甘肅高山細(xì)毛羊和小尾寒羊DQB1 基因第2 外顯子多態(tài)性及其與乳房炎相關(guān)性

宋曉育， 張小麗， 馬小軍，2， 李發(fā)弟， 張 晨， 張 欣

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070;2.甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

隨著甘肅全舍飼養(yǎng)羊模式的推廣應(yīng)用，母羊的乳房炎疾病發(fā)生逐漸增多，危害極大［1］。母羊患有乳房炎不僅影響羔羊的健康發(fā)育，導(dǎo)致羔羊死亡率上升，而且大量患病母羊因其失去飼養(yǎng)價(jià)值而淘汰，給養(yǎng)殖戶造成較大經(jīng)濟(jì)損失。

MHC 是能編碼、誘導(dǎo)迅速排斥反應(yīng)抗原的基因群，呈高度多態(tài)性緊密連鎖不平衡并呈單體型遺傳的一種基因［2］。這些連鎖的免疫應(yīng)答基因編碼的MHC 抗原，調(diào)控細(xì)胞間的相互識(shí)別，控制機(jī)體對(duì)抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力［3］。綿羊的MHC 又稱綿羊白細(xì)胞抗原基因(Ovine lymphocyte antigen，OLA)，綿 羊OLA 基 因 分 為3 類，即OLA-Ⅰ、OLA-Ⅱ和OLA-Ⅲ。研究結(jié)果表明，與動(dòng)物抗病性有著密切關(guān)系的是OLA-Ⅱ中可以在蛋白質(zhì)水平上表達(dá)的DR-B 和DQ-B 基因，其外顯子2 編碼抗原肽的結(jié)構(gòu)功能區(qū)，是綿羊MHC-II類分子功能的重要組成部分，被作為疾病抗性和易感性研究的重要基因，且其組成、結(jié)構(gòu)以及與疾病之間的關(guān)系成為抗病育種研究的一個(gè)重要部分［4］。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)綿羊OLA 基因的研究報(bào)道多見(jiàn)于對(duì)其性狀、綿羊白血病、肺腺癌，以及抗包蟲(chóng)病、線蟲(chóng)病等。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)綿羊OLA 基因與肉羊乳房炎的研究很少。本研究擬以編碼OLA-Ⅱ類分子主要功能區(qū)的DQB1 基因外顯子2為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)甘肅高山細(xì)毛羊和小尾寒羊DQB1 基因外顯子2 多態(tài)性以及乳房炎發(fā)病情況分析，探究其與肉羊乳房炎間的關(guān)聯(lián)性，建立肉羊乳房炎抗性分子標(biāo)記檢測(cè)方法，為篩選乳房炎抗性的肉羊群體提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)采集甘肅地區(qū)412 只綿羊血樣，其中甘肅高山細(xì)毛羊乳房炎陽(yáng)性43 只，陰性157 只;小尾寒羊乳房炎陽(yáng)性48 只，陰性164 只。頸靜脈采集血液10 ml，裝入含有1 ml 滅菌ACD 抗凝劑的離心管，并用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室置于－20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的酚/氯仿提取法［5］，從血樣中提取DNA 并溶解于TE 緩沖液，在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，放于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)［6］，根據(jù)綿羊MHC-DQB1 基因核苷酸全序列Z28523 設(shè)計(jì)第2 外顯子的核苷酸序列引物(上游引物:5'-CCCCGCAGAGGATTTCGTG-3'，下 游 引 物 5'-ACCTCGCCGCTGCCAGGT-3')，擴(kuò)增目的片段約為280 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

PCR 擴(kuò)增采用25 μl 的優(yōu)化體系:上、下游引物各1.0 μl，模板DNA 2.0 μl，滅菌雙蒸水8.5 μl，2*TAQ 預(yù)混酶12.5 μl。PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃5 min;變性95 ℃30 s，退火63 ℃40 s，延伸72 ℃40 s，35 個(gè)循環(huán);最后延伸72 ℃10 min。4 ℃保存，PCR 產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物的SSCP 檢測(cè) 取2.0 μl PCR 產(chǎn)物，8.0 μl 變性劑［98%去離子甲酰胺、0.030%二甲苯青、0.025% 溴酚藍(lán)、0.5 mol/L EDTA (PH =8.0)］，95 ℃變性10 min，然后迅速放于冰上10 min。12%非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶ N，N-亞甲基雙丙烯酰胺=39∶ 1)，4 ℃、180 V 條件下，電泳20 h，銀染顯色法結(jié)束后拍照。

1.2.4 OLA-DQB1 外顯子2 測(cè)序 單鏈構(gòu)象采用多態(tài)性分析方法(SSCP)分析后，選取不同基因型個(gè)體的PCR 擴(kuò)增膠回收產(chǎn)物克隆，陽(yáng)性菌液送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.5 乳房炎的判定 采集的乳汁送至中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸醫(yī)研究所，采用小型體細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀檢測(cè)，以1 ml 4 ×105為閾值，體細(xì)胞數(shù)大于1 ml 4 ×105的則判定為隱性乳房炎。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17. 0 計(jì)算甘肅地區(qū)綿羊各個(gè)基因型的頻率、等位基因頻率、相對(duì)危險(xiǎn)值;用POPGNE計(jì)算純合度(Ho)、雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne);用PIC 軟件計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC);用MEGA5.05 軟件進(jìn)行核苷酸序列及氨基酸序列比對(duì);用DNAMAN 軟件進(jìn)行NJ 進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建;用Dnansp5.0 進(jìn)行核苷酸和氨基酸多態(tài)位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)采集的412 只綿羊DQB1 基因外顯子2 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶清晰，無(wú)雜帶(圖1)，片段大小為280 bp，可以進(jìn)行下步SSCP 檢測(cè)。

圖1 綿羊MHC-DQB1 外顯子2 的PCR 結(jié)果Fig.1 PCR amplification of MHC-DQB1 gene exon 2 in sheep

2.2 PCR-SSCP 檢測(cè)結(jié)果

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，412 頭甘肅地區(qū)綿羊個(gè)體中，共檢測(cè)到14 個(gè)等位基因，其電泳條帶從1 條到3 條不等，分別命名為等位基因A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N(圖2)。

圖2 綿羊MHC-DQB1 第2 外顯子SSCP 檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection of MHC-DQB1 gene exon 2 in sheep by PCRSSCP

2.3 DQB1 基因第2 外顯子核苷酸變異類型

通過(guò)對(duì)412 只綿羊DQB1 第2 外顯子基因克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了14 個(gè)等位基因(圖3)。除去引物序列對(duì)14 個(gè)DQB1 基因第2 外顯子243 bp 單倍型序列進(jìn)行比對(duì)分析，在分析序列中共有58個(gè)變異位點(diǎn)，占分析位點(diǎn)的23. 87%。其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)22 個(gè)，占核苷酸變異位點(diǎn)的37. 93%，包括A/G 轉(zhuǎn)換和C/T 轉(zhuǎn)換各11 個(gè);顛換位點(diǎn)30 個(gè)，占變異位點(diǎn)51. 71%，其中A/C 顛換6 個(gè)、A/T顛換8 個(gè)、G/C 顛換13 個(gè)、G/T 顛換3 個(gè);轉(zhuǎn)換和顛換共存位點(diǎn)6 個(gè)，占變異位點(diǎn)10. 35%。還發(fā)現(xiàn)2 個(gè)特殊位點(diǎn)，即第17 和145 位點(diǎn)出現(xiàn)堿基突變T?C?G?A。

核苷酸位點(diǎn)的堿基突變導(dǎo)致氨基酸發(fā)生了大量改變(圖4)，包括175 bp 處的T/A 突變導(dǎo)致等位基因A、N 所編碼的氨基酸由F(苯丙氨酸)?I(異亮氨酸);212 bp 處的C/A 突變和213 bp 處的G/C 突變導(dǎo)致等位基因N 所編碼的氨基酸由S(絲氨酸)?C(半胱氨酸)等。120 bp 處的C/G 突變、129 bp處的G/C 突變、147 bp 處的A/C突變、234 bp 處的T/A 突變未導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變。

2.4 甘肅高山細(xì)毛羊和小尾寒羊DQB1 基因第2外顯子遺傳信息

2 個(gè)綿羊群體DQB1 基因第2 外顯子的遺傳多態(tài)性如表1 所示，其雜合度均大于0.9，且PIC ＞0.5，均為高度多態(tài)。

2.5 甘肅高山細(xì)毛羊和小尾寒羊DQB1 第二外顯子與乳房炎相關(guān)性分析

PCR-SSCP 方法共檢出14 個(gè)單倍型，分別將乳房炎陰性和陽(yáng)性的2 個(gè)綿羊品種等位基因頻率進(jìn)行差異顯著性分析和相對(duì)危險(xiǎn)值計(jì)算(表2、表3)。結(jié)果顯示，2 個(gè)綿羊品種陽(yáng)性中均沒(méi)有等位基因A、D、N，而等位基因I 僅在甘肅高山細(xì)毛羊陽(yáng)性中存在;等位基因B (P ＜0. 01，RR =0. 158)與甘肅高山細(xì)毛羊乳房炎的抗性有較強(qiáng)相關(guān)性;等位基因F(P ＜0. 01，RR =3. 513)和L(P ＜0. 01，RR =10. 197)與甘肅高山細(xì)毛羊乳房炎易感性具有較強(qiáng)相關(guān)性。等位基因A(0. 01 ＜P ＜0. 05，RR =0. 878)與小尾寒羊乳房炎抗性有相關(guān)性，等位基因E (P ＜0. 01，RR =3. 333)和M(P ＜0. 01，RR =8. 000)與小尾寒羊乳房炎易感性具有較強(qiáng)相關(guān)性。

圖3 DQB1 外顯子2 等位基因核苷酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.3 Nucleotide sequences alignment of DQB1 gene exon 2 alleles

2.6 DQB1 第2 外顯子NJ 進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

為了研究這2 個(gè)綿羊種群DQB1 基因第2 外顯子的等位基因與其他相應(yīng)等位基因之間的遺傳關(guān)系，利用DNAMAN 軟件對(duì)其DQB1 第2 外顯子序列進(jìn)行NJ 樹(shù)構(gòu)建(圖5)，所用序列包括本研究的14 個(gè)單倍型，基因庫(kù)下載的AH001247. 2、AJ238942、Z28422、GU191457、HQ728686、HQ728668、HQ728669、Z28425，還有4 條牛的DQB1 第2 外顯子序列:AY444363、EU294404、DQ092798、U62321。圖5 顯示，所有DQB1第2 外顯子的同源性都很高，其中牛和羊的同源性很高且最終匯聚為一支，2 個(gè)綿羊品種的等位基因A、G、C 分別與HQ728669、HQ728686、AH001247 同源性高達(dá)99%以上，且等位基因J 和K 聚合為一類，遺傳距離(同源性)為100%。

圖4 OLA-DQB1 基因第2 外顯子等位基因編碼的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.4 Amino acid sequences alignment of DQB1 gene exon 2 alleles

表1 DQB1 基因第2 外顯子遺傳多態(tài)性分析Table 1 The genetic polymorphisms of DQB1 gene exon 2

表2 乳房炎陰性和陽(yáng)性甘肅高山細(xì)毛羊DQB1 基因第2 外顯子等位基因頻率Table 2 Allele frequencies of the DQB1 gene exon 2 gene in mastitis-infected and healthy Gansu alpine fine-wool sheep

表3 乳房炎陰性和陽(yáng)性小尾寒羊DQB1 基因第2 外顯子等位基因頻率Table 3 Allele frequencies of DQB1 gene exon 2 gene in mastitis-infected and healthy small tail Han sheep

圖5 OLA-DQB1 基因第2 外顯子核苷酸序列的NJ 樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on the OLA-DQB1 gene nucleotide sequences by Neighbor-joining

3 討論

3.1 DQB1 基因第2 外顯子的多態(tài)性

核苷酸的變異是形成MHC 基因高度多態(tài)性的原因［7］，MHC-DQB1 基因外顯子2 作為抗原結(jié)合位點(diǎn)，其多態(tài)性和重要性成為近年來(lái)家畜抗病育種研究的一個(gè)熱點(diǎn)。Amills 等［8］在薩能奶山羊DQB1 基因外顯子2 中發(fā)現(xiàn)了5 個(gè)等位基因;刑鳳等［9］利用PCR-RFLP 方法從萊蕪黑山羊、波爾山羊、魯波山羊的DQB 基因外顯子2 檢測(cè)到4 個(gè)等位基因，7 個(gè)基因型。申紅等［10］利用PCR-RFLP 方法，在中國(guó)美利奴羊MHC-DQB1 基因外顯子2 的酶切檢測(cè)中，共檢測(cè)到了20 種等位基因。本研究針對(duì)甘肅高山細(xì)毛羊和小尾寒羊的MHC-DQB1 基因外顯子2 的多態(tài)性進(jìn)行了初步研究，共發(fā)現(xiàn)了14 個(gè)單倍型序列，具有高度多態(tài)性。這可能與甘肅高山細(xì)毛羊和小尾寒羊生存的惡劣環(huán)境等因素有關(guān)。作為評(píng)價(jià)群體遺傳變異的重要指標(biāo)包括遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)等，它們的高低反應(yīng)群體均質(zhì)度，其數(shù)值越高，遺傳變異越大，遺傳多樣性越豐富，遺傳潛力就越大。本研究2 個(gè)綿羊種群的PIC 含量均大于0.5，且各等位基因之間存在大量的多態(tài)性位點(diǎn)，表明該基因?yàn)槎鄩A基突變，表現(xiàn)高度多態(tài)性，表明該群體具有豐富的遺傳多態(tài)性和較高的遺傳價(jià)值。將檢測(cè)到的單倍型克隆測(cè)序結(jié)果與GenBank 上已有的序列進(jìn)行比對(duì)，表明為新發(fā)現(xiàn)的等位基因。

3.2 DQB1 基因第2 外顯子與乳房炎的關(guān)聯(lián)性分析

采用免疫遺傳標(biāo)記開(kāi)展選育工作，可以提高畜禽抗病能力［11-12］。在動(dòng)物抗病育種中，MHC 基因已被證實(shí)為重要的候選基因［13］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)對(duì)人類［14］、牛［15］、豬［16-17］、羊［18］、家禽等MHC 基因的多態(tài)性和抗病性研究分析，確立了與抗病育種相關(guān)的遺傳位點(diǎn)。Sharif 等［19］報(bào)道BoLA-DRB3 第2 外顯子與牛奶中的體細(xì)胞數(shù)和奶牛乳房炎的發(fā)病率極顯著相關(guān)。張千夫等［20］用PCR-RFLP 方法在對(duì)Bo-LA-DRB3 基因分別被RsaⅠ和Hae Ⅲ酶切后不同基因型對(duì)牛體細(xì)胞評(píng)分的影響研究中，發(fā)現(xiàn)RsaⅠAD型的體細(xì)胞數(shù)顯著高于RsaⅠEG 型。楊冬英等［21］利用PCR-RFLP 技術(shù)對(duì)南陽(yáng)黃牛、秦川黃牛BoLADRB3 基因第2 外顯子多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，BoLA-DRB3 基因第2 外顯子經(jīng)限制性內(nèi)切酶BstUⅠ酶切后表現(xiàn)多態(tài)性且奶牛AA 型個(gè)體顯著高于黃牛品種，并認(rèn)為BoLA 等位基因A 可能為母牛乳房炎易感性的基因。高樹(shù)新等［22］采用PCR-SSCP 技術(shù)，檢測(cè)到2 種兼用型牛BoLA-DQB 基因外顯子2的多態(tài)性與牛乳房炎發(fā)生存在關(guān)聯(lián)性，但其關(guān)聯(lián)因品種不同而不同。目前在綿羊MHC-DQB 與疾病相關(guān)性研究中，大多是其與包蟲(chóng)病相關(guān)性的研究［23］。本研究采用PCR-SSCP 方法檢測(cè)了甘肅高山細(xì)毛羊和小尾寒羊的MHC-DQB1 基因第2 外顯子多態(tài)性，并與乳房炎的抗病和易感性進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)綿羊品種DQB1 基因外顯子2 的多態(tài)性與乳房炎發(fā)生存在關(guān)聯(lián)性。在甘肅高山細(xì)毛羊中等位基因B 在陽(yáng)性中出現(xiàn)較少，相對(duì)危險(xiǎn)估計(jì)值(RR=0.158 ＜1)較低，初步判斷可能為乳房炎的抗性等位基因;而等位基因F 和L 在甘肅高山細(xì)毛羊的陰性中出現(xiàn)較少，相對(duì)危險(xiǎn)估計(jì)值(RR=3.513，RR=10.197)較高，提示與甘肅高山細(xì)毛羊乳房炎易感性具有較強(qiáng)相關(guān)性;等位基因A(0.01 ＜P ＜0.05，RR=0.878 ＜1)為小尾寒羊乳房炎抗性等位基因，而等位基因E (P ＜0.01，RR= 3.333)和M (P ＜0.01，RR=8.000)為小尾寒羊乳房炎易感性等位基因。種群內(nèi)不同等位基因在乳房炎陰性、陽(yáng)性間分布存在差異，可能與不同個(gè)體對(duì)乳房炎的抗病力或者敏感性上存在差異有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)2 個(gè)綿羊陽(yáng)性種群中均沒(méi)有等位基因A、D、N ，而等位基因I僅在陽(yáng)性小尾寒羊中存在，這可能是卡方適合性檢驗(yàn)該群體偏離哈德溫伯格平衡的原因，也可能與樣本含量小以及所選擇的群體有相關(guān)。

3.3 DQB1 基因第2 外顯子基因聚類分析

在DQB1 第2 外顯子的序列系統(tǒng)發(fā)育分析中，這2 個(gè)綿羊群體DQB1 基因序列呈現(xiàn)為明顯的兩支，最初可能是由2 個(gè)等位基因分化來(lái)的。系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)這2 個(gè)綿羊群體DQB1 基因與下載的牛DQB1 基因序列具有較高的同源性，表明綿羊和牛的DQB1 基因最早可能來(lái)自于分化以前的共同祖先的原始序列。這也證明了源于共同祖先的MHC 基因，在環(huán)境壓力下有著不同演變?nèi)∠?。綿羊與牛的DQB1 基因序列有著較高的同源性，而且綿羊的等位基因與牛的一些等位基因之間的遺傳距離比綿羊自身之間的遺傳關(guān)系還要近，可能是綿羊DQB1 基因與牛的DQB1 基因在特定抗原的刺激下，發(fā)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)具有相似性［24］。

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