納米氧化鋅對小鼠B16黑素瘤細胞生長和分化的影響

周霞　許維岸　韓宏巖

摘要：為評價納米氧化鋅（nO NPs 在皮膚病治療和化妝品應(yīng)用方面的生理毒性，以小鼠B16黑素瘤細胞為細胞模型，研究15、30、90 nm下nO NPs對B16細胞的體外生長和分化的影響及其作用機制。以不加納米氧化鋅和加體相氧化鋅的處理分別作陰性、陽性對照。結(jié)果表明，15、30 nm，體相nO NPs處理與B16 細胞共培養(yǎng)作用 3 d，當(dāng)nO NPs 為 4 μg/mL以下時，nO NPs并未明顯抑制細胞生長，引起細胞死亡；當(dāng)nO NPs濃度大于8 μg/mL時，明顯抑制細胞生長。隨著nO NPs濃度增加，細胞體積變小，細胞間隙變大，黏附性降低，細胞變圓，從培養(yǎng)瓶底脫落死亡。nO NPs誘導(dǎo)細胞中酪氨酸酶（TYR、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TYRP-1、酪氨酸相關(guān)酶相關(guān)蛋白2（TYRP-2的 mRNA 表達量升高，導(dǎo)致細胞內(nèi)酪氨酸酶活性和黑色素生成水平增高，促進了B16黑素瘤細胞的分化。相同nO NPs濃度下，15 nm nO NPs比30、90 nm nO NPs作用明顯。

關(guān)鍵詞：納米氧化鋅；小鼠黑素瘤（B16細胞；酪氨酸酶；分化

中圖分類號： R3292+5文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0322-04[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-02-10

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：81071306）。

作者簡介：周霞（ 1986—，女，安徽安慶人，碩士研究生， 研究方向為動物生化及分子生物學(xué)。E-mail：464354529@qqcom。

通信作者：許維岸。E-mail：xuweian1964@foxmailcom。

納米氧化鋅（nO NPs由于其獨特性質(zhì)，在化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，其安全性研究是納米材料應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)[1-2]。常規(guī)尺度的氧化鋅毒性很低，研究表明，nO NPs 有較強的細胞毒性和體內(nèi)毒性，如nO NPs 對上皮細飽和成纖維細胞有明顯毒性，可對其造成活力喪失、膜損傷、氧化損傷、DNA損傷、炎癥反應(yīng)等[3-10]。nO NPs 對神經(jīng)細胞的毒性也已得到證實[11-12]，許多學(xué)者研究了nO NPs 對微生物的影響[13-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，nO NPs 對多種細胞都有一定的毒性，但nO NPs 對細胞代謝影響的研究很少，尤其是對黑素瘤細胞的代謝影響的研究幾乎沒有。黑色素瘤是一種惡性皮膚腫瘤，近年來發(fā)病率逐年增加，尤其是35歲以下人群更易發(fā)病[18]。腫瘤分子生物學(xué)研究結(jié)果表明，惡性腫瘤的發(fā)生是一種細胞分化的紊亂，而B16黑色素瘤細胞是一種研究腫瘤細胞分化的良好模型。本研究探討了nO NPs 對小鼠B16黑色素瘤細胞的體外細胞生長和分化的影響，初步探討其作用機制，以期評價nO NPs 在皮膚疾病治療和化妝品方面應(yīng)用的安全性。

1材料與方法

11材料與試劑

nO NPs顆粒（15、30、90 nm nO購自安徽宣城晶瑞新材料有限公司。nO NPs 純度均大于999%，為紅鋅礦晶型結(jié)構(gòu)，廣角X射線儀測定證實納米粒徑與產(chǎn)品說明書一致。Hepes、青霉素、鏈霉素、DMEM（上海生工生物工程有限公司、胎牛血清、胰蛋白酶、多巴和蘑菇酪氨酸酶（上海寶曼生物科技有限公司、實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time（TaaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

12方法

121nO NPs懸液的制備根據(jù)文獻[19]中的方法略作改進。分別配制粒徑15、30、90 nm、濃度1 g/L的nO NPs 懸液，攪拌均勻。進行超聲處理，振幅80 mm/s，間隔時間2 s，每個樣品超聲時間15 min，之后用高壓滅菌30 min。在加入細胞前，nO NPs 懸液還要在密封情況下用超聲波清洗機超聲15 min，用細胞培養(yǎng)液DMEM（不含血清配制所需濃度的nO NPs懸液。

122細胞培養(yǎng)將小鼠B16黑色素瘤細胞用含10%胎牛血清、025 mmol/L Hepes、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長到70%～80%時，以025%胰蛋白酶消化傳代或制成單細胞懸液計數(shù)分別接種于6、96孔孔板，放在CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

123細胞形態(tài)觀察將細胞計數(shù)調(diào)整到30 萬個 /mL加入6孔的培養(yǎng)板中，每孔1 mL，外加1 mL完全培養(yǎng)液DMEM（含10%胎牛血清，待細胞貼壁12 h后棄原培養(yǎng)基加nO NPs，分別用含藥物終濃度2、4、8、16 μg/mL的nO NPs 和不同尺寸的nO（15、30、90 nm，體相nO濃度為8 μg/mL與小鼠B16黑色素瘤細胞共培養(yǎng)2d后，以培養(yǎng)液為空白對照，在20倍倒置顯微鏡下觀察并拍照。

124細胞活力對數(shù)生長期的小鼠B16黑色素瘤細胞，消化、計數(shù)，將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板200 μL/孔，接種密度為1萬 /mL。待細胞貼壁12 h后棄原培養(yǎng)基加待測藥物，分別加入納米或體相氧化鋅，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，對照組不加藥物。將細胞置于CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)3 d。藥物處理結(jié)束4 h前，加5 g/L MTT 20μL/孔，繼續(xù)置CO2孵箱培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)液，加入150 μL/孔 DMSO，充分振搖培養(yǎng)板，用酶標(biāo)儀測定每孔吸光度（D490 nm，細胞抑制率=（1-藥物處理組吸光度/空白對照組吸光度×100%。

125細胞內(nèi)酪氨酸酶活性測定[20]將細胞計數(shù)調(diào)整到30萬 /mL，加入到6孔培養(yǎng)板中，1 mL/孔，外加1 mL完全培養(yǎng)液DMEM（含10%胎牛血清，設(shè)3個復(fù)孔。待細胞貼壁 12 h 后棄原培養(yǎng)基加待測藥物，以培養(yǎng)液為空白對照，培養(yǎng) 2 d。棄培養(yǎng)基，用1×PBS溶液潤洗2次，加入1% TritonX-100 溶液100 μL/孔，迅速放入-80 ℃低溫冰箱凍存 30 min。室溫下融化，反復(fù)幾次使細胞完全破裂。4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，分別取上清液80 μL和L-DOPA溶液 20 μL 置于96孔板中，37 ℃反應(yīng)1 h，在492 nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度。酪氨酸酶活性=藥物處理組吸光度/空白對照組吸光度×100%。endprint

126黑素含量測定[21] 細胞培養(yǎng)和藥物添加同“125”節(jié)，添加藥物后，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后傾去培養(yǎng)基，用1×PBS潤洗2次后加入1 mol/L NaOH 1 mL，置于 60 ℃ 水槽中溫育1h。405 nm波長處用酶標(biāo)儀測吸光度。黑色素含量=藥物處理組吸光度/空白對照組吸光度×100%。

127Real-time PCR 測定酪氨酸酶及相關(guān)蛋白表達量[22] 細胞培養(yǎng)和藥物添加同“125”節(jié)，藥物添加后，37 ℃溫育 2 d，棄上清培養(yǎng)液，用DEPC水處理的冷PBS清洗細胞2次。加入1 mL/孔 Total RNA Extractor（Trizol裂解液處理細胞，用TRIzol法提取總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MuLV First Strand cDNA Synthesis it將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照 Real-time PCR試劑盒操作步驟進行熒光定量PCR。以GAPDH作為內(nèi)參，酪氨酸酶（TYR、酪氨酸相關(guān)酶相關(guān)蛋白1（TYRP-1、酪氨酸相關(guān)酶相關(guān)蛋白2（TYRP-2水平依據(jù)CT值用2-ΔΔCT法進行計算。

128數(shù)據(jù)分析與處理用SPSS115軟件進行數(shù)據(jù)分析與處理。

2結(jié)果與分析

21納米氧化鋅對B16細胞生長的影響

不同尺寸的8 μg/mL nO NPs對B16細胞的作用效果見圖1。細胞抑制率大小順序為15 nm nO NPs>30 nm nO NPs>90 nm nO NPs，表明在培養(yǎng)基中加入 8 μg/mL 納米氧化鋅，抑制了B16細胞的生長，其尺寸越小，對B16細胞生長的抑制作用越強，納米氧化鋅的抑制作用均大于相同濃度的體相氧化鋅。

22納米氧化鋅對B16細胞形態(tài)的影響

由圖2可以看出，nO NPs 粒徑越小，其對B16 細胞生長的抑制作用越大，該抑制作用隨納米濃度的增加而增加。16 μg/mL 的 30 nm nO 作用細胞2 d后，大量細胞形態(tài)變圓，細胞死亡。[FL]

[FL（22]23納米氧化鋅對細胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響

由圖3-A可知，在30 nm尺寸下，隨著納米nO濃度逐漸增大，酪氨酸酶活性逐漸增強，nO NPs處理與對照差異極顯著（P<001。由圖3-B可知，在8 μg/mLnO NPs 下，隨著納米尺寸增大，酪氨酸酶活性逐漸減弱，不同納米尺寸處理與對照差異極顯著（P<001。說明nO NPs 作用B16 細胞時，其濃度越大或納米尺寸越小，酪氨酸酶活性越強，促進B16 的分化作用越強。

24納米氧化鋅對細胞黑色素含量的影響

由圖4-A可知，在30 nm尺寸下，隨著nO NPs 濃度逐漸增大，黑色素含量逐漸增加，nO NPs處理與對照差異極顯著（P<001。由圖4-B可知，在8 μg/mLnO NPs 下，隨著納米尺寸增大，黑色素含量逐漸減少，不同納米尺寸處理與對照差異極顯著（P<001。說明nO NPs 作用B16 細胞時，nO濃度越大或納米尺寸越小，都會刺激細胞產(chǎn)生更多的黑色素，促進B16 分化。該結(jié)果與酪氨酸酶活性變化一致。

25納米氧化鋅對TYR、TYRP-1、TYRP-2的mRNA表達量的影響

由圖5可知，與對照相比，30 nm nO NPs 濃度高于 8 μg/mL 時，TYR、TYRP-1、TYRP-2的mRNA 表達量極顯著增高 （P<001 。該結(jié)果與酪氨酸酶活性和黑色素含量的測定結(jié)果一致，說明納米nO NPs 通過增加B16 細胞中TYR、TYRP-1、TYRP-2的mRNA 表達水平，引起細胞內(nèi)酪氨酸酶活性增加，黑色素合成增加，B16黑素瘤細胞分化。

3結(jié)論與討論

隨著全球范圍內(nèi)納米科技的發(fā)展，人造納米顆粒的生物學(xué)效應(yīng)越來越引起科學(xué)家的關(guān)注。 黑色素細胞是皮膚里的一種特殊細胞，它產(chǎn)生黑色素，傳遞給周圍的角質(zhì)形成細胞，皮膚顏色來自于角質(zhì)形成細胞內(nèi)存儲的黑色素。與正常黑色素細[CM（25]胞相比，黑色素瘤細胞的黑色素合成能力低下。當(dāng)誘導(dǎo)分[CM]

化時，黑色素生成能力明顯增加。酪氨酸酶具有多巴氧化酶和酪氨酸羥化酶功能，是黑色素合成的限速酶。因此，B16細胞內(nèi)的酪氨酸酶活性和黑色素含量是判斷B16細胞能否分化的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，當(dāng)nO NPs濃度大于 8 μg/mL 時，抑制B16黑色瘤細胞生長，其濃度越大或納米尺寸越小，對B16細胞生長的抑制作用越強。nO NPs 主要通過增加B16細胞中TYR、TYRP-1、 TYRP-2的mRNA 表達量來增加細胞內(nèi)酪氨酸酶活性，影響黑色素形成，誘導(dǎo)細胞分化。該結(jié)論與細胞毒性效應(yīng)與納米尺寸和粒徑大小密切相關(guān)的理論相一致，但有關(guān)納米氧化鋅的毒性機制仍須進一步研究。本研究結(jié)果可為納米氧化鋅在醫(yī)藥和化妝品行業(yè)的應(yīng)用提供參考。

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