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    南京地區(qū)動物源大腸桿菌超廣譜β—內(nèi)酰胺酶基因檢測

    2015-04-02 10:30:22方光遠(yuǎn)胡志華蔣加進(jìn)顧亞鳳晏文梅戴鼎震
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年12期
    關(guān)鍵詞:大腸桿菌內(nèi)酰胺酶

    方光遠(yuǎn)+胡志華+蔣加進(jìn)+顧亞鳳+晏文梅+戴鼎震

    摘要:為了研究江蘇省南京地區(qū)動物源大腸桿菌的耐藥特性,對南京地區(qū)發(fā)生大腸桿菌病的動物進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng),獲得38株大腸桿菌,采用PCR方法對38株不同動物源大腸桿菌TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,有6株大腸桿菌檢測出超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因,檢出率為158%。其中3株為CTX-M-1型,2株為CTX-M-9型,1株為SHV型。只有部分大腸桿菌對少數(shù)抗生素高敏。

    關(guān)鍵詞:大腸桿菌;超廣譜β-內(nèi)酰胺酶;基因檢測;南京地區(qū)

    中圖分類號: S85261+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(201412-0255-03[HS][HT9SS]

    [HJ14mm]

    收稿日期:2014-10-30

    基金項(xiàng)目:江蘇省南京市科技發(fā)展指導(dǎo)性計(jì)劃(編號:2012D006。

    作者簡介:方光遠(yuǎn)(1965—,男,江蘇宿遷人,碩士,副教授,從事獸醫(yī)微生物學(xué)、獸醫(yī)生物制品學(xué)教學(xué)及研究。E-mail:fanggy126@126com。[HJ]

    大腸桿菌廣泛存在于自然界中及動物體內(nèi),正常情況下,動物腸道內(nèi)正常菌群中的大腸桿菌處于相對平衡的狀態(tài),對于保持機(jī)體健康起到十分重要的作用;但一些特殊血清型的大腸桿菌對動物有致病性,能引起發(fā)病動物出現(xiàn)精神沉郁、厭食、下痢等臨床癥狀,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致發(fā)病動物死亡。隨著獸醫(yī)臨床β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛使用,動物源大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性越來越普遍,同時(shí)產(chǎn)生耐藥性的菌株中檢測出超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs的概率也越來越高。ESBLs主要由大腸桿菌、肺炎克雷伯菌產(chǎn)生,能對β-內(nèi)酰胺類抗生素進(jìn)行水解,從而導(dǎo)致此類細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性[1-3]。近年來,隨著3代頭孢菌素、單環(huán)酰胺類抗生素在臨床上的廣泛使用,各地產(chǎn)生ESBLs動物源大腸桿菌檢出率不斷增加[4-6]。為了研究動物源大腸桿菌的耐藥性,本研究采用PCR方法對近年來江蘇省南京地區(qū)分離鑒定的38株不同動物源大腸桿菌TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9 型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因進(jìn)行檢測,現(xiàn)將試驗(yàn)過程及檢測結(jié)果報(bào)告如下。

    1材料與方法

    11材料

    111病料來源

    無菌采取近年來南京市范圍的養(yǎng)殖場、寵物醫(yī)院發(fā)生大腸桿菌病動物的相關(guān)病料,其中鴿病料7份,犢牛腹瀉病料27份,犬病料4份,送至金陵科技學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定。

    112培養(yǎng)基

    普通營養(yǎng)瓊脂平板、SS瓊脂平板、三糖鐵瓊脂斜面、普通營養(yǎng)肉湯均由金陵科技學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室配制。

    113微量生化發(fā)酵管

    腸桿菌科細(xì)菌GY-15e生化編碼鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司。微量生化編碼鑒定管包括硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、尿素酶、半固體穿刺、葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、棉籽糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木膠糖。

    114PCR擴(kuò)增引物及試劑[JP2]

    根據(jù)文獻(xiàn)已發(fā)表的TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因序列,由大連寶生物有限公司設(shè)計(jì)合成TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因片段上下游引物[7]。TEM上游引物P1:5′-GGGGATGAGTATTCAACATTTCC-3′;下游引物P2:5′-GGGCAGTTACCAATGCTTAATCA-3′,預(yù)計(jì)擴(kuò)增861 bp基因片段。SHV上游引物P1:5′-TCCCGCAGATAAATCACCA-3′;下游引物P2:5′-TCGGCCTTCACTCAAGGATG-3′,預(yù)計(jì)擴(kuò)增821 bp基因片段。CTX-M-1上游引物P1:5′-CGCTTTGCGATGTGCAG-3′;下游引物P2:5′-ACCGCGATATCGTTGGT-3′,預(yù)計(jì)擴(kuò)增551 bp基因片段。CTX-M-9上游引物P1:5′-ATGGTGACAAAGAGAGAGTGCA-3′;下游引物P2:5′-CCCTTCGGCGATGATTCT-3′,預(yù)計(jì)擴(kuò)增868 bp基因片段。試劑包括 2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、TBE緩沖液等,均購自大連寶生物有限公司。

    115藥敏紙片

    抗生素藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。藥敏紙片包括:苯唑西林、氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢噻肟、卡那霉素、妥布霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因共計(jì)12種。

    12方法

    121細(xì)菌分離培養(yǎng)

    將取自鴿、犢牛腹瀉、犬的病料分別接種于SS瓊脂平板,貼上標(biāo)簽,37 ℃培養(yǎng)24 h。取生長典型的單個(gè)菌落分區(qū)劃線接種于SS瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板,穿刺接種于三糖鐵瓊脂斜面、營養(yǎng)肉湯中,37 ℃培養(yǎng) 24 h,觀察菌落形態(tài)及菌落在三糖鐵瓊脂斜面及營養(yǎng)肉湯中的生長情況。

    122細(xì)菌染色鏡檢

    取純培養(yǎng)獲得的單個(gè)菌落在潔凈載玻片上涂片,火焰干燥固定后,進(jìn)行革蘭氏染色,在普通光學(xué)顯微鏡油鏡下進(jìn)行觀察。

    123細(xì)菌的生化特性鑒定

    取上述38株分離菌純培養(yǎng)物,分別接種于腸桿菌科細(xì)菌GY-15e生化編碼鑒定管硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、尿素酶、半固體穿刺、葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、棉籽糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木膠糖中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18~24 h,觀察結(jié)果。

    124細(xì)菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因PCR檢測

    DNA模板制備:分別取37 ℃培養(yǎng)18~24 h的38株分離菌肉湯培養(yǎng)物2 mL,用冷凍離心機(jī)4 ℃ 10 000 r/min離心2 min,傾去上清液,加入無菌水2 mL混勻,再同上離心洗滌1次,傾去上清液,再加入無菌水2 mL混勻,4 ℃保存?zhèn)溆谩?5 μL PCR反應(yīng)體系:Taq PCR Mix 125 μL、上游引物及下游引物各1 μL、ddH2O 10 μL、DNA模板05 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性8 min;94 ℃變性45 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸 1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR基因片段檢測:取PCR產(chǎn)物10 μL加樣到12 g/L瓊脂糖凝膠中,于110 V 50 mA 核酸電泳槽中電泳45 min,電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察檢測TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因片段。endprint

    125超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因陽性大腸桿菌藥敏試驗(yàn)

    對檢測出超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的6株大腸桿菌菌株按常規(guī)紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。在乙醇燈火焰旁,用滅菌接種環(huán)取上述大腸桿菌純培養(yǎng)物致密劃線于普通營養(yǎng)瓊脂平板表面,用無菌鑷子將各種藥敏紙片(直徑6 mm分別貼于培養(yǎng)基表面,每塊平板貼3種,呈等邊三角形,各片距離相等。每貼完1個(gè)藥敏紙片,鑷子要在火焰上灼燒,以保證無菌。放在 37 ℃ 培養(yǎng)箱中24 h后取出觀察并測量抑菌圈直徑。細(xì)菌對藥物的敏感程度判定標(biāo)準(zhǔn)為:抑菌圈直徑大于20 mm 為極度敏感,15~20 mm為高度敏感,10~14 mm 為中度敏感,小于10 mm 為低度敏感,0 mm為不敏感。

    2結(jié)果與分析

    21細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

    將取自鴿、犢牛腹瀉、犬的病料分別接種于SS瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)24 h后,獲得38株細(xì)菌,均為圓形、隆起、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、直徑3~4 mm的紅色菌落。上述38株細(xì)菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長的單個(gè)菌落呈圓形、隆起、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、無色半透明狀,直徑3~4 mm。接種于普通營養(yǎng)肉湯37 ℃培養(yǎng)24 h后,肉湯呈渾濁狀態(tài),底部有黏性沉淀。穿刺接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h后,培養(yǎng)基斜面呈黃色,底部有大量氣泡,不產(chǎn)生H2S。

    22細(xì)菌形態(tài)染色特性鏡檢結(jié)果

    將上述38株細(xì)菌純培養(yǎng)后獲得的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢可見兩端鈍圓、散在革蘭氏陰性中等大小桿菌,大小為(1~3 μm×(04~07 μm。

    23細(xì)菌生化特性鑒定結(jié)果

    38株分離菌純培養(yǎng)物分別接種于腸桿菌科細(xì)菌 GY-15e 生化編碼鑒定管,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18~24 h,分離菌生化特性鑒定結(jié)果見表1。根據(jù)上述生化反應(yīng)結(jié)果,計(jì)算每株細(xì)菌鑒定總值,查《腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊》對應(yīng)的編碼檢索表,可得鴿7株、犢牛腹瀉27株、犬4株病料中的細(xì)菌鑒定值均為06365,鑒定結(jié)果均為大腸桿菌。

    [F(W18][HT6H][J]表1分離菌生化特性鑒定結(jié)果[HTSS][STB]

    [HJ5][BG(!][BHDFG3,W8,W21W] 項(xiàng)目[B(][BHDWG12,W21W]分離菌株

    [BHDWG12,W7。3W]鴿7株?duì)倥8篂a27株犬4株[BW]

    [BHDG12,W8Q,W7。3W]硫化氫000

    [BHDW]丙苯氨酸000

    葡萄糖酸鹽000

    蛋白胨水444

    葡磷胨水222

    枸櫞酸鹽000

    尿素酶000

    半固體穿刺222

    葡萄糖產(chǎn)氣111

    賴氨酸444

    鳥氨酸222

    棉籽糖001

    山梨醇444

    側(cè)金盞花醇000

    木膠糖111

    鑒定總值063650636506365[HJ][BG)F][F)]

    24細(xì)菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因PCR檢測結(jié)果

    測定結(jié)果表明,分離得到的4株犬源大腸桿菌中,2株1號、2號犬源大腸桿菌具有CTX-M-1型ESBLs基因片段,2株3號、4號犬源大腸桿菌具有CTX-M-9型ESBLs基因片段。在27株?duì)倥8篂a大腸桿菌中,有1株13號犢牛腹瀉大腸桿菌產(chǎn)CTX-M-1型ESBLs基因片段。在分離到的7株鴿大腸桿菌中,有1株9號鴿大腸桿菌具有SHV型ESBLs基因片段。所有菌株均未擴(kuò)增出TEM型條帶(圖1。

    [F(W12][TPFGY1tif][F]

    25超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因陽性大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

    對檢測出超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的6株大腸桿菌菌株按常規(guī)紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果見表2。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,6株大腸桿菌對青霉素類藥物氨芐西林、苯唑西林均不敏感,產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性;對頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢呋辛大部分菌株不敏感,產(chǎn)生耐藥性;對氨基糖苷類藥物卡那霉素、妥布霉素不太敏感;4號犬大腸桿菌對頭孢噻肟產(chǎn)生耐藥性,其他5株菌較敏感;6株菌對諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星敏感度不一致,可能與不同動物使用上述3種藥物程度不同有關(guān);5株菌對呋喃妥因均高度敏感。其中1~4號犬大腸桿菌對大多數(shù)抗生素都不敏感,耐藥性較強(qiáng),這可能與寵物醫(yī)院濫用抗生素有關(guān)。鴿大腸桿菌雖然測定出具有SHV型 ESBLs 基因片段,但對多種藥物高度或中度敏感,具體原因有待進(jìn)一步分析。

    [F(W16][HT6H][J][WTH]表2超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因陽性大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果[WTB][HTSS][STB]

    [HJ5][BG(!][BHDFG42,W5,W24W]藥名[B(][BHDWG12,W24W]抑菌圈直徑(mm

    [BHDWG3,W62,W32。5W]13號犢牛腹瀉Ecoli1號犬Ecoli2號犬Ecoli3號犬Ecoli4號犬Ecoli9號鴿Ecoli

    [BHDG12,W5,W62,W32。5W]苯唑西林000000

    [BHDW]氨芐西林000000

    頭孢唑啉0000021

    頭孢哌酮002014920

    頭孢呋辛0000018

    頭孢噻肟13151414021

    卡那霉素01300018

    妥布霉素9700017

    諾氟沙星151817000

    氧氟沙星0131511823

    左氧氟沙星1720170022

    呋喃妥因172216191916[HJ][BG)F][F)]

    3結(jié)論與討論endprint

    超廣譜β-內(nèi)酰胺酶 (ESBLs是一類由細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶,能使細(xì)菌對青霉素類, 第一代、第二代、第三代頭孢菌素β-內(nèi)酰胺類抗生素,氨曲南(不包括第四代頭孢菌素或碳青霉烯類產(chǎn)生耐藥性。ESBLs主要由大腸桿菌、肺炎克雷伯菌產(chǎn)生,是該類細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺酶類抗生素產(chǎn)生耐藥性最重要的機(jī)制。目前已發(fā)現(xiàn)200余種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs,根據(jù)編碼基因同源性不同分為:TEM(temoniera、SHV(sulphadryl variable、CTX-M(cefotaxime、OXA(oxacillin、其他5類。CTX-M型ESBLs主要由大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌等細(xì)菌產(chǎn)生,根據(jù)基因序列同源性不同,將 CTX-M 型ESBLs分為4組,分別為CTX-M-1組、CTX-M-2組、CTX-M-8組、CTX-M-9組。我國主要為CTX-M型,以CTX-M-1組與CTX-M-9組最為常見;其次為SHV型;歐美國家常見的TEM型ESBLs在我國罕見。本研究表明,38株動物源大腸桿菌ESBLs基因總檢出率為158%,其中3株為CTX-M-1型,2株為CTX-M-9型,1株為SHV型。只有部分大腸桿菌對少數(shù)抗生素高敏,說明含有ESBLs的大腸桿菌對常規(guī)抗生素已產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性;但大腸桿菌對氟喹諾酮類、呋喃類抗菌化學(xué)藥物敏感性較高,這與這些藥物抑制大腸桿菌的核酸復(fù)制有關(guān)。因此在治療大腸桿菌感染時(shí),應(yīng)先通過藥敏試驗(yàn)對發(fā)病動物選用高度敏感藥物來進(jìn)行治療,才能取得滿意的效果。大腸桿菌的特點(diǎn)是易形成耐藥性,而且大腸桿菌可通過菌毛將其耐藥性質(zhì)粒傳遞給其他大腸桿菌,所以大腸桿菌的耐藥性形成較快,環(huán)境中大腸桿菌耐藥性菌株越來越多,所以在使用藥物治療大腸桿菌病時(shí),應(yīng)采用輪換用藥、穿梭用藥、聯(lián)合用藥的方法避免或延緩大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生[8-9]。

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    doi:1015889/jissn1002-130220141208endprint

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