參照文獻[10]進行,脫頸處死皮下移植瘤小鼠,無菌條件下取魚肉狀瘤組織,放入含有慶大霉素的生理鹽水中漂洗,并修剪成1~2 mm3大小備用。另取10只使用2%戊巴比妥鈉以100 mg/kg的劑量行腹腔麻醉,常規(guī)消毒后沿劍突下腹中線剪開1~2 cm,擠出肝臟,用手術(shù)刀切一小口,將瘤塊用眼科鑷放入切口約3 mm深,用生理鹽水浸潤的紗布止血1 min以防止瘤塊脫落??p合切口后用紅霉素眼膏涂于切口處預防感染。術(shù)后2周,脫頸處死小鼠,取肝臟、肺、脾、腎進行病理學檢查,確定原位模型是否建立成功及有無轉(zhuǎn)移。

    1.7MSCs-fLuc對腫瘤的趨化作用觀察待BJAB皮下移植瘤長至200~300 mm3及HepG2肝癌原位移植瘤模型建立后,經(jīng)尾靜脈注射200 μL MSCsfLuc細胞懸液(5×105個細胞/只) ;注射24 h后,小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(濃度2%),待小鼠麻醉后按150 μg/g腹腔注射熒光素酶底物D-luciferin。10 min后,采用IVIS觀察MSCs-fLuc對腫瘤的趨化作用。

    2 結(jié)果

    2.1WJ-MSCs的分離及鑒定結(jié)果倒置顯微鏡下可觀察到分離的WJ-MSCs成纖維狀梭形貼壁生長。流式細胞儀測定WJ-MSCs的表面標志CD73、CD90、CD105陽性率均在99%以上。

    2.2MSCs-fLuc中fLuc的表達熒光顯微鏡下觀察MSCs-fLuc可見綠色熒光,證明MSCs-fLuc高效表達fLuc。WJ-MSCs感染后第4天,流式細胞儀檢測感染效率達71.3%。IVIS觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)光信號強度與MSCs-fLuc的數(shù)量呈正相關(guān)。

    2.3WJ-MSCs對腫瘤的趨化作用在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成功建立BJAB皮下移植瘤模型; IVIS觀察可見腫瘤部位BLI信號(曝光時間為5 min),證明在小鼠體內(nèi)WJ-MSCs向BJAB腫瘤部位定向遷移。在BALB/c裸鼠中建立人肝癌HepG2細胞的皮下原位移植瘤模型;病理學檢查結(jié)果顯示,原位移植后2周,小鼠肝臟可見腫瘤結(jié)節(jié)形成,結(jié)節(jié)中央大片壞死,且壞死部分有大量分葉核炎細胞浸潤,其他臟器如肺、脾、腎不見轉(zhuǎn)移; MSCs-fLuc經(jīng)尾靜脈注射入荷瘤小鼠,24 h后IVIS觀察發(fā)現(xiàn)細胞聚集于肝臟腫瘤部位。

    3 討論

    目前,有關(guān)骨髓、脂肪以及臍帶血來源的MSCs用于腫瘤治療的研究報道較多,而對于人臍帶組織WJ-MSCs介導的腫瘤靶向治療研究較少。WJ-MSCs除具有傳統(tǒng)骨髓來源MSCs的特點外還擁有其自身優(yōu)點,如分離方便、易于基因改造、增殖速度快、免疫源性低等,同時WJ-MSCs的使用不涉及倫理學問題。因此WJ-MSCs越來越受到臨床及基礎研究的重視。MSCs的可塑性及其向損傷部位遷移的能力使其成為組織再生修復中的有利工具[11]。實體瘤浸潤并破壞正常組織形成腫瘤微環(huán)境,同時分泌大量趨化因子及其他蛋白,這一微環(huán)境與損傷組織的微環(huán)境極為相似,因此MSCs會將腫瘤認為是正常損傷或是炎癥部位,從而向腫瘤部位遷移。這一特點可使MSCs作為細胞載體用于基因治療。MSCs可將抗腫瘤藥物(細胞因子、干擾素、凋亡誘導劑等)運輸至腫瘤部位從而抑制腫瘤的生長[12,13]。

    IVIS是運用生物發(fā)光或熒光報告基因來追蹤標記細胞在體內(nèi)活動過程的一項成像技術(shù)。本實驗中我們將fLuc標記的WJ-MSCs注射至荷瘤小鼠體內(nèi),趨化到腫瘤部位的MSCs表達fLuc,在底物熒光素以及氧、ATP的存在下通過酶促反應產(chǎn)生光子,產(chǎn)生的光子可被IVIS檢測到。IVIS方便、靈敏,為體內(nèi)觀察細胞的動向提供了直觀、可靠的數(shù)據(jù)。本研究采用IVIS觀察發(fā)現(xiàn)WJMSCs經(jīng)尾靜脈注射24 h后聚集于腫瘤部位。有研究對MSCs的趨化作用解釋為MSCs跨過內(nèi)皮細胞而被某種組織的脈管系統(tǒng)捕獲的過程[14],但MSCs趨化作用的具體機制尚未闡明。目前,普遍認為MSCs表面的趨化因子受體在相應趨化因子或細胞因子的誘導下使其發(fā)生定向遷移;其中依賴CXCR4-SDF-1相互作用產(chǎn)生的遷移在腎細胞癌[15]、乳腺癌[16]等惡性腫瘤中也存在。本研究僅觀察了WJ-MSCs對淋巴瘤及肝癌的趨化作用,而且其中涉及的具體機制還有待進一步研究。

    參考文獻:

    [1]Friedenstein AJ,Gorskaja JF,Kulagina NN.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[J].Exp Hematol,1976,4(5) : 267-274.

    [2]Fraser JK,Wulur I,Alfonso Z,et al.Fat tissue: an under appreciated source of stem cells for biotechnology[J].Trends Biotechnol,2006,24(4) : 150-154.

    [3]Wolbank S,van Griensven M,Grillari-Voglauer R,et al.Alternative sources of adult stem cells: human amniotic membrane[J].Adv Biochem Eng Biotechnol,2010(123) : 1-27.

    [4]Int Anker PS,Scherjon SA,Kleijburg-van der Keur C,et al.Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placena[J].Stem cells,2004,22(7) : 1338-1345.

    [5]Bromeyer HE,Srour E,Orschell C,et al.Cord blood stem and progenitor cells[J].Methods Enzymol,2006(419) : 439-473.

    [6]Wang HS,Hung SC,Peng ST,et al.Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord[J].Stem Cells,2004,22(7) : 1330-1337.

    [7]Roura S,Pujal JM,Bayes-Genis A.Umbilical cord blood for cardiovascular cell therapy: from promise to fact[J].Ann N Y Acad Sci,2012(1254) : 66-70.

    [8]Vilalta M,Degano IR,Bago J,et al.Biodistribution,long-term survival,and safety of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells transplanted in nude mice by high sensitivity non-invasive bioluminescence imaging[J].Stem Cells Dev,2008,17(5) : 993-1003.

    [9]Gotherstrom C,Ringden O,Tammik C,et al.Immunologic properties of human fetal mesenchymal stem cells[J].Am J Obstet Gynecol,2004,190(1) : 239-245.

    [10]孫萍,王怡,孫志東,等.利用熒光素酶標記的腫瘤細胞建立肝癌原位移植模型及其活體成像[J].生物技術(shù)通訊,2008,19 (3) : 383-385.

    [11]Brooke G,Cook M,Blair C,et al.Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells[J].Semin Cell Dev Biol,2007,18 (6) : 846-858.

    [12]Fritz V,Jorgensen C.Mesenchymal stem cells: an emerging tool for cancer targeting and therapy[J].Curr Stem Cell Res Ther,2008,3(1) : 32-42.

    [13]Prockop DJ.Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs) : controversies,myths,and changing paradigms[J].Mol Ther,2009,17(6) :939-946.

    [14]Karp JM,Leng Teo GS.Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details[J].Cell Stem Cell,2009,4(3) : 206-216.

    [15]Zagzag D,Krishnamachary B,Yee H,et al.Stromal cell-derived factor-1 alpha and CXCR4 expression in hemangioblastoma and clear cell-renal cell carcinoma: von Hippel-Lindau lossof-functon induces expression of a ligand and its receptor[J].Cancer Res,2005,65(14) : 6178-6188.

    [16]Muller A,Homey B,Soto H,et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J].Nature,2001,410(6824) : 50-56.

    Chemotaxis of mesenchymal stem cells in human umbilical cord tissues on tumor in mice

    FANG Jing-chao1,ZHANG Xiao-long,ZHANG Qing,CAO Lei,JIANG Ai-na,LI Qian
    (1 Union Stemcell&Gene Engineering Co.LTD,Tianjin 300384,China)

    Abstract:ObjectiveTo observe the tropism of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (MSCs) for malignant lymphoma of B department and liver carcinoma by using in vivo bioluminescent imaging system (IVIS).Methods The lentivirus expression vector pLenti-fLuc was constructed by restriction enzyme cleavage and linkage.Human umbilical cord Wharton's Jelly-derived MSCs (WJ-MSCs) were labeled with firefly luciferase (fLuc) by stable transfection with lentivirus which had been packaged in 293T cells.To demonstrate the tumor tropism of WJ-MSCs,MSC.fLuc were injected intravenously into NOD/SCID mice bearing BJAB lymphoma or BALB/c nude mice which burdened hepatocellular carcinoma in situ with HepG2cells,and the migration in vivo was monitored by IVIS.Results The lentivirus expression vector pLenti-fLuc was successfully constructed,and the expression of fLuc was stable in WJ-MSCs by transfection with lentivirus.The subcutaneous BJAB lymphoma xenograft model was successfully established in NOD/SCID mice,and MSC.fLuc migrated to tumor site after 24 hours by intravenous injection.The HepG2orthotopic hepatocarcima model was successfully established in BALB/c nude mice.When it was injected intravenously,MSC.fLuc's tropism for liver was found 48 hours later.Conclusion WJ-MSCs have the capacity of tumor tropism for lymphoma and hepatocarcima,and it provides basis for tumor-targeting therapy which uses MSCs as the vector.

    Key words:lymphoma; liver neoplasms; mesenchymal stem cells; bioluminescence imaging; chemotaxis; mice

    (收稿日期:2015-02-12)

    通信作者簡介:李茜(1961-),女,副研究員,主要從事細胞生物學研究。E-mail: 1360501260@ qq.com

    作者簡介:第一房敬超(1980-),女,實習研究員,主要從事臍帶間充質(zhì)干細胞腫瘤趨化研究。E-mail: fangjch_80@163.com

    基金項目:國家自然科學基金資助項目(30971291)。

    文章編號:1002-266X(2015)21-0001-04

    文獻標志碼:A

    中圖分類號:R73-3; R394

    doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.001

    猜你喜歡
    間充質(zhì)干細胞肝腫瘤淋巴瘤
    HIV相關(guān)淋巴瘤診治進展
    傳染病信息(2022年3期)2022-07-15 08:24:12
    認識兒童淋巴瘤
    經(jīng)皮超聲引導下放射性125I粒子植入治療晚期肝癌的臨床觀察
    間充質(zhì)干細胞與未成熟樹突細胞聯(lián)合胰島細胞移植治療小鼠糖尿病
    經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)治療肝細胞癌的研究進展
    殼聚糖培養(yǎng)對間充質(zhì)干細胞干性相關(guān)基因表達的作用
    臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療難治性系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的療效分析
    原發(fā)性肝癌患者乙型肝炎病毒標志物模式與病毒DNA載量分析
    原發(fā)性肝癌超聲引導下經(jīng)皮射頻消融治療的臨床觀察
    鼻咽部淋巴瘤的MRI表現(xiàn)
    磁共振成像(2015年5期)2015-12-23 08:52:50
    久久精品国产亚洲av天美| 午夜福利视频1000在线观看| 美女国产视频在线观看| 久久热精品热| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 嫩草影院入口| 乱人视频在线观看| 综合色av麻豆| 免费观看a级毛片全部| 色哟哟哟哟哟哟| 三级经典国产精品| 在线国产一区二区在线| 亚洲图色成人| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲av熟女| 日日撸夜夜添| 日韩欧美精品v在线| 欧美精品一区二区大全| 国产精品一区二区在线观看99 | 黄色欧美视频在线观看| 成人av在线播放网站| 日韩欧美精品免费久久| 中文字幕熟女人妻在线| 国产成年人精品一区二区| 亚洲精品日韩av片在线观看| av天堂中文字幕网| 可以在线观看毛片的网站| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美3d第一页| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 青春草国产在线视频 | 国产乱人视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久久国产成人精品二区| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久韩国三级中文字幕| 成人午夜高清在线视频| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久国产乱子免费精品| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 一级黄片播放器| 亚洲精品影视一区二区三区av| 久久综合国产亚洲精品| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲av男天堂| av国产免费在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产午夜福利久久久久久| 成年版毛片免费区| 网址你懂的国产日韩在线| 内射极品少妇av片p| 一级毛片aaaaaa免费看小| 乱码一卡2卡4卡精品| 极品教师在线视频| www日本黄色视频网| 国产乱人视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产老妇女一区| 亚洲中文字幕日韩| 国产熟女欧美一区二区| 九九在线视频观看精品| 全区人妻精品视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 人人妻人人看人人澡| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 九九爱精品视频在线观看| 久久久久性生活片| 熟女人妻精品中文字幕| 国产真实乱freesex| 一本一本综合久久| 成人av在线播放网站| 精品人妻熟女av久视频| 99久久精品国产国产毛片| 国产成人a∨麻豆精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久综合国产亚洲精品| 国产一区二区激情短视频| 亚洲精品色激情综合| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 欧美丝袜亚洲另类| 久久久久性生活片| 国产高清三级在线| 黄色配什么色好看| 国产精品1区2区在线观看.| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 网址你懂的国产日韩在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 内射极品少妇av片p| 少妇熟女aⅴ在线视频| 内射极品少妇av片p| 内射极品少妇av片p| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 中文字幕久久专区| 亚洲国产精品国产精品| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产单亲对白刺激| 夜夜夜夜夜久久久久| 女人被狂操c到高潮| 成年免费大片在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 干丝袜人妻中文字幕| 一个人看视频在线观看www免费| 高清毛片免费看| 人妻久久中文字幕网| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 午夜福利成人在线免费观看| 女人被狂操c到高潮| 国产日本99.免费观看| 精品无人区乱码1区二区| 成人鲁丝片一二三区免费| 别揉我奶头 嗯啊视频| av专区在线播放| 18+在线观看网站| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| kizo精华| 亚洲在久久综合| 国产免费男女视频| 天天一区二区日本电影三级| 在线a可以看的网站| 精品熟女少妇av免费看| 欧美一区二区精品小视频在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 少妇被粗大猛烈的视频| 精品久久久久久久久av| 一个人免费在线观看电影| 欧美激情在线99| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美在线一区亚洲| 久久国内精品自在自线图片| 久久精品夜色国产| 性欧美人与动物交配| 国产精品久久电影中文字幕| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久久久久久久中文| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产成人a区在线观看| 99久久人妻综合| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久这里有精品视频免费| 久久久久久久久中文| 特级一级黄色大片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲自拍偷在线| 婷婷色综合大香蕉| 日韩精品有码人妻一区| 日韩成人伦理影院| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 岛国毛片在线播放| 一级黄色大片毛片| 国产极品精品免费视频能看的| 日韩精品有码人妻一区| 九九热线精品视视频播放| 久久午夜亚洲精品久久| 最近的中文字幕免费完整| 国产精品蜜桃在线观看 | 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 深爱激情五月婷婷| 校园人妻丝袜中文字幕| 成人性生交大片免费视频hd| 美女高潮的动态| 内地一区二区视频在线| 老女人水多毛片| 免费人成在线观看视频色| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美+日韩+精品| 婷婷亚洲欧美| 九九在线视频观看精品| 天堂中文最新版在线下载 | 国产久久久一区二区三区| 欧美高清性xxxxhd video| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久人妻av系列| 日韩大尺度精品在线看网址| 麻豆一二三区av精品| 亚洲成av人片在线播放无| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 色综合站精品国产| 最近视频中文字幕2019在线8| 乱人视频在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 免费搜索国产男女视频| 亚洲最大成人手机在线| 好男人在线观看高清免费视频| 久久精品夜色国产| 成熟少妇高潮喷水视频| 日本三级黄在线观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 99久久精品一区二区三区| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产精品.久久久| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产亚洲91精品色在线| 亚洲最大成人av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 免费观看的影片在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 久久草成人影院| 久久久久久久久久久丰满| 免费人成在线观看视频色| 啦啦啦韩国在线观看视频| 看黄色毛片网站| 日韩在线高清观看一区二区三区| 大香蕉久久网| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久精品人妻少妇| 欧美日韩在线观看h| 最新中文字幕久久久久| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 女同久久另类99精品国产91| 91久久精品电影网| 美女大奶头视频| 一区福利在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 老司机影院成人| 国产日本99.免费观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 黄色欧美视频在线观看| 伦精品一区二区三区| 日本成人三级电影网站| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产不卡一卡二| 九九热线精品视视频播放| 欧美在线一区亚洲| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美高清成人免费视频www| 国语自产精品视频在线第100页| 日韩欧美 国产精品| 国产一区二区三区av在线 | 欧美xxxx性猛交bbbb| 人妻久久中文字幕网| 日韩视频在线欧美| 伊人久久精品亚洲午夜| 此物有八面人人有两片| 色噜噜av男人的天堂激情| 一级毛片久久久久久久久女| 三级毛片av免费| 成人欧美大片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 大香蕉久久网| 日本-黄色视频高清免费观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 最后的刺客免费高清国语| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 成人美女网站在线观看视频| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美一区二区精品小视频在线| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久久大精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 免费黄网站久久成人精品| 在线播放无遮挡| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日本色播在线视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 人妻久久中文字幕网| av在线亚洲专区| 91久久精品电影网| 日韩三级伦理在线观看| 精品久久久久久久久av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久久九九精品影院| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 九九热线精品视视频播放| 一本久久精品| 国产91av在线免费观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久久成人免费电影| 性插视频无遮挡在线免费观看| 中出人妻视频一区二区| 97超碰精品成人国产| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产一区亚洲一区在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 看十八女毛片水多多多| 日韩中字成人| 久久6这里有精品| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久这里有精品视频免费| av.在线天堂| 亚洲综合色惰| 成人无遮挡网站| 国产91av在线免费观看| 欧美+日韩+精品| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 性欧美人与动物交配| 91精品一卡2卡3卡4卡| 神马国产精品三级电影在线观看| 黑人高潮一二区| 久久九九热精品免费| 日韩欧美国产在线观看| 大香蕉久久网| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产视频首页在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲精品国产成人久久av| av女优亚洲男人天堂| 99热这里只有是精品50| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 美女内射精品一级片tv| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品国产高清国产av| 哪个播放器可以免费观看大片| 偷拍熟女少妇极品色| 99热这里只有是精品在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 久久久午夜欧美精品| or卡值多少钱| 国产视频内射| 伦理电影大哥的女人| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 可以在线观看的亚洲视频| 黄色欧美视频在线观看| 国产av在哪里看| av视频在线观看入口| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品.久久久| 免费观看a级毛片全部| 亚洲av熟女| 中文在线观看免费www的网站| 精品熟女少妇av免费看| 波多野结衣高清作品| 老司机影院成人| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 熟女电影av网| 91麻豆精品激情在线观看国产| 成人无遮挡网站| 又爽又黄a免费视频| 小说图片视频综合网站| 草草在线视频免费看| 男女视频在线观看网站免费| 成人亚洲精品av一区二区| 久久鲁丝午夜福利片| 日韩欧美精品v在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产麻豆成人av免费视频| 赤兔流量卡办理| 精品人妻偷拍中文字幕| 色哟哟·www| 三级毛片av免费| 亚洲在久久综合| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久韩国三级中文字幕| 日韩欧美国产在线观看| 小说图片视频综合网站| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 三级国产精品欧美在线观看| 长腿黑丝高跟| 欧美色视频一区免费| 国产av麻豆久久久久久久| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产成人aa在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 久久99蜜桃精品久久| а√天堂www在线а√下载| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲欧美日韩东京热| 久久精品国产自在天天线| 91久久精品国产一区二区成人| 99热这里只有精品一区| av福利片在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲精品国产av成人精品| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 22中文网久久字幕| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 2022亚洲国产成人精品| av在线天堂中文字幕| 久久精品国产亚洲av天美| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品精品国产色婷婷| 晚上一个人看的免费电影| 插逼视频在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 干丝袜人妻中文字幕| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产老妇伦熟女老妇高清| 免费av观看视频| 最新中文字幕久久久久| 国产精华一区二区三区| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲真实伦在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 卡戴珊不雅视频在线播放| 黑人高潮一二区| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 观看免费一级毛片| 一进一出抽搐gif免费好疼| 好男人视频免费观看在线| 在线国产一区二区在线| 日日撸夜夜添| 久久久国产成人精品二区| 一个人看的www免费观看视频| 丰满乱子伦码专区| 亚洲图色成人| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 最近手机中文字幕大全| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品,欧美在线| 99在线视频只有这里精品首页| 国产免费男女视频| 男女那种视频在线观看| 九草在线视频观看| 亚洲av免费在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲在久久综合| 深夜精品福利| 免费看av在线观看网站| 亚洲电影在线观看av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 老女人水多毛片| 国产精品无大码| 精品一区二区三区视频在线| 欧美日本视频| 黑人高潮一二区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 男女啪啪激烈高潮av片| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲欧美成人精品一区二区| 美女国产视频在线观看| 秋霞在线观看毛片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 搡老妇女老女人老熟妇| 黄色欧美视频在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 97热精品久久久久久| 赤兔流量卡办理| 久久中文看片网| 免费看日本二区| ponron亚洲| 欧美成人一区二区免费高清观看| 成人永久免费在线观看视频| 精品久久久久久久久av| 级片在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 欧美高清成人免费视频www| 国产男人的电影天堂91| 亚洲av电影不卡..在线观看| 此物有八面人人有两片| 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美人与善性xxx| 哪里可以看免费的av片| 精品久久久久久成人av| 日本五十路高清| 99久国产av精品国产电影| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品电影一区二区三区| 一区福利在线观看| 久久99热6这里只有精品| 国产精品一区二区性色av| 一区二区三区免费毛片| 国产精品国产高清国产av| 亚洲精品国产成人久久av| 国产色爽女视频免费观看| 看非洲黑人一级黄片| 午夜激情福利司机影院| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产精品久久久久久av不卡| 国产精品人妻久久久久久| 波多野结衣高清作品| av黄色大香蕉| av免费观看日本| 在线免费观看不下载黄p国产| 在线天堂最新版资源| av在线播放精品| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲无线在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 一本一本综合久久| 伦理电影大哥的女人| 97在线视频观看| 成人综合一区亚洲| 久久久久久久久久黄片| 亚洲图色成人| 久久精品国产自在天天线| 国产精品一二三区在线看| 12—13女人毛片做爰片一| 久久久久九九精品影院| 国内精品一区二区在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 中文字幕久久专区| 国产精品一及| 久久精品国产亚洲av天美| 91aial.com中文字幕在线观看| 51国产日韩欧美| 男的添女的下面高潮视频| 午夜精品在线福利| 人体艺术视频欧美日本| 好男人视频免费观看在线| 黄色一级大片看看| 一级二级三级毛片免费看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美精品国产亚洲| 在线播放国产精品三级| avwww免费| 亚洲精品456在线播放app| 2021天堂中文幕一二区在线观| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品一区二区性色av| 日本一二三区视频观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 中文字幕制服av| 黄片无遮挡物在线观看| 午夜激情福利司机影院| 波多野结衣高清无吗| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲最大成人手机在线| 小说图片视频综合网站| 一区二区三区免费毛片| 99视频精品全部免费 在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日本熟妇午夜| 欧美日韩乱码在线| 伦精品一区二区三区| 亚洲av一区综合| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美一区二区亚洲| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲18禁久久av| 国产色婷婷99| 99在线人妻在线中文字幕| 久久久久久久亚洲中文字幕| 在线免费观看的www视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 性色avwww在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 一本久久精品| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精华一区二区三区| 国产精品久久久久久久电影| 一本久久精品| 身体一侧抽搐| 国产老妇伦熟女老妇高清| av在线蜜桃| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 日韩精品青青久久久久久| 少妇人妻精品综合一区二区 | 一边亲一边摸免费视频| 国产av麻豆久久久久久久| 男女边吃奶边做爰视频| 少妇的逼水好多| 成人特级av手机在线观看| 18+在线观看网站| 免费大片18禁| 日韩国内少妇激情av| 卡戴珊不雅视频在线播放| 女同久久另类99精品国产91| 日韩高清综合在线| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品嫩草影院av在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 久久人人爽人人片av| 久久人人精品亚洲av| 又爽又黄无遮挡网站| 精华霜和精华液先用哪个| 成年av动漫网址| 亚洲综合色惰| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久久久久久久久黄片| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 日韩成人伦理影院| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| videossex国产| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产一区二区在线av高清观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产成人福利小说| 午夜久久久久精精品| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产乱人偷精品视频| 精品一区二区免费观看| 99热这里只有是精品50| 亚洲自偷自拍三级| 国产91av在线免费观看| av天堂在线播放| 女的被弄到高潮叫床怎么办|