烏頭堿抗血清制備與鑒定

郭方超 肖文華 崔平福 王永娟

摘要：通過(guò)活性酯法將小分子的烏頭堿（ACO偶聯(lián)到牛血清白蛋白（BSA、雞卵清白蛋白（OVA上，形成偶聯(lián)物ACO-BSA、ACO-OVA。以ACO-BSA為免疫原，ACO-OVA為檢測(cè)原，通過(guò)ELISA法檢測(cè)ACO-BSA免疫鼠血清效價(jià)，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)抗體特異性、最低檢測(cè)限。結(jié)果表明，免疫原和檢測(cè)原均偶聯(lián)成功，血清效價(jià)均大于 12 800。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明，所獲抗體對(duì)ACO特異性強(qiáng)，最低檢出限為1 ng/mL，IC50值為30 ng/mL，檢測(cè)范圍為1～6 μg/mL。

關(guān)鍵詞：烏頭堿；活性酯法；完全抗原；抗血清；牛血清白蛋白；雞卵清白蛋白

中圖分類號(hào)： S8544+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（201412-0336-03[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-04-28

基金項(xiàng)目：江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院重點(diǎn)支持項(xiàng)目（編號(hào)：NSFD1305、D1204。

作者簡(jiǎn)介：郭方超（1982—，男，江蘇徐州人，實(shí)驗(yàn)員，從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail：445785442@qqcom。

通信作者：王永娟，博士，副教授，從事動(dòng)物疫病防控研究。E-mail：43088591@qqcom。

烏頭堿（aconitine，ACO是存在于川烏、草烏、附子等植物中的主要有毒成分，也是發(fā)揮部分藥效的主要有效成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，烏頭類有毒中藥如烏頭、附子具有多種藥理作用，主要表現(xiàn)為強(qiáng)心抗休克、抗心律失常、抑制呼吸中樞等[1-2]。ACO在強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等方面已顯示了良好的療效。烏頭堿的毒性經(jīng)過(guò)炮制后會(huì)大大降低，然而臨床上經(jīng)常出現(xiàn)因炮制不當(dāng)或服用過(guò)量導(dǎo)致患者中毒死亡的報(bào)道，一般認(rèn)為口服烏頭堿02 mg 即可引起中毒，2以上則有致死性。 為了保障ACO制劑的質(zhì)量及用藥安全，必須對(duì)ACO限量進(jìn)行測(cè)定。精準(zhǔn)把控烏頭屬中藥材應(yīng)用時(shí)的療效與安全性，精確快速檢測(cè)藥物或生物材料中ACO的含量，一直是烏頭屬中藥材研究的難點(diǎn)。本試驗(yàn)對(duì)ACO完全抗原的合成條件進(jìn)行了研究，旨在為ACO快速定量檢測(cè)試劑盒開發(fā)提供依據(jù)。

1材料與方法

11材料

牛血清白蛋白（BSA、卵清白蛋白（OVA、1-（3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC、二甲基甲酰胺（DMF、N-羥基琥珀酰亞胺 （NHS、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購(gòu)于Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；烏頭堿（ACO樣品購(gòu)自成都瑞芬斯生物科技有限公司；96孔可拆酶標(biāo)板、低溫高速離心機(jī)、U-2901型紫外、可見及近紅外分光光度計(jì)均購(gòu)自日本HITACHI公司；ELX800型酶標(biāo)儀、ELX50型自動(dòng)洗板機(jī)均購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；超純水制備儀購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；Balb/C雌性小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

12完全抗原制備與鑒定

121完全抗原的合成

采用改進(jìn)后的N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法[4-5]，分別合成免疫原ACO-BSA、包被抗原 ACO-OVA。精確稱取 10 mg ACO標(biāo)準(zhǔn)品、5 mg NHS、5 mg EDC充分溶解于1 mL DMF及200 μL雙蒸水中，室溫下避光攪拌，過(guò)夜反應(yīng)得恩諾沙星的反應(yīng)液A，按此法再制得第2份反應(yīng)液A；精確稱取 25 mg BSA溶于3 mL PBS（pH值為 74中，另稱取18 mg OVA溶于3 mL PBS（pH值為 74中，此溶液為B液。將上述反應(yīng)液A逐滴加入B中，要求每5 min～10 加入200 μL，15 h內(nèi)操作完畢。用透析袋、離心機(jī)初步純化完全抗原。

122 偶聯(lián)抗原濃度測(cè)定與鑒定 配制不同濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品，BCA法測(cè)定吸光度并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；進(jìn)而測(cè)定合成的偶聯(lián)抗原濃度。同時(shí)，以PBS為空白，采用紫外光譜掃描，波長(zhǎng)范圍為230～300 nm，檢測(cè)偶聯(lián)情況。

13 動(dòng)物免疫

對(duì)6～8周齡小鼠隨機(jī)多點(diǎn)注射ACO-BSA，每只 05 mL，每2周免疫1次，共免疫5次。首次免疫使用等量弗氏完全佐劑乳化抗原，之后3次加強(qiáng)免疫時(shí)免疫原與弗氏不完全佐劑乳化；第3次加強(qiáng)免疫4 d后，眼眶靜脈采血，ELISA方法檢測(cè)小鼠免疫血清效價(jià)。選擇血清效價(jià)高且敏感性好的小鼠進(jìn)行沖擊免疫，免疫途徑為腹腔注射，劑量為初免劑量（不加弗氏佐劑）。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照小鼠。

14血清效價(jià)檢測(cè)

每孔包被005 mg/mL ACO-OVA 100 μL，試驗(yàn)組血清抗體從1 ∶[G-3]100開始倍比稀釋，采用間接ELISA方法檢測(cè)血清效價(jià)最高的小鼠。

15ACO-OVA最佳工作濃度確定

包被抗原ACO-OVA從20 μg/mL開始倍比稀釋，免疫血清從1 ∶[G-3]100開始倍比稀釋，按間接ELISA操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)。以抗體稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，D450 nm值為縱坐標(biāo)作曲線，考察不同包被抗原濃度曲線的平滑度。以D450 nm值為10左右對(duì)應(yīng)的抗原濃度作為最佳包被濃度。

16抗體敏感性測(cè)定（Ci-ELISA法

配制一系列濃度的ACO標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為競(jìng)爭(zhēng)品，血清抗體濃度按上面步驟確定的抗體最佳工作濃度。按間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法步驟進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算抑制率。

2結(jié)果與分析

21人工抗原紫外光譜鑒定

由圖1、圖2可知，偶聯(lián)抗原的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紫移，且ACO-OVA的全波長(zhǎng)掃描曲線與ACO、OVA曲線不同，說(shuō)明人工抗原合成成功，同理可以判定人工抗原ACO-BSA偶聯(lián)成功。

[F（W10][TPGFC1tif][F]

[F（W10][TPGFC2tif][F]

22偶聯(lián)比的計(jì)算

ACO與載體蛋白BSA、OVA偶聯(lián)比的計(jì)算公式如下[5]：

[HS2][J][SX（]nanb[SX]=[SX（]（DCam×DBbm-DBam×DCbm×Ca（DCbm×DAam-DAbm×DCam×Cb [SX]。

式中：na/nb為偶聯(lián)物中ACO與載體蛋白BSA或OVA偶聯(lián)的物質(zhì)的量比；DCam為偶聯(lián)物在ACO最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；DBbm為BSA或OVA在其最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；DBam為BSA或OVA在ACO最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；DCbm為偶聯(lián)物在BSA或OVA最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；DAam為ACO在其最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；DAbm為ACO在BSA或OVA最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；Ca為ACO標(biāo)準(zhǔn)物的濃度；Cb為BSA或OVA標(biāo)準(zhǔn)物的濃度。經(jīng)計(jì)算ACO與BSA的偶聯(lián)比為22 ∶[G-3]1，ACO與OVA的偶聯(lián)比為16 ∶[G-3]1。

23BCA法測(cè)定蛋白濃度

利用BCA法測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得ACO-BSA的濃度為 377 mg/mL，ACO-OVA的濃度為324 mg/mL（表1。

[F（W10][TPGFC3tif][F]

[F（W9][HT6H][J]表1合成抗原濃度測(cè)定[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W11，W9。2W]樣品編號(hào) 吸光度 濃度（mg/mL

[BHDG12]ACO-BSA-10713382

[BHDW]ACO-BSA-20691371

ACO-BSA平均值377

ACO-OVA-10623334

ACO-OVA-20586314

ACO-OVA平均值324[HJ][BG）F][F）]

24間接ELISA檢測(cè)血清效價(jià)

根據(jù)表2的數(shù)據(jù)，計(jì)算陽(yáng)性小鼠的血清效價(jià)，每個(gè)小鼠的血清效價(jià)均大于12 800，第5個(gè)小鼠的血清效價(jià)最高。判斷的標(biāo)準(zhǔn)為：P/N>21，且P>02，其中P=陽(yáng)性值-陰性值，N=陰性值-空白值。[FL]

[F（W+49mm][HT6H][J][WTH]表2Ci-ELISA血清效價(jià)檢測(cè)[WTB][HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W22/5，W573/5W]小鼠分組[B（][BHDWG12，W573/5W]吸光度[BHDWG12，W44/5。12W]列1列2列3列4列5列6列7列8列9列10陰性血清空白對(duì)照[BW]

[BHDG12，W22/5，W44/5。12W]A046304670489049004780460041203520301023501300020

[BHDW]B049104710491048804710444041603660299022501110022

C049204970499050104920472046104210394023901200024

D048204960506048804790477045504070389024101070022

E052705040498049104830468044903830412023101040025

F047304690483048304850448042303840325022401020021[HJ][BG）F]

注：列1、列2、列3、……、列10分別為稀釋100×20、100×101、100×102、……、100×109倍。[F]

[FL（22]25方陣滴定法選擇ACO-OVA包被吸光度濃度和抗血清的最佳工作濃度

由表3可知，最佳抗原包被濃度為25 μg/mL，對(duì)應(yīng)的抗體稀釋倍數(shù)為12 800。

26血清抗體敏感性測(cè)定

通過(guò)添加不同濃度ACO競(jìng)爭(zhēng)品，所得線性回歸方程y=-9016lnx+109223（r2=0992 7，IC50值為30 ng/mL，根[CM（25]據(jù)回歸公式計(jì)算，抗體對(duì)ACO的檢測(cè)范圍（IC20～I(xiàn)C80為[CM][FL]

[F（W12][HT6H][J][WTH]表3抗血清最佳工作濃度和ACO-OVA包被濃度測(cè)定[WTB][HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W5，W55W][JP3]ACO質(zhì)量濃度（μg/mL[B（][BHDWG12，W55W]吸光度[XXSX2-SX542]列1列2列3列4列5列6列7列8列9列10[BW]

[BHDG12，W5，W52。10DWW]203125302630982947295528252791279928130288

[BHDW]103056300829862871269525712431243324560144

53018295829722648233119551781169217210186

253047286728342214163812261063101809700234

1252975280124031491090507150641056107900180

06252857253718920977060904950375036604960229

03122452189010260598033902250186016201840214

01562129156309350451025902830241021002870252[HJ][BG）F]

注：列1、列2、列3、……、列10分別為稀釋100×20、100×101、100×102、……、100×109倍。[F]

[FL（22]1～6 μg/mL，最低檢測(cè)限為1 ng/mL。

3結(jié)論與討論

ACO是小分子化合物，只具有反應(yīng)原性，沒有免疫原性，只有在與大分子的載體蛋白偶聯(lián)后才成為完全抗原而具有免疫原性、反應(yīng)原性。據(jù)報(bào)道，BSA、OVA中分別有60、20個(gè)游離氨基[6]，有利于ACO與載體蛋白的偶聯(lián)作用。本試驗(yàn)采用改進(jìn)后的N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法，首先將ACO分子與EDC反應(yīng)活化羧基，過(guò)夜后，短時(shí)間內(nèi)緩慢加入蛋白反應(yīng)物，這樣可以減少蛋白質(zhì)間的交聯(lián)。偶聯(lián)抗原鑒定時(shí)，雖然SDS-PAGE技術(shù)是偶聯(lián)抗原常用的技術(shù)，但ACO分子量相對(duì)于BSA、OVA分子量而言較小，所以，不適宜用SDS-PAGE電泳分析，以通過(guò)遷移距離的變化來(lái)判斷偶聯(lián)是否成功。本試驗(yàn)選擇了人工抗原紫外光譜鑒定法，取得了很好的鑒定效果。基于抗體與抗原或半抗原之間的高度特異性及敏感性而建立起來(lái)的免疫分析法簡(jiǎn)單、快捷、經(jīng)濟(jì)，被廣泛應(yīng)用于生化檢測(cè)方面，在中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域鮮有報(bào)導(dǎo)。對(duì)于天然產(chǎn)物中含量低的物質(zhì)，定量分析比較困難，目前采用的HPLC法或LC-MS法對(duì)儀器要求很高，前期處理工作復(fù)雜，檢測(cè)靈敏度無(wú)法滿足痕量檢測(cè)的要求[7]。免疫分析法已逐步應(yīng)用到微量痕量中藥成分的定性定量分析、中藥成分的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究中。擁有特異性ACO抗體是免疫分析法檢測(cè)ACO的基礎(chǔ)，因此，制備具有免疫原性的ACO抗原對(duì)于ACO檢測(cè)具有重要意義。

[HS2][HT85H]參考文獻(xiàn)：[HT8SS]

[1][（#]陶長(zhǎng)戈，李文軍，彭成 烏頭堿在大鼠體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)研究[J] 湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（3：21-23

[2]楊姝，金振輝，羊曉東，等 烏頭屬植物的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J] 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，22（2：293-295，298

[3]王東青，張亞麗應(yīng)高度重視烏頭類中藥的毒副作用[J] 國(guó)醫(yī)論壇，2009，24（2：37-38

[4]Watanabe H，Satake A，ido Y，et al Monoclonal-based enzyme-linked immunosorbent assay and immunochromatographic assay for enrofloxacin in biological matrices[J] The Analyst，2002，127（1：98-103

[5]于洪俠，楊曙明 萊克多巴胺人工抗原的合成與鑒定[J] 中國(guó)獸醫(yī)科技，2005，35（12：1000-1003

[6]Hourwitz F The chemistry and function of protein[M] New York：Academic Press Inc，1963：190

[7]秦利芬，楊玉琴 不同采收期的附子中3種烏頭堿的含量比較[J] 微量元素與健康研究，2012，29（6：31-32[HJ][FL]

[F（H0267。54Q]更正：《江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)》2014年第42卷第8期169-171頁(yè)所刊論文《紫斑牡丹雜交授粉后胚珠的形態(tài)學(xué)觀察》，漏登了通信作者。該文通信作者為：鞠志新，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事觀賞植物教學(xué)與研究工作。E-mial：jilinju@126com。特此更正，并向作者和讀者致歉。