• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Rho 型GTPase 激活蛋白MoBem2 在稻瘟病菌分生孢子形態(tài)建成中的功能

    2015-04-02 07:58:12齊中強劉永鋒
    江蘇農業(yè)學報 2015年5期
    關鍵詞:葉鞘分生孢子突變體

    齊中強, 杜 艷, 劉永鋒

    (江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所,江蘇 南京210014)

    稻瘟病已經成為危害世界糧食安全生產的一種重要病害[1-4]。由于經濟重要性和遺傳轉化的易操作性以及全序列的公布,稻瘟病菌-植物互作模式已經成為研究的熱點課題[5]。稻瘟病菌分生孢子在其侵染水稻的過程中扮演著重要角色[6]。分生孢子首先在其頂端產生粘性物質,隨后便萌發(fā)產生芽管,最后分化形成附著胞。附著胞的分化主要受細胞周期和程序性死亡等因素調控。附著胞內部通過甘油的積累可以產生大約8 MPa 的膨壓,從而產生侵入釘,穿破寄主表皮進入細胞內。侵入后,侵入釘會分化成侵染菌絲,進而在植物細胞內定殖,隨著時間的延長,就會形成可見的典型稻瘟病斑。當外界條件(溫度、濕度)適宜時,病組織上會重新長出孢子梗,進而產生分生孢子,繼續(xù)進行再侵染[7]。Rho 蛋白是Ras 超家族中最早被克隆出來的一類蛋白質,它們是一組相對分子質量約為2.0×104~2.5×104的三磷酸鳥苷結合蛋白,具有GTP 酶活性,主要調控細胞骨架的形成及細胞形態(tài)建成[8]。Rho 蛋白和其他類型的G 蛋白具有相似的功能,作為一種分子開關,具有GTP 結合的活性狀態(tài)和GDP 結合的失活狀態(tài)。激活蛋白Bem2主要行使GTPase 激活功能,促使GTP 向GDP 的轉換,加速Rho 蛋白的失活。為了明確Rho 蛋白GTPase 激活蛋白在稻瘟病菌中的功能,本研究通過基因敲除的方法,對稻瘟病菌中Rho 型GTPase 激活蛋白MoBem2 功能進行解析。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)Guy11 和水稻品種CO39(感病品種)由南京農業(yè)大學植物保護學院真菌與卵菌實驗室提供。完全培養(yǎng)基CM、產孢培養(yǎng)基SDC 的配制方法參照文獻[9]。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 敲除載體構建及稻瘟病菌敲除轉化 通過稻瘟病菌全基因組序列公布網站,下載預測到的MoBEM2 基因序列。將稻瘟病菌基因組數據庫中MoBEM2 基因上、下游各1 kb 左右的DNA 序列作為同源重組的上、下兩臂,構建基因敲除載體。以野生型Guy11 基因組DNA 為模板,分別用引物bem2-p1(F)/bem2-p2(R)和bem2-p3(F)/bem2-p4 (R)擴增上、下臂片段,經電泳、切膠回收將PCR 產物純化。再以這兩臂片段為模板,用引物bem2-p1(F)/bem2-p4(R)進行Over-lap PCR 擴增。PCR 產物切膠回收后連接到pMD19-T simple vector(TaKaRa,Dalian,China)得到質粒pMD∶∶BEM2,并送交上海Invitrogen 公司測序,其中引物bem2-p2 和bem2-p3序列中設有EcoRV 酶切位點。以質粒pCB1003 為模板,用引物FL1111 (F)/FL1112 (R)高保真PCR擴增抗性篩選基因—潮霉素磷酸轉移酶基因(HPH),所用的高保真酶為Primer STAR(TaKaRa,Dalian,China),反應程序為:98 ℃10 s,56 ℃15 s,72 ℃1 min,30 個循環(huán)。擴增得到的平末端PCR 產物切膠回收后插入EcoR V 酶切過的質粒pMD∶∶BEM2 中,得到敲除載體pMD∶∶BEM2∶∶HPH。以該質粒為模板,用引物bem2-p1(F)/bem2-p4(R)擴增得到約3.4 kb 的敲除片段用于稻瘟病菌的原生質體轉化,原生質體轉化方法參照文獻[10]。

    1.2.2 轉化子驗證及Southern 雜交 提取轉化得到的轉化子基因組DNA(CTAB 法),用引物bem2-p5(F)/bem2-p6(R)進行驗證,隨后將驗證得到的候選突變體進行Southern 雜交。以稻瘟病菌野生型Guy11 基因組DNA 為模板,用引物bem2-p5(F)/bem2-p6(R)擴增出MoBEM2 基因內部889 bp 片段,以此片段作為探針,并用地高辛標記。Guy11 菌絲基因組DNA 經EcoR I 酶切于1.0%瓊脂糖凝膠中過夜電泳,充分分離酶解片段,然后轉移至帶正電的尼龍膜(HybondTM-N+,Amersham,Biosciences UK Limited)上,與地高辛標記的探針于58 ℃雜交過夜。Southern 雜交過程參照Digoxigenin high-prime DNA labeling and the detection starter kit 1(Roche,Germany)的操作手冊。以上引物序列見表1。

    1.2.3 分生孢子的誘導產生 將野生型Guy11 及敲除突變體接種在SDC 培養(yǎng)基上,28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d 左右,待菌絲體長滿平板后,用手術刀將表面氣生菌絲刮掉,于黑光燈下照射3 d,誘導分生孢子產生。收集孢子時,向培養(yǎng)基內加入3 ml 無菌水,輕輕用1.5 ml EP 管底部將表面氣生菌絲和孢子刷下,再經過4 層擦鏡紙過濾收集孢子。

    1.2.4 附著胞形成的觀測 將蓋玻片(Fisherbrand,12-540-A 18 ×18-2)放置在載玻片上(下面滴加無菌水),取40 μl 濃度為1 ml 5 ×104個的分生孢子液,滴加于蓋玻片中央,隨后將載玻片放入培養(yǎng)皿中28 ℃黑暗保濕培養(yǎng)2 h、4 h、6 h、8 h、24 h 和48 h后分別制片觀測附著胞形成率。設置3 個重復。

    1.2.5 水稻噴霧接種及大麥離體致病性測定 將刷下的分生孢子液濃度調至1 ml 5 ×104個,加入0.25%明膠,噴霧接種生長14 d 的水稻,28 ℃黑暗培養(yǎng)24 h,隨后16 h 光照,8 h 黑暗,處理期間需要保持高溫高濕狀態(tài)。接種5 ~7 d 后,觀察結果。大麥離體致病性測定:剪取生長14 d 的大麥葉片鋪于含有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中,將孢子液濃度調至1 ml 5 ×104個,加入0.25%明膠,每片葉片滴3 滴孢子液,以清水做對照,置于28 ℃黑暗培養(yǎng)24 h,隨后16 h 光照,8 h 黑暗處理。接種5 ~7 d 后,觀察結果。試驗重復3 次。

    表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

    1.2.6 水稻葉鞘侵染 取生長28 d 的水稻植株,剝去外面葉片,留存倒數第2 片葉鞘和新葉,將新葉慢慢取出,保留葉鞘部分。收集野生型和突變體分生孢子,調配孢子液濃度為1 ml 1 ×105個,用1 ml注射器將孢子液注入葉鞘內,隨后放入保濕培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng),水稻根部覆蓋脫脂棉保濕。48 h 后,用手術刀將葉鞘切斷,選取距根部較近部位用眼科鑷撕取葉鞘內表皮,隨后制片觀察并拍照。每個菌株處理10 株水稻葉鞘。

    1.2.7 分生孢子熒光增白劑(CFW)染色 將10 mg/ml的CFW 染色液稀釋1 000倍,加入準備好的孢子懸浮液中,避光染色5 min,隨后用無菌水沖洗數次,置于熒光顯微鏡下觀察。

    2 結果與分析

    2.1 稻瘟病菌MoBEM2 基因敲除突變體的獲得

    利用同源重組原理對稻瘟病菌中的MoBEM2基因進行了定向敲除(圖1),經初步驗證獲得#23和#32 2 個轉化子。Southern 雜交結果(圖2)顯示,兩個突變體用基因探針沒有雜交出4.7 Kb 條帶,說明已被成功敲除,進一步用潮霉素探針雜交出了約6.7 Kb 條帶,證明MoBEM2 基因已被潮霉素基因成功替換。

    2.2 MoBEM2 基因敲除突變體的孢子形態(tài)

    將稻瘟病菌野生型Guy11 和#23 突變體及互補轉化子分別接種到SDC 培養(yǎng)基中,隨后誘導產孢。發(fā)現突變體分生孢子產量顯著降低(下降40%左右)(圖3),孢子形態(tài)發(fā)生改變(圖4),分生孢子只形成一個隔膜(約占40%左右),而野生型中超過90%均為正常孢子(圖5),說明MoBem2 參與了稻瘟病菌分生孢子的形態(tài)建成。

    圖1 MoBEM2 基因替換策略簡圖Fig.1 Schematic illustration of MoBEM2 targeted gene replacement

    圖2 MoBEM2 敲除突變體Southern 雜交驗證Fig.2 Southern blot of MoBEM2 deletion mutant

    2.3 MoBEM2 基因敲除突變體附著胞的形成率

    稻瘟病菌附著胞的形成對其致病性是必須的[11],因此檢測了MoBEM2 敲除突變體附著胞形成情況。結果(圖6)表明,突變體分生孢子在培養(yǎng)8 h時附著胞形成率顯著低于野生型和互補轉化子,但隨著時間延長,該缺陷恢復,至24 h,突變體附著胞形成率與野生型沒有差異。說明MoBEM2 基因敲除延緩了稻瘟病菌附著胞的形成。

    圖3 MoBEM2 敲除突變體分生孢子產量Fig.3 Conidial production of MoBEM2 deletion mutant

    圖4 MoBEM2 敲除突變體分生孢子形態(tài)Fig.4 Conidial morphology of MoBEM2 deletion mutant

    圖5 MoBEM2 敲除突變體不同形態(tài)分生孢子百分比Fig.5 Percentage of uniseptate and normal conidial morphology of MoBEM2 deletion mutant

    圖6 MoBEM2 突變體附著胞形成率Fig.6 Appressorium formation rate of MoBEM2 deletion mutant

    2.4 MoBEM2 基因敲除突變體的致病性

    將野生型、敲除突變體和互補轉化子的分生孢子配制成濃度為1 ml 5.0 ×104個的孢子懸浮液(含0.25%明膠),分別采用水稻植株噴霧和大麥離體葉片點滴的方法進行致病性測定。結果顯示,在兩種接種條件下,敲除突變體發(fā)病情況與野生型、互補轉化子均無差異,表明MoBEM2 基因在稻瘟病菌致病過程中不起作用(圖7)。

    圖7 MoBEM2 敲除突變體對水稻和大麥的致病性Fig.7 Pathogenicity to rice (A)and barley (B)of MoBEM2 deletion mutant

    3 討論

    Rho 型蛋白通過與特異性的鳥嘌呤核苷酸轉換因子(GEF)結合而被激活,與GTP 酶激活蛋白(GAPs)結合而失活[12]。本試驗以稻瘟病菌中一個Rho 型蛋白GTP 酶激活蛋白MoBem2 為研究對象,通過基因敲除,發(fā)現MoBem2 參與稻瘟病菌分生孢子的形態(tài)建成,延緩附著胞的形成。

    分生孢子在稻瘟病菌的致病過程中具有重要作用[13]。稻瘟病菌中,MoRac1 主要參與稻瘟病菌分生孢子的形成以及形態(tài)建成,并且調控稻瘟病菌對水稻的致病力[14]。本研究中,敲除Rho 型GTP 酶激活蛋白編碼基因MoBEM2 后,該突變體出現單隔的分生孢子,分生孢子產量也顯著下降,推測該基因參與分生孢子的形成及形態(tài)建成。上述結果表明Rho 蛋白主要通過其激活和失活調控稻瘟病菌分生孢子的形態(tài)建成,在這個過程中,GTP 酶的作用尤為明顯。此外,MoHOX2 作為Homeobox 轉錄因子家族的成員,敲除后稻瘟病菌喪失產孢能力[15]。2 個SNARE 蛋白MoVam7[16]和MoSec22[17]同樣參與了稻瘟病菌的產孢過程,兩者的敲除突變體均喪失產孢能力。說明了稻瘟病菌分生孢子的調控涉及多種機制。

    附著胞在稻瘟病菌侵染過程中起著至關重要的作用[18]。MoBEM2 敲除突變體分生孢子在誘導界面上能夠形成附著胞,但在附著胞形成早期,突變體附著胞形成率顯著降低,但在后期與野生型沒有差別。說明該基因一定程度上影響稻瘟病菌附著胞早期的形成,但不影響稻瘟病菌的致病性。綜上所述,MoBem2 參與了稻瘟病菌分生孢子的形成及形態(tài)建成過程,這對認識稻瘟病菌致病過程有重要意義。

    [1] WILSON R A,TALBOT N J. Under pressure:investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae[J]. Nature Reviews Microbiology,2009,7:185-195.

    [2] 于 濤,張海樓,雋英華,等.施肥模式對水稻稻瘟病抗性的影響[J].江蘇農業(yè)科學,2014,42(7):113-116.

    [3] 張曉娟,張 羽,張辰露,等.分子標記在稻瘟病抗性育種中應用的研究進展[J].江蘇農業(yè)科學,2013,41(8):73-75.

    [4] 唐 成,陳 露,安敏敏,等.稻瘟病誘導水稻幼苗葉片氧化還原系統(tǒng)的特征譜變化[J]. 江蘇農業(yè)科學,2014,42(12):141-144.

    [5] DEAN R A,TALBOT N J,EBBOLE D J,et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea[J]. Nature,2005,434:980-986.

    [6] HAMER J E,HOWARD R J,CHUMLEY F G,et al. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus[J]. Science,1988,239,288-290.

    [7] TALBOT N J. On the trail of a cereal killer:Exploring the biology of Magnaporthe grisea[J]. Annu Rev Microbiol,2003,57:177-202.

    [8] JOHNSON D I. Cdc42:An essential Rho-type GTPase controlling eukaryotic cell polarity[J]. Microbiol Mol Biol Rev,1999,63:54-105.

    [9] ZHANG H,TANG W,LIU K,et al. Eight RGS and RGS-like proteins orchestrate growth,differentiation,and pathogenicity of Magnaporthe oryzae[J]. PLoS Pathogens,2011,7:e1002450.

    [10] QI Z,WANG Q,DOU X,et al. MoSwi6,an APSES family transcription factor,interacts with MoMps1 and is required for hyphal and conidial morphogenesis,appressorial function and pathogenicity of Magnaporthe oryzae[J]. Molecular Plant Pathology,2012,13:677-689.

    [11] THINES E,WEBER R W,TALBOT N J. MAP kinase and protein kinase A-dependent mobilization of triacylglycerol and glycogen during appressorium turgor generation by Magnaporthe grisea[J]. Plant Cell,2000,12:1703-1718.

    [12] JAFFE A B,HALL A. Rho GTPases:biochemistry and biology[J]. Ann Rev Cell Dev Biol,2005,21:247-269.

    [13] TALBOT N J,EBBOLE D J,HAMER J E. Identification and characterization of MPG1,a gene involved in pathogenicity from the rice blast fungus Magnaporthe grisea[J]. The Plant cell,1993,5:1575-1590.

    [14] CHEN J,ZHENG W,ZHENG S,et al. Rac1 is required for pathogenicity and Chm1-dependent conidiogenesis in rice fungal pathogen Magnaporthe grisea [J]. PLoS Pathogens,2008,4:e1000202.

    [15] KIM S,PARK S Y,KIM K S,et al. Homeobox transcription factors are required for conidiation and appressorium development in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae[J]. PLoS Genetics,2009,5:e1000757.

    [16] DOU X,WANG Q,QI Z,et al. MoVam7,a conserved SNARE involved in vacuole assembly,is required for growth,endocytosis,ROS accumulation,and pathogenesis of Magnaporthe oryzae[J].Plos One,2011,6 :e16439.

    [17] SONG W W,DOU X Y,QI Z Q,et al. R-SNARE homolog moSec22 is required for conidiogenesis,cell wall integrity,and pathogenesis of Magnaporthe oryzae[J]. PLoS One,2010,5:e13193.

    [18] JEON J,GOH J,YOO S,et al. A putative MAP kinase kinase kinase,MCK1,is required for cell wall integrity and pathogenicity of the rice blast fungus,Magnaporthe oryzae[J]. Mol Plant Microbe Interact,2008,21,525-534.

    猜你喜歡
    葉鞘分生孢子突變體
    基于玉米DH系分離群體葉鞘、花絲、花藥與穗軸顏色性狀的遺傳分析
    作物雜志(2023年3期)2023-08-07 01:04:08
    油松枯梢病菌孢子萌發(fā)率測定方法探索
    油松枯梢病菌分生孢子器誘導方法探索
    CLIC1及其點突變體與Sedlin蛋白的共定位研究
    擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應機制探究
    三氯異氰尿酸對香蕉葉鞘腐爛病的抑制效果
    植物保護(2016年1期)2016-09-14 06:14:52
    香梨樹腐爛病菌分生孢子獲取方法及萌發(fā)條件的研究
    Survivin D53A突變體對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響
    鳳棲梧·植保員
    大豆自然侵染條件下Phomopsis longicolla的β分生孢子產生
    大豆科技(2014年5期)2014-03-23 02:46:18
    免费在线观看日本一区| av网站在线播放免费| 国产一区二区激情短视频| www.999成人在线观看| 国产不卡av网站在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲专区中文字幕在线| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品98久久久久久宅男小说| 色播在线永久视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产av精品麻豆| 国产三级黄色录像| 亚洲av成人av| av有码第一页| 黄色视频不卡| 99国产精品免费福利视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 怎么达到女性高潮| 午夜精品在线福利| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美黄色淫秽网站| netflix在线观看网站| 在线观看www视频免费| 在线观看一区二区三区激情| 久久香蕉国产精品| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产精品免费大片| 女性被躁到高潮视频| 免费在线观看影片大全网站| 久久亚洲精品不卡| 夜夜爽天天搞| 欧美一级毛片孕妇| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲专区国产一区二区| av视频免费观看在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 国产精品偷伦视频观看了| 午夜久久久在线观看| 黑人操中国人逼视频| 国产成人欧美| 亚洲,欧美精品.| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人手机av| av网站在线播放免费| 91在线观看av| 久久精品国产a三级三级三级| 日韩欧美三级三区| 嫁个100分男人电影在线观看| 777米奇影视久久| 91精品国产国语对白视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 757午夜福利合集在线观看| 香蕉久久夜色| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 深夜精品福利| 国产精品偷伦视频观看了| 午夜成年电影在线免费观看| 成年版毛片免费区| 亚洲视频免费观看视频| 在线观看午夜福利视频| 国产精品一区二区在线不卡| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 亚洲免费av在线视频| 久久久久久久久免费视频了| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 美女 人体艺术 gogo| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 中文亚洲av片在线观看爽 | 精品久久久久久久久久免费视频 | 又紧又爽又黄一区二区| 另类亚洲欧美激情| 国产成人影院久久av| 99久久综合精品五月天人人| 757午夜福利合集在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 国产亚洲精品久久久久5区| 美女 人体艺术 gogo| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 视频在线观看一区二区三区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 飞空精品影院首页| 在线天堂中文资源库| av网站免费在线观看视频| 欧美成人免费av一区二区三区 | 91精品三级在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 黄片小视频在线播放| 久久99一区二区三区| 久久草成人影院| 色综合婷婷激情| 午夜视频精品福利| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 大香蕉久久成人网| 91老司机精品| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产高清激情床上av| 久久中文字幕一级| 国产av又大| 久久久久久久久免费视频了| 老熟妇仑乱视频hdxx| 十八禁网站免费在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 正在播放国产对白刺激| 亚洲av片天天在线观看| 欧美激情高清一区二区三区| 中文亚洲av片在线观看爽 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品第一国产精品| 身体一侧抽搐| 国产精品九九99| 成年人黄色毛片网站| 搡老乐熟女国产| 水蜜桃什么品种好| 在线永久观看黄色视频| 桃红色精品国产亚洲av| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲av第一区精品v没综合| 女人被狂操c到高潮| 午夜福利影视在线免费观看| 国产淫语在线视频| 亚洲人成电影观看| 黄片播放在线免费| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲 国产 在线| 午夜福利免费观看在线| 成人三级做爰电影| 国产精品亚洲一级av第二区| videosex国产| 久久久久国产一级毛片高清牌| 热99国产精品久久久久久7| 欧美av亚洲av综合av国产av| 丝袜人妻中文字幕| 欧美丝袜亚洲另类 | xxxhd国产人妻xxx| 色94色欧美一区二区| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品国产高清国产av | 国产成人系列免费观看| 亚洲熟女毛片儿| 老司机亚洲免费影院| 无限看片的www在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 日韩免费高清中文字幕av| 久久国产精品影院| 亚洲专区中文字幕在线| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 校园春色视频在线观看| 超碰97精品在线观看| 国产精品九九99| 亚洲一区高清亚洲精品| 麻豆成人av在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲人成电影观看| 亚洲午夜理论影院| avwww免费| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲综合色网址| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产又爽黄色视频| 91成年电影在线观看| 久久性视频一级片| 少妇的丰满在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产成人精品在线电影| 亚洲熟妇熟女久久| 99国产精品免费福利视频| 色94色欧美一区二区| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品久久视频播放| 欧美成狂野欧美在线观看| 热99re8久久精品国产| 国产亚洲欧美精品永久| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美 日韩 精品 国产| 成在线人永久免费视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲三区欧美一区| 亚洲av电影在线进入| 欧美成人免费av一区二区三区 | 99精国产麻豆久久婷婷| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 在线天堂中文资源库| 国产区一区二久久| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲av电影在线进入| 美女扒开内裤让男人捅视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 又大又爽又粗| 日韩免费高清中文字幕av| 热99久久久久精品小说推荐| 精品国产一区二区久久| 一二三四在线观看免费中文在| 成年人免费黄色播放视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 97人妻天天添夜夜摸| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久香蕉精品热| 久久香蕉国产精品| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日本a在线网址| 色尼玛亚洲综合影院| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品一区二区三卡| 女警被强在线播放| 水蜜桃什么品种好| 国产精品av久久久久免费| √禁漫天堂资源中文www| 久久久精品区二区三区| 男女免费视频国产| 精品卡一卡二卡四卡免费| 免费少妇av软件| 久久精品亚洲av国产电影网| 757午夜福利合集在线观看| 人妻一区二区av| 两人在一起打扑克的视频| 9热在线视频观看99| 亚洲av美国av| 久久久久视频综合| 国产精品久久久久久精品古装| 天天添夜夜摸| 淫妇啪啪啪对白视频| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 免费在线观看影片大全网站| 老鸭窝网址在线观看| 久久青草综合色| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精华国产精华精| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲国产精品sss在线观看 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 激情视频va一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 国产1区2区3区精品| 久久狼人影院| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产免费现黄频在线看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久久精品免费免费高清| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产99白浆流出| 国产欧美亚洲国产| 久久久久久久国产电影| 国产主播在线观看一区二区| 极品教师在线免费播放| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| xxx96com| 999精品在线视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 搡老岳熟女国产| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 亚洲国产精品sss在线观看 | 又黄又爽又免费观看的视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产午夜精品久久久久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 成年女人毛片免费观看观看9 | 精品国产亚洲在线| 午夜免费观看网址| 亚洲免费av在线视频| 正在播放国产对白刺激| 国产精品99久久99久久久不卡| 免费黄频网站在线观看国产| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 麻豆av在线久日| 久久久国产一区二区| 亚洲av成人一区二区三| 老司机靠b影院| 一二三四社区在线视频社区8| 久久人妻熟女aⅴ| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美最黄视频在线播放免费 | a级毛片黄视频| 久久久久久久国产电影| 国产一区二区激情短视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 黑人猛操日本美女一级片| 国产亚洲av高清不卡| 天天影视国产精品| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久久国产成人精品二区 | 校园春色视频在线观看| 九色亚洲精品在线播放| av中文乱码字幕在线| 成人免费观看视频高清| 久99久视频精品免费| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 无限看片的www在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | xxxhd国产人妻xxx| 亚洲专区中文字幕在线| 极品教师在线免费播放| 中出人妻视频一区二区| 国产精品免费视频内射| 日韩成人在线观看一区二区三区| 啦啦啦 在线观看视频| 在线看a的网站| 国产麻豆69| 亚洲av成人一区二区三| 波多野结衣av一区二区av| 欧美日韩乱码在线| 99久久综合精品五月天人人| 精品福利观看| 国产精品国产av在线观看| 久久性视频一级片| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲伊人色综图| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 日韩有码中文字幕| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 啦啦啦 在线观看视频| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 激情在线观看视频在线高清 | 91国产中文字幕| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一区二区三区国产精品乱码| 999久久久国产精品视频| 精品久久久久久,| 国产真人三级小视频在线观看| а√天堂www在线а√下载 | netflix在线观看网站| 欧美日韩亚洲高清精品| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 69精品国产乱码久久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 在线观看免费视频网站a站| 国产精华一区二区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲伊人色综图| 啦啦啦 在线观看视频| 久久九九热精品免费| 一级毛片精品| 男女午夜视频在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 成人影院久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 一区二区三区精品91| 黄色成人免费大全| 交换朋友夫妻互换小说| a级毛片黄视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 热99国产精品久久久久久7| 国产精品av久久久久免费| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久国产欧美日韩av| 老司机影院毛片| 久久这里只有精品19| 亚洲专区字幕在线| 久久天堂一区二区三区四区| 大香蕉久久成人网| 免费在线观看日本一区| 亚洲专区国产一区二区| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 热re99久久国产66热| 久久国产乱子伦精品免费另类| 电影成人av| 真人做人爱边吃奶动态| 国产成人系列免费观看| 亚洲av第一区精品v没综合| av天堂久久9| 精品国产亚洲在线| 美女高潮到喷水免费观看| 十八禁人妻一区二区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产99白浆流出| 国产一区二区三区综合在线观看| 一区二区三区精品91| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 捣出白浆h1v1| 99精品久久久久人妻精品| 国产1区2区3区精品| 丝袜在线中文字幕| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 十八禁高潮呻吟视频| 国产精华一区二区三区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 男男h啪啪无遮挡| 一区二区日韩欧美中文字幕| 99国产精品一区二区蜜桃av | 一级a爱片免费观看的视频| av网站免费在线观看视频| 欧美精品av麻豆av| 麻豆乱淫一区二区| 国产一区二区三区综合在线观看| 成人国语在线视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 另类亚洲欧美激情| 国产精品偷伦视频观看了| 精品国产国语对白av| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 午夜福利影视在线免费观看| 不卡一级毛片| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品国产av在线观看| 国产精品久久视频播放| 婷婷丁香在线五月| 国产免费男女视频| 国产在线观看jvid| 日本a在线网址| 国产成人啪精品午夜网站| 久久香蕉精品热| 亚洲精品美女久久av网站| 久久久国产一区二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 深夜精品福利| 女人精品久久久久毛片| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产高清激情床上av| 最新的欧美精品一区二区| 在线观看免费高清a一片| 国产亚洲精品第一综合不卡| 中亚洲国语对白在线视频| 人人澡人人妻人| 乱人伦中国视频| 男女下面插进去视频免费观看| 成人影院久久| av线在线观看网站| 亚洲七黄色美女视频| 制服人妻中文乱码| 18禁观看日本| 亚洲九九香蕉| 正在播放国产对白刺激| 亚洲专区中文字幕在线| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品永久免费网站| 身体一侧抽搐| 大陆偷拍与自拍| 成人18禁在线播放| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 在线看a的网站| 免费在线观看日本一区| 国产精品久久久av美女十八| 麻豆av在线久日| 午夜91福利影院| 另类亚洲欧美激情| 女警被强在线播放| 免费日韩欧美在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲欧美激情综合另类| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲av成人av| 91麻豆av在线| 成人av一区二区三区在线看| 1024视频免费在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 成人国产一区最新在线观看| 中文欧美无线码| 一本综合久久免费| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 精品久久蜜臀av无| 免费黄频网站在线观看国产| 三级毛片av免费| 纯流量卡能插随身wifi吗| 高清毛片免费观看视频网站 | 精品人妻1区二区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 窝窝影院91人妻| 亚洲性夜色夜夜综合| 97人妻天天添夜夜摸| 久久草成人影院| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 色综合欧美亚洲国产小说| av不卡在线播放| 国产一区二区激情短视频| 亚洲综合色网址| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久亚洲真实| 国产高清国产精品国产三级| 精品国产亚洲在线| 亚洲人成77777在线视频| xxx96com| 午夜免费观看网址| 亚洲免费av在线视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲精品自拍成人| 91在线观看av| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲国产精品合色在线| 日韩欧美三级三区| 极品人妻少妇av视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 男女下面插进去视频免费观看| 精品少妇久久久久久888优播| 黄色女人牲交| 在线播放国产精品三级| 亚洲片人在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲午夜理论影院| cao死你这个sao货| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美色视频一区免费| 午夜福利视频在线观看免费| 多毛熟女@视频| 亚洲视频免费观看视频| 美女福利国产在线| 国产成人精品无人区| 午夜91福利影院| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品久久久久久精品古装| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美精品av麻豆av| 视频区欧美日本亚洲| 水蜜桃什么品种好| 久久亚洲真实| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 多毛熟女@视频| 91成年电影在线观看| 99国产精品99久久久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| www.自偷自拍.com| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 精品高清国产在线一区| 18禁美女被吸乳视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产不卡av网站在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 一二三四社区在线视频社区8| 成人三级做爰电影| 欧美黑人精品巨大| 夫妻午夜视频| 90打野战视频偷拍视频| 女同久久另类99精品国产91| 国产麻豆69| 丰满的人妻完整版| 亚洲情色 制服丝袜| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一区二区三区激情视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 午夜福利乱码中文字幕| 一级毛片高清免费大全| 中国美女看黄片| 精品亚洲成国产av| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲第一青青草原| 欧美乱色亚洲激情| tocl精华| 精品亚洲成国产av| 国产单亲对白刺激| 国产精品九九99| 午夜激情av网站| av福利片在线| 亚洲美女黄片视频| 午夜免费鲁丝| 欧美在线一区亚洲| 三上悠亚av全集在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 午夜影院日韩av| 首页视频小说图片口味搜索| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美国产精品va在线观看不卡| 69精品国产乱码久久久| 999久久久精品免费观看国产| 国产精品亚洲av一区麻豆| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲av欧美aⅴ国产| 成人av一区二区三区在线看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 视频区欧美日本亚洲| 欧美乱色亚洲激情| 免费在线观看黄色视频的| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 黄片小视频在线播放| av电影中文网址| 69精品国产乱码久久久| 丰满的人妻完整版| 久久人妻av系列| 51午夜福利影视在线观看| 午夜视频精品福利| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 在线观看日韩欧美| 国产精品国产av在线观看|