枯草芽孢桿菌OKB05菌株不同培養(yǎng)基發(fā)酵上清液的殺線活性

夏彥飛 +鄭偉 蘇盼盼 喬俊卿 王建華 黃曉博

摘要：采用室內(nèi)離體測(cè)定方法，測(cè)試枯草芽孢桿菌OKB05菌株在不同培養(yǎng)基（Landy、LB、λ肉湯、TY、超級(jí)肉湯、胰化蛋白胨肉湯、TYGN、A、M63、M9）的發(fā)酵濾液中對(duì)植物寄生線蟲(chóng)[南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita） 2齡幼蟲(chóng)、程氏傘滑刃線蟲(chóng)（Bursaphelenchus chengi）、豆傘滑刃線蟲(chóng)（B doui）、擬松材線蟲(chóng)（B mucronatus）]的生物活性，以期獲得具有較高防效的發(fā)酵培養(yǎng)基。結(jié)果表明：OKB05菌株的培養(yǎng)濾液分別處理植物寄生線蟲(chóng)6 h后，對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)防效較佳的發(fā)酵培養(yǎng)基是TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯、超級(jí)肉湯等6個(gè)培養(yǎng)基；對(duì)豆傘滑刃線蟲(chóng)防效較佳的是TYGN和TY 等2個(gè)培養(yǎng)基；對(duì)豆傘滑刃線蟲(chóng)、擬松材線蟲(chóng)防效最佳的是TYGN培養(yǎng)基；OKB05菌株TYGN培養(yǎng)基發(fā)酵上清液對(duì)4種標(biāo)靶線蟲(chóng)都具有較強(qiáng)的拮抗性。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；植物寄生線蟲(chóng)；培養(yǎng)基；發(fā)酵濾液；殺線活性；拮抗性

中圖分類號(hào)： S43245文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：002-302（204）2-044-04

物防治研究。Tel：（0379）64282345；E-mail：xyfwcc@63com。

[ZK）]

植物寄生線蟲(chóng)分布廣，寄主多，是危害農(nóng)作物的主要病原生物之一，每年給主要農(nóng)作物造成的損失高達(dá) 250億美元，同時(shí)它能使真菌和細(xì)菌易侵染植物，也是誘發(fā)植物病害的重要原因之一。化學(xué)防治植物寄生線蟲(chóng)具有防效好、見(jiàn)效快的特點(diǎn)，但是不可避免地污染了自然環(huán)境，因此生物防治越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注[2]。利用細(xì)菌生防植物寄生線蟲(chóng)是當(dāng)今新的研究熱點(diǎn)，各種各樣的細(xì)菌從寄主植物、線蟲(chóng)體、線蟲(chóng)的卵、土壤中被分離，其不同的作用方式已被報(bào)道[3-7]。芽孢桿菌（Bacillus spp）能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑的內(nèi)生孢子，是理想的生防菌篩選對(duì)象[8]。關(guān)于芽孢桿菌防治線蟲(chóng)的研究，國(guó)內(nèi)外已有大量的報(bào)道[9-5]。本研究通過(guò)室內(nèi)離體試驗(yàn)對(duì)枯草芽孢桿菌（B subtilis）OKB05菌株在不同培養(yǎng)基上的發(fā)酵上清液對(duì)4種植物寄生線蟲(chóng)[南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）、擬松材線蟲(chóng)（Bursaphelenchus mucronatus）、豆傘滑刃線蟲(chóng)（B doui）、程氏傘滑刃線蟲(chóng)（B chengi）]的防效進(jìn)行評(píng)估。

材料與方法

供試菌種和線蟲(chóng)

枯草芽孢桿菌OKB05菌株、南方根結(jié)線蟲(chóng)、擬松材線蟲(chóng)、豆傘刃線蟲(chóng)、程氏傘滑刃線蟲(chóng)，均保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。

2培養(yǎng)基

本研究中所用的培養(yǎng)基為DA、Landy、LB、λ肉湯、TY、超級(jí)肉湯、胰化蛋白胨肉湯、TYGN、A、M63、M9。DA和Landy的配制分別參考文獻(xiàn)[6-7]，其余培養(yǎng)基的配制參考文獻(xiàn)[8]。

3供試線蟲(chóng)的培養(yǎng)和分離

擬松材線蟲(chóng)、豆傘滑刃線蟲(chóng)、程氏傘滑刃線蟲(chóng)接種在灰葡萄孢（Botrytis cinerea）上，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)7～ 20 d，轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱備用。南方根結(jié)線蟲(chóng)的卵塊接種在感病番茄上，放置于溫室中培養(yǎng)50 d左右，然后從番茄根部挑取卵塊，卵塊用3% H2O2表面消毒8 min，再用ddH2O清洗3次后置于4 ℃冰箱中備用。采用貝曼漏斗法分離4種培養(yǎng)好的線蟲(chóng)。收集好的線蟲(chóng)先用3% H2O2表面消毒 5 min，然后再用ddH2O清洗3次，此時(shí)得到的線蟲(chóng)即為試驗(yàn)所用線蟲(chóng)。

4殺線物質(zhì)的制備

將甘油保存的OKB05菌株在LB平板上劃線，37 ℃過(guò)夜活化培養(yǎng)；用滅菌牙簽挑取單菌落于LB液體中培養(yǎng)過(guò)夜，37 ℃，200 r/min；第2天按3%的接種量吸取6 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，分別接種至200 mL 的Landy、LB、TY、超級(jí)肉湯、胰化蛋白胨肉湯、TYGN、A、M63、M9、λ肉湯等0種培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃ 0 000 r/min離心5 min，收集上清液。

5室內(nèi)離體試驗(yàn)

吸取發(fā)酵后的培養(yǎng)濾液原液2 mL至直徑為6 cm的滅菌表面皿中，挑入50頭表面消過(guò)毒的線蟲(chóng)，再將該表面皿置于滅過(guò)菌的醫(yī)用鋁盒中，放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，以ddH2O、沒(méi)有接種細(xì)菌的培養(yǎng)基作對(duì)照，分別在6、2、24、36 h觀察線蟲(chóng)的死亡情況。在解剖鏡下觀察并記錄線蟲(chóng)的死亡數(shù)量，線蟲(chóng)用挑針觸碰，如果不動(dòng)，則認(rèn)定線蟲(chóng)死亡[9]。

6數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

2OKB05菌株在不同培養(yǎng)基上的發(fā)酵上清液對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)殺線活性的測(cè)定

表表明，處理后6 h，TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯、超級(jí)肉湯、λ肉湯等7個(gè)培養(yǎng)基的發(fā)酵濾液的殺線率與M63、M9、A以及對(duì)照差異顯著；TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯、超級(jí)肉湯等6個(gè)培養(yǎng)基發(fā)酵上清液的殺線率都達(dá)到了98%以上，與λ肉湯培養(yǎng)基的殺線率（8392%）差異顯著。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，2 h后TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯、超級(jí)肉湯、λ肉湯等7個(gè)培養(yǎng)基的處理殺線率都達(dá)到了00%，與A、M9、M63及對(duì)照差異顯著。因此，在后續(xù)的研究中僅選擇TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯和λ肉湯6種培養(yǎng)基對(duì)OKB05菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，驗(yàn)證其發(fā)酵上清液對(duì)其他植物寄生線蟲(chóng)的殺線率。[FL）]

[FK（W5][HT6H][Z][WTHZ]表OKB05菌株不同培養(yǎng)基發(fā)酵上清液對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)殺線率的影響[WTBZ][HTSS][STBZ]

[H5][BG（！][BHDFG3，WK2，WK48W]培養(yǎng)基[ZB（][BHDWG2，WK48W]殺線率（%）endprint

[BHDWG2，WK2。4W]6 h2 h24 h36 h[ZB）W]

[BHDG2，WK2ZQ2，WK2。4W]TYGN0000±000a0000±000a0000±000a0000±000a

[BHDW]LB0000±000a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]LANDY0000±000a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]TY987±28a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]胰化蛋白胨肉湯9856±50a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]超級(jí)肉湯9857±33a0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]λ肉湯8392±054b0000±000a0000±000a0000±000a

[BH]A056±096c26±046b705±33b95±2b

[BH]M9056±096c2±7b467±53c62±33c

[BH]M63000±000c6±086b342±052d60±258c

[BH]ddH2O2（CK）000±000c000±000c000±000f000±000d

[BH]空白（CK2）000±000c000±000c000±000f000±000d[H][BG）F]

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著（<005）。[FK）]

[FL（2K2]22OKB05菌株在6種不同培養(yǎng)基上的發(fā)酵上清液對(duì)擬松材線蟲(chóng)、豆傘滑刃線蟲(chóng)、程氏傘滑刃線蟲(chóng)殺線活性的測(cè)定

表2顯示，用OKB05菌株在6種培養(yǎng)基上的發(fā)酵上清液分別處理程氏傘滑刃線蟲(chóng)6 h 后，TYGN和TY等 2個(gè)培養(yǎng)基處理防效最佳，殺線率達(dá)00%，與其他4種培養(yǎng)基處理差異顯著；其次是超級(jí)肉湯培養(yǎng)基處理，殺線率為905%，防效較差的是胰化蛋白胨肉湯、LANDY培養(yǎng)基，殺線率分別為658%、5900%，兩者之間差異不顯著。處理2 h后，超級(jí)肉湯、LB等2個(gè)培養(yǎng)基的殺線率也都達(dá)到了00%，TYGN、TY 、超級(jí)肉湯、LB 等4個(gè)培養(yǎng)基差異不顯著，與胰化蛋白胨肉湯、LANDY 培養(yǎng)基差異顯著。至36 h，LANDY培養(yǎng)基與其他5個(gè)培養(yǎng)基之間仍然差異顯著。在所有的處理時(shí)間段，各個(gè)培養(yǎng)基都與對(duì)照差異顯著。可見(jiàn)用OKB05菌株在TYGN和TY 等2個(gè)培養(yǎng)基的發(fā)酵濾液處理程氏傘滑刃線蟲(chóng)的防效最佳，6 h后線蟲(chóng)的死亡率就達(dá)到了00%。

用TYGN、LB、TY、LANDY、超級(jí)肉湯、胰化蛋白胨肉湯等6個(gè)培養(yǎng)基的培養(yǎng)濾液分別處理豆傘滑刃線蟲(chóng)6 h后，線蟲(chóng)的死亡率分別為8542%、5582%、3857%、3385%、242%、52%，6個(gè)培養(yǎng)基中除了TY和LANDY 等2個(gè)培養(yǎng)基之間差異不顯著外，其余培養(yǎng)基之間差異顯著（表2）。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的線蟲(chóng)死亡率增加，其顯著性差異也出現(xiàn)變化，處理2 h后殺線率最高的是TYGN培養(yǎng)濾液，為9248%，與其余5個(gè)培養(yǎng)基差異顯著；處理24 h后，TYGN、TY、胰化蛋白胨肉湯的培養(yǎng)濾液之間差異不顯著，殺線率分別為00%、00%、9733%，但與其他3個(gè)培養(yǎng)基之間差異顯著；處理36 h后，6個(gè)培養(yǎng)基的殺線率都達(dá)到了92% 以上，其中LANDY、超級(jí)肉湯2個(gè)培養(yǎng)基之間差異不顯著，但與其余4個(gè)培養(yǎng)基之間差異顯著，這4個(gè)培養(yǎng)基之間差異不顯著。在所有的處理時(shí)間段，各個(gè)培養(yǎng)基都與對(duì)照差異顯著。綜合比較結(jié)果表明，對(duì)豆傘滑刃線蟲(chóng)具有最佳防效的發(fā)酵培養(yǎng)基是TYGN培養(yǎng)基。

表2還顯示，對(duì)擬松材線蟲(chóng)處理6 h后，防效最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基是TYGN培養(yǎng)基，殺線率為604%，與其他培養(yǎng)濾液之間差異顯著。TYGN培養(yǎng)基的線蟲(chóng)在處理2、24 h后，線蟲(chóng)死亡率分別為9575%、00%，在相同的時(shí)間段與其余培養(yǎng)基進(jìn)行比較同樣發(fā)現(xiàn)差異顯著。處理36 h后，LB、超級(jí)肉湯、胰化蛋白胨肉湯、TY等4個(gè)培養(yǎng)濾液的殺線率也達(dá)到了00%，LANDY培養(yǎng)基處理的殺線率為820%，與其他5個(gè)培養(yǎng)基差異顯著。在4個(gè)處理時(shí)間段中除了在6 h，超級(jí)肉湯、胰化蛋白胨肉湯、TY等3個(gè)培養(yǎng)基與對(duì)照差異不顯著之外，其他的各個(gè)培養(yǎng)基都與對(duì)照差異顯著。結(jié)果表明，拮抗擬松材線蟲(chóng)的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基是TYGN培養(yǎng)基。

南方根結(jié)線蟲(chóng)和程氏傘滑刃線蟲(chóng)對(duì)OKB05菌株的發(fā)酵上清液較敏感，處理6 h后殺線率均為00%，豆傘滑刃線蟲(chóng)為8542%、擬松材線蟲(chóng)為604%，OKB05菌株在TYGN培養(yǎng)基上的發(fā)酵上清液對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)和程氏傘滑刃線蟲(chóng)殺線率差異不顯著，其余差異顯著；處理后24 h，4種線蟲(chóng)的死亡率都達(dá)到了00%，且差異不顯著。在不同的處理時(shí)間內(nèi)，OKB05菌株的處理與對(duì)照差異顯著。結(jié)果表明[CM（25]：OKB05菌株TYGN培養(yǎng)基發(fā)酵濾液處理對(duì)4種植物寄[CM）]

3結(jié)論與討論

植物根圍促生細(xì)菌（plant growth-promoting rhizobacteria，GR）不僅可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，還可以防治根結(jié)線蟲(chóng)病、青枯病、疫病和黃萎病等，成為近幾年興起的新的研究熱點(diǎn)[20-23]。芽孢桿菌屬是GR中極具應(yīng)用潛力的線蟲(chóng)生防資源，其防治線蟲(chóng)病的研究也取得了很大的進(jìn)展[24-26]。本研究結(jié)果表明，OKB05菌株在0種不同培養(yǎng)基濾液中都對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)有一定的拮抗作用，但是防效有差異，其中TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯、超級(jí)肉湯6個(gè)培養(yǎng)基發(fā)酵上清液的處理防效較佳，處理2 h后殺線率達(dá)到了00%，出現(xiàn)該現(xiàn)象可能是因?yàn)樵诓煌呐囵B(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，OKB05菌株產(chǎn)生的殺線蟲(chóng)活性物質(zhì)成分不同，或者活性物質(zhì)的含量有差異造成的。

TYGN、LB、LANDY、TY、胰化蛋白胨肉湯、超級(jí)肉湯6個(gè)培養(yǎng)基發(fā)酵濾液進(jìn)一步來(lái)處理程氏傘滑刃線蟲(chóng)、豆傘滑刃線蟲(chóng)、擬松材線蟲(chóng) 3種植物寄生線蟲(chóng)，結(jié)果表明，3種植物寄生線蟲(chóng)對(duì)6種OKB05菌株的培養(yǎng)濾液敏感程度不一致，其中在處理程氏傘滑刃線蟲(chóng)、豆傘滑刃線蟲(chóng)、擬松材線蟲(chóng)6 h后的最佳防效培養(yǎng)基分別是TYGN和TY、TYGN、TYGN，其殺線率分別為00%、8542%、604%，當(dāng)然隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，殺線率也逐漸增加，其處理之間的差異性也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的變化。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了前面的推測(cè)。OKB05菌株在TYGN培養(yǎng)基上的發(fā)酵上清液對(duì)4種標(biāo)靶線蟲(chóng)都表現(xiàn)了較佳的防治效果，但拮抗能力有差異，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于不同種的線蟲(chóng)在抗逆性、敏感性、寄生方式以及蟲(chóng)體的結(jié)構(gòu)等方面的差異造成的。endprint

本研究為以后生防細(xì)菌的篩選以及如何選擇合適的培養(yǎng)基提供了理論基礎(chǔ)，并為下一步對(duì)枯草芽孢桿菌OKB05菌株生防制劑的開(kāi)發(fā)和利用以及殺線活性物質(zhì)的分離、鑒定、結(jié)構(gòu)分析奠定了基礎(chǔ)。

[HS2][HT85H]參考文獻(xiàn)：[HT8SS]

[ZK（#]Oka Y，Koltai H，Bar-Eyal M，et al New strategies for the control of plant-parasitic nematodes est Management Science，2000，56（）：983-988

[2]Schneider S M，Rosskopf E N，Leesch G，et al Research on alternatives to methyl bromide：pre-plant and post-harvest est Manag Sci，2003，59：84-826

[3]Stirling G R Biological control of plant parasitic nematode：progress，problems and prospects[M] Wallington：CAB International，99

[4][2]Siddiqui Z A，Mahmood I Role of bacteria in the management of plant parasitic nematodes Bioresource Technol，999，69：67-79

[5]Kerry B R Rhizosphere interactions and exploitation of microbial agents for the biological control of plant-parasitic nematodes Annu Rev hytopathol，2000，38：423-44

[6][2]Meyer S L F United States department of agriculture-agricultural research service research programs on microbes for management of plant-parasitic nematodes est Manag Sci，2003，59：665-670

[7]Tian B Y，Yang K，Zhang K QBacteria used in the biological control of plant-parasitic nematodes：populations，mechanisms of action，and future prospects FEMS Microbiol Ecol，2007，6：97-23

[8]Obagwu ，Korsten L Integrated control of citrus green and blue molds using Bacillus subtilis in combination with sodium bicarbonate or hot water ostharvest Biology and Technology，2003，28（）：87-94

[9]Niu Q H，Huang X W，Tian B Y，et al Bacillus sp B6 kills nematodes with a serine protease identified as a pathogenic factor Applied Microbiology and Biotechnology，2006，69（6）：722-730[ZK）]

[0][ZK（#]Niu Q H，Huang X W，Zhang L，et al A Trojan horse mechanism of bacterial pathogenesis against nematodes roceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，200，07（38）：663-6636

Chen Z X，Dickson D W Review of pasteuria penetrans：biology，ecology，and biological control potential ournal of Nematology，998，30（3）：33-340

[2]Xiao T ，Chen F，Gao C，et al Bacillus cereus X5 enhanced bio-organic fertilizers effectively control root-knot nematodes（Meloidogyne sp） edosphere，203，23（2）：60-68

[3]Xia Y F，Xie S S，Ma X，et al The purL gene of Bacillus subtilisis associated with nematici- dal activity FEMS Microbiol Lett，20，322：99-07

[4]丁國(guó)春，付鵬，李紅梅，等 枯草芽孢桿菌AR菌株對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的生物防治南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28（2）：46-49

[5]朱麗梅，吳小芹，陳江天，等 一株毒殺松材線蟲(chóng)的解淀粉芽孢桿菌活性物質(zhì)的基本性質(zhì)中國(guó)生物防治，2009，25（4）：359-363

[6]許志剛 普通植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]北京：農(nóng)業(yè)出版社，993：62-65endprint

[7]Landy M，Warren G H，Roseman S B Bacillomycin，an antibiotic from Bacillus subtilis active against pathogenic fungi roc Soc Exp Biol Med，948，67：539-54

[8]Ausubel F M 精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M]顏?zhàn)臃f，王海林，譯北京：科學(xué)出版社，998：2-3

[9]Huang X W，Tian B Y，Niu Q H，et al An extracellular protease from Brevibacillus laterosporus G4 without parasporal crystals can serve as a pathogenic factor in infection of nematodes Research in Microbiology，2005，56（5/6）：79-727

[20]Ali N I，Siddiqui I A，Shaukat S S，et al Nematicidal activity of some strains of seudomonas spp Soil Biology & Biochemistry，2002，34：05-058

[2]Guo H，Qi H Y，Guo Y H，et al Biocontrol of tomato wilt by plant growth-promoting rhizobacteria Biological Control，2004，29：66-72

[22]Siddiqui Z A GR：biocontrol and biofertilization[M] New York：Springer，2005：-42

[23]Wang S，Wu H ，Zhan ，et al The role of synergistic action and molecular mechanism in the effect of genetically engineered strain Bacillus subtilis OKBHF in enhancing tomato growth and cucumber mosaic virus resistance Bio Control，20，56（）：3-2

[24]Li B，Xie G L，Soad A，et al Suppression of Meloidogyne javanica by antagonistic and plant growth-promoting rhizobacteria Zhejiang Univ Sci，2005，6（6）：496-50

[25]田寶玉，黃薇，江賢章，等 植物寄生線蟲(chóng)生防細(xì)菌及其作用機(jī)制研究生物技術(shù)，2009，9（4）：90-93endprint