2型糖尿病腎病患者腎組織中Snail、MYH9的表達(dá)及意義

王晴，韓鴻玲(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052)

2型糖尿病腎病患者腎組織中Snail、MYH9的表達(dá)及意義

王晴，韓鴻玲
(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052)

摘要:目的觀察鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)、非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA(MYH9)在2型糖尿病腎病(DN)患者腎活檢組織中的表達(dá)，探討DN的發(fā)病機(jī)制。方法收集DN腎組織標(biāo)本32例(DN組)和非DN行腎活檢的正常腎組織標(biāo)本10例(對(duì)照組)，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)兩組腎組織中Snail、MYH9的表達(dá)。結(jié)果Snail陽性染色見于DN組和對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞，其相對(duì)表達(dá)量前者高于后者(P＜0.05) ; MYH9陽性染色見于DN組腎小球足細(xì)胞和腎小管，對(duì)照組未見陽性表達(dá); DN組纖維化的腎小球、腎小管中未見Snail、MYH9陽性表達(dá)。結(jié)論Snail、MYH9在DN患者腎組織中表達(dá)增加，提示Snail、MYH9可能參與了DN的發(fā)生發(fā)展過程。

關(guān)鍵詞:糖尿病腎病;鋅指轉(zhuǎn)錄因子;非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA;免疫組織化學(xué)

近年來研究發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)在2型糖尿病腎病患者腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著不容忽視的作用［1］。Snail屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail超家族成員，Snail基因在正常胚胎發(fā)育和腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的EMT中起重要作用［2］。非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA (MYH9)主要表達(dá)于近曲小管、腎小球足細(xì)胞和系膜細(xì)胞［3］，其在腎組織中異常表達(dá)、定位或功能改變都會(huì)導(dǎo)致肌球蛋白異常，使得足細(xì)胞和腎小管的細(xì)胞骨架受損，進(jìn)而發(fā)生EMT［4］。作為調(diào)節(jié)EMT關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，Snail、MYH9是否參與2型糖尿病腎病的發(fā)病報(bào)道較少。本研究觀察2型糖尿病腎病患者腎組織中Snail、MYH9的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集2008年8月～2013年3月經(jīng)臨床和病理學(xué)檢查確診的2型糖尿病腎病患者的腎組織標(biāo)本32例(DN組)，男18例、女14例，年齡22 ～73(45.2±12.0)歲，體質(zhì)量指數(shù)19.0～24.9 (23.2±4.0) kg/m2，空腹血糖4.0～6.7(5.2± 0.7) mmol/L，血肌酐32～70(56.1±8.8)μmol/L。同期選擇行腎活檢非糖尿病腎病患者的正常腎組織標(biāo)本10例(對(duì)照組)，男4例、女6例，年齡23～55 (37.5±9.4)歲，體質(zhì)量指數(shù)18.5～24.7(23.0± 5.6) kg/m2，空腹血糖3.5～5.8(4.8±0.7) mmol/L，血肌酐39～68(54.7±10.0)μmol/L。兩組均排除嚴(yán)重感染、心肝肺腦疾病及嚴(yán)重糖尿病代謝紊亂者。兩組性別、年齡構(gòu)成、體質(zhì)量指數(shù)、空腹血糖等比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。

1.2Snail、MYH9檢測(cè)全部標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定、乙醇逐級(jí)脫水、二甲苯透明處理后石蠟包埋，制成4 μm厚組織切片。采用免疫組化SP法。將石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，PBS沖洗3×5 min，過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3×5 min，微波熱修復(fù)抗原，冷卻至室溫后PBS沖洗3×5 min，正常山羊血清室溫下封閉30 min，分別滴加一抗抗體Snail(1∶250)、MYH9(1∶75)，4℃過夜，次日晨恢復(fù)至室溫，PBS沖洗3×5 min，滴加過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，置于濕盒中37℃下孵育30 min，PBS沖洗3×5 min，二氨基聯(lián)苯胺對(duì)比染色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用PBS代替一抗做空白對(duì)照。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，每張切片隨機(jī)讀取10個(gè)不重疊含完整腎小球的視野，用Image-Pro Plus 5.1拍照存檔并進(jìn)行定量分析。將切片染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞數(shù)量轉(zhuǎn)化成累積光密度(IOD)值，IOD值越大提示免疫反應(yīng)越強(qiáng)，取其均值表示Snail、MYH9在腎組織中的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用珋x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組Snail表達(dá)比較Snail在DN組、對(duì)照組中均表達(dá)，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞核，腎小球足細(xì)胞中有少量表達(dá)。DN組中Snail的相對(duì)表達(dá)量(81 130.06±14 697.45)顯著高于對(duì)照組(2 167.60±300.01) (P＜0.05)。

2.2兩組MYH9表達(dá)比較MYH9在DN組中表達(dá)，主要表達(dá)于腎小球足細(xì)胞、腎小管。對(duì)照組上述部位均無MYH9表達(dá)。DN組腎組織中MYH9的相對(duì)表達(dá)量(9 441.05±4.78)顯著高于對(duì)照組(33.84 ±4.04) (P＜0.05)。

2.3DM組纖維化腎組織中Snail、MYH9的表達(dá)Snail、MYH9在萎縮的腎小管中表達(dá)量明顯降低，甚至不表達(dá);在纖維化的腎小球、腎間質(zhì)中不表達(dá)。

3　討論

2型糖尿病腎病患者腎臟病理變化包括細(xì)胞外基質(zhì)積聚、基底膜增厚、系膜基質(zhì)增加，最終發(fā)展成腎小球硬化、小管間質(zhì)單核細(xì)胞浸潤和纖維化［5］。腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化是2型糖尿病腎病發(fā)展至終末期腎臟病的重要形態(tài)特征;腎小管間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度與2型糖尿病腎病病情進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)。在腎臟損傷過程中，多種因子可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞肌成纖維細(xì)胞，引起腎小管缺失與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積，這一過程稱為EMT［6，7］。研究證實(shí)EMT在腎小管間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮重要作用［8］。

Snail是調(diào)節(jié)EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其直接作用的靶基因?yàn)镋-cadherin。Snail主要以鋅指區(qū)域與E-cadherin啟動(dòng)子上的E-box序列結(jié)合，抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄，使上皮細(xì)胞間喪失緊密黏附性，觸發(fā)EMT［9］。本研究發(fā)現(xiàn)正常腎組織腎小管上皮細(xì)胞中Snail少量表達(dá)，而2型糖尿病腎病患者腎小管上皮細(xì)胞Snail表達(dá)明顯增加，腎小球組織中亦有少量表達(dá);且隨著疾病進(jìn)展，腎小球、腎小管纖維化后Snail不再表達(dá)，提示Snail促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞EMT，參與了糖尿病患者腎損傷的病理過程，與Ohnuki等［10］研究結(jié)果一致。當(dāng)足細(xì)胞受到損傷時(shí)可以發(fā)生EMT［11］; Zhang等［12］的研究也證實(shí)，2型糖尿病腎病患者足細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)顯著下降，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA及Snail表達(dá)上調(diào)，說明足細(xì)胞發(fā)生了EMT。因此推測(cè)Snail同時(shí)參與腎小球、腎小管病變，促進(jìn)EMT，從而導(dǎo)致2型糖尿病腎病。

MYH9是由MYH9基因編碼的蛋白，在腎組織中異常表達(dá)、定位或功能改變都會(huì)導(dǎo)致肌球蛋白異常，使得足細(xì)胞和腎小管的細(xì)胞骨架受損，進(jìn)而發(fā)生EMT，導(dǎo)致患者出現(xiàn)蛋白尿、血尿、腎衰竭［4］。當(dāng)足細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，其上皮細(xì)胞樣表型標(biāo)記物表達(dá)下調(diào)，而間充質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)正常腎組織中MYH9不表達(dá)，2型糖尿病腎病患者腎組織中MYH9表達(dá)增加，主要表達(dá)于腎小球足細(xì)胞、腎小管;隨著2型糖尿病腎病病情進(jìn)展，腎組織纖維化后MYH9表達(dá)消失。Ghiggeri等［14］研究發(fā)現(xiàn)個(gè)體MYH9基因突變，在電鏡下表現(xiàn)為局灶足細(xì)胞足突消失，足細(xì)胞裂孔隔膜缺失，提示MYH9基因突變可引起局部腎小球足突融合，足細(xì)胞裂孔膜消失、腎小管骨架受損，誘發(fā)EMT，從而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。

綜上所述，Snail、MYH9在2型糖尿病腎病患者腎組織中表達(dá)增加，而在纖維化的腎小球、腎小管中不表達(dá)。Snail、MYH9可能通過誘發(fā)EMT參與2型糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化。

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(收稿日期:2014-12-12)

通信作者:韓鴻玲

文章編號(hào):1002-266X(2015)21-0035-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號(hào):R587.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.013