枸杞酸性轉(zhuǎn)化酶基因的克隆與表達

趙建華, 李浩霞, 尹 躍, 安 巍, 王華芳, 王亞軍, 石志剛

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083;2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院/國家枸杞工程技術(shù)研究中心,寧夏銀川 750002; 3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所,寧夏銀川 750002)

枸杞酸性轉(zhuǎn)化酶基因的克隆與表達

趙建華1,2, 李浩霞3, 尹 躍2, 安 巍2, 王華芳1, 王亞軍2, 石志剛2

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083;2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院/國家枸杞工程技術(shù)研究中心,寧夏銀川 750002; 3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所,寧夏銀川 750002)

以枸杞果實為試驗材料,利用RACE技術(shù)克隆枸杞酸性轉(zhuǎn)化酶基因LbAI的全長cDNA序列,應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析LbAI預(yù)期編碼蛋白質(zhì)特征;采用氣相色譜法和實時熒光定量PCR技術(shù),分析不同發(fā)育階段枸杞果實及不同顏色成熟果實中可溶性糖含量及LbAI在果實中的相對表達量。結(jié)果顯示:LbAI的cDNA序列全長2 252 bp,開放閱讀框(ORF)長1 920 bp,編碼642個氨基酸,LbAI編碼的蛋白質(zhì)相對分子量和等電點(pI)分別為70 600和5.9,GenBank登錄號為KM191309。進化樹分析結(jié)果顯示,枸杞與馬鈴薯和番茄的親緣關(guān)系最近,相似性在85%以上。隨著果實生長發(fā)育,枸杞果實中果糖和葡萄糖含量不斷升高,而蔗糖呈現(xiàn)出降低趨勢;不同顏色枸杞果實中糖含量差異較大,成熟紅色和黃色果實中果糖和葡萄糖含量顯著高于黑色果實,但蔗糖含量在黑色果實中最高,在紅色果實中最低;LbAI相對表達與果實中葡萄糖含量變化基本一致。表明LbAI基因在枸杞果實糖積累過程中具有重要的作用。

枸杞;酸性轉(zhuǎn)化酶;基因克隆;表達;可溶性糖

枸杞為茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)多年生落葉灌木,具有很強的抗逆性,是改良鹽堿地的先鋒樹種[1-3],其果實中含有豐富的糖類物質(zhì)[4]。糖是果實品質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)的主要成分,也是色素、氨基酸、維生素和芳香物質(zhì)等其他營養(yǎng)成分合成的基礎(chǔ)原料,還參于新陳代謝和能量供給,并在細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著信號分子的作用[5-6]。轉(zhuǎn)化酶是調(diào)節(jié)蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一,在枸杞糖積累過程中發(fā)揮著主要作用[7-8]。因此,克隆枸杞轉(zhuǎn)化酶基因,對其進行生物信息學(xué)和表達特性分析,進一步研究轉(zhuǎn)化酶在枸杞果實發(fā)育過程中糖積累的作用具有重要意義。

轉(zhuǎn)化酶廣泛存在于高等植物中,不同組織存在著多種轉(zhuǎn)化酶同工酶形式,主要包括酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)和堿性或中性轉(zhuǎn)化酶(NI)。酸性轉(zhuǎn)化酶可分為可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶和不可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶[9-10]。可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶主要存在于液泡中,其活性升高常與植物幼嫩組織的快速生長、貯藏器官的迅速膨大相關(guān),其機理可能是蔗糖被AI分解為果糖和葡萄糖,導(dǎo)致液泡滲透壓升高,從而誘導(dǎo)液泡生長和細胞分裂[11-12]。AI酶活性的缺乏是蔗糖積累的先決條件,酶活性高于臨界閥值時將不再積累高濃度的蔗糖,主要起分解蔗糖作用[13]。枸杞果實轉(zhuǎn)色前后枸杞果實中AI活性明顯升高,糖的積累以葡萄糖和果糖為主[14],在成熟寧夏枸杞果實中,葡萄糖和果糖含量與AI和NI均呈極顯著正相關(guān),糖積累也以果糖和葡萄糖為主,且蔗糖含量很低[7,15]。王麗娟等[16]以寧夏枸杞為試驗材料,克隆得到了枸杞可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(SAI)的全長,并發(fā)現(xiàn)該基因在枸杞花中表達量最高,在根中表達水平較低。有關(guān)枸杞酸性轉(zhuǎn)化酶(LbAI)分子水平研究相對滯后,克隆的枸杞SAI基因在果實不同發(fā)育時期基因表達與糖含量的關(guān)系及其參與果實糖積累的分子機制鮮有報道。本研究采用RACE-PCR技術(shù)克隆枸杞AI的cDNA全長,并用生物信息學(xué)分析該基因的序列特征。在此基礎(chǔ)上,利用GC法和qRT-PCR技術(shù)分別對不同發(fā)育階段枸杞果實中糖含量及LbAI相對表達量進行測定分析,以期為枸杞果實糖積累的分子機理研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗以國家枸杞工程技術(shù)研究中心枸杞種質(zhì)資源圃保存的寧杞1號、黃果枸杞和黑果枸杞十年生枸杞樹為材料。采集寧杞1號開花后9 d、15 d、22 d、27 d和34 d的果實,黃果枸杞和黑果枸杞采集成熟果實,并分別進行糖含量測定和熒光定量分析。所有供試材料采樣后迅速置于液氮中,在-80℃冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成 采用Trizol提取液提取寧杞1號成熟果實中總RNA,提取過程參照Trizol試劑盒(天根生化科技有限公司產(chǎn)品)說明書進行。cDNA第一鏈的合成使用試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit& DNase I(Thermo Scientific公司產(chǎn)品)完成。

1.2.2 目的基因中間片段克隆 根據(jù)NCBI公布的茄科植物(馬鈴薯、番茄、煙草等)酸性轉(zhuǎn)化酶基因保守區(qū)的核苷酸序列,運用Primer 5.0軟件設(shè)計兼并引物F1和R1(表1)。PCR擴增體系(50.0 μl),包括10×PCR bufferEx Taq5.0 μl、dNTP(2 mmol/L)5.0 μl、上下游引物各(10 μmol/L)2.0 μl、模板cDNA 1.0 μl、Ex Taq(5 U/μl)0.5 μl、dd H2O 34.5 μl。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min;98℃變性10 s,60℃退火30 s,68℃延伸1 min 30 s, 30個循環(huán);68℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物純化后與載體pMD18T(TaKaRa公司產(chǎn)品)進行連接,然后轉(zhuǎn)到感受態(tài)細胞上,挑選陽性克隆送到華大基因測序。

1.2.3 目的基因5′端序列克隆 根據(jù)克隆出中間片段,設(shè)計引物GSP1、GSP2和GSP3(表1)。采用Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Version 2.0)試劑盒進行目的基因的5′端序列克隆。使用SUPERSCRIPTⅡRT酶和引物GSP1對總RNA進行目的基因第一鏈cDNA的合成,用RNase Mix對合成的cDNA進行去RNA處理,使用DNA純化系統(tǒng)對經(jīng)RNAase處理過的cDNA進行純化,然后,用TdT酶和dCTP對純化后的cDNA進行末端加上多聚C(dC)。以引物GSP2和試劑盒里自帶的橋連鉚釘引物AAP對已經(jīng)加dC尾的cDNA進行PCR第一輪擴增,擴增體系(50.0 μl),包括ddH2O 31.5 μl、10×PCR buffer 5.0 μl、MgCl2(25 mmol/L)3.0 μl、dNTP(10 mmol/L) 1.0 μl、GSP2(10 μmol/L)2.0 μl、Abridged Anchor Primer(10 μmol/L)2.0 μl、dC-tailed cDNA 5.0 μl、DNA聚合酶(5 U/μl)0.5 μl。擴增程序為94℃預(yù)變性2 min;94℃變性為1 min,55℃退火45 s,72℃延伸1.2 min,35個循環(huán);72℃延伸5 min。取出第一輪PCR產(chǎn)物5 μl,用引物GSP3和試劑盒里自帶的通用擴增引物AUAP進行巢式PCR第二輪擴增,擴增程序為94℃預(yù)變性2 min;94℃變性為1 min,54℃退火45 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán); 72℃延伸5 min,5℃保存。PCR產(chǎn)物純化后與載體pMD18T(TaKaRa公司產(chǎn)品)進行連接,然后轉(zhuǎn)到感受態(tài)細胞上,挑選陽性克隆送到深圳華大基因科技有限公司測序。

1.2.4 目的基因3′端序列克隆 根據(jù)克隆出的中間片段,設(shè)計引物3′461-1和3′461-2(表1)。采用Clontech公司生產(chǎn)的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒進行目的基因的3′端序列克隆。使用逆轉(zhuǎn)錄酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase和引物3′CDS primer A對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以引物3′461-1和UPM,對合成的cDNA為模板進行第一輪PCR擴增,擴增體系(50 μl),包括ddH2O 31.0 μl、10×Advantage 2 PCR buffer 5.0 μl、50×Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μl、dNTP(10 mmol/L)1.0 μl、3′461-1引物(10 μmol/L)2.0 μl、UPM引物(10X)5.0 μl、cDNA 5.0 μl。擴增程序為94℃變性4 min;94℃30 s,72℃3 min,5個循環(huán);94℃30 s,70℃30 s,72℃3 min, 5個循環(huán);94℃30 s,68℃30 s,72℃3 min,27個循環(huán)。將第一輪PCR擴增產(chǎn)物稀釋50倍后,用引物3′461-2和UPM進行第二輪PCR擴增。擴增程序為94℃變性4 min;94℃30 s,72℃3 min,5個循環(huán);94℃30 s,70℃30 s,72℃3 min,5個循環(huán); 94℃30 s,68℃30 s,72℃3 min,27個循環(huán),5℃保存。PCR產(chǎn)物純化后與載體pMD18T(TaKaRa公司產(chǎn)品)進行連接,然后轉(zhuǎn)到感受態(tài)細胞上,挑選陽性克隆送到深圳華大基因科技有限公司測序。

1.2.5 全長cDNA拼接驗證 運用ContigExpress軟件對酸性轉(zhuǎn)化酶基因的中間片段、5′片段、3′片段進行拼接,利用NCBI網(wǎng)站上Open Reading Frame Finder軟件對拼接結(jié)果進行編碼區(qū)分析。在編碼區(qū)序列兩端設(shè)計1對引物F2和R2(表1),對拼接結(jié)果進行PCR擴增驗證。擴增體系(50.0 μl):包括10×PCR bufferEx Taq5.0 μl、dNTP(2 mmol/L)5.0 μl、引物各(10 μmol/L)2.0 μl、模板cDNA 1.0 μl、Ex Taq(5 U/μl)0.5 μl、ddH2O 34.5 μl。擴增程序為94℃變性4 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃3min,35個循環(huán);72℃10 min,5℃保存。PCR產(chǎn)物純化后與載體pMD18T(TaKaRa公司產(chǎn)品)進行連接,然后轉(zhuǎn)到感受態(tài)細胞上,挑選陽性克隆送到深圳華大基因科技有限公司測序。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 利用網(wǎng)站(http:// www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)分析LbAI基因所編碼蛋白質(zhì)的等電點和分子量,并利用DNAStar軟件生成LbAI氨基酸序列進化樹,分析其進化關(guān)系。利用MEGA5.0軟件進行基因氨基酸序列同源性比較。

1.2.7 實時熒光定量表達分析 根據(jù)LbAI的全長cDNA序列設(shè)計PCR引物F3和R3(表1),以枸杞18S基因作為內(nèi)參基因,設(shè)計引物18S-F和18S-R (表1)。不同發(fā)育階段枸杞果實和不同顏色枸杞果實RNA提取第一鏈cDNA的合成按照方法1.2.1進行,采用BIO-RAD CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)進行試驗,使用Power SYBR?Green PCR Master Mix(Applied Biosystems?)試劑,反應(yīng)體系為2×SYBR PCR Mix 10.0 μl、正反向引物各0.5 μl、cDNA 0.5 μl,加水至20.0 μl,每個樣品設(shè)計3個重復(fù)。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性3 min;95℃10 s,55℃30 s,72℃30 s,40個循環(huán);65℃開始以1 s 0.5℃逐步升溫至95℃。反應(yīng)完成后進行溶解曲線分析,參照2-△△CT法計算基因的相對表達量。

1.2.8 可溶性糖測定 參照Zhao等[4]方法,用氣相色譜法測定枸杞果實中的可溶性糖含量。采用Microsoft Excel 2003對可溶性糖含量和相對表達量進行作圖分析。

表1 所用引物序列Table 1 Primes used in the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞LbAI的克隆與分析

在NCBI中依據(jù)登錄的茄科植物酸性轉(zhuǎn)化酶基因的保守區(qū)域設(shè)計兼并引物F1和R1,克隆出枸杞AI中間片段(圖1),測序結(jié)果為830 bp。根據(jù)得到的中間保守序列設(shè)計5′和3′末端的RACE引物,5′端片段測序結(jié)果為502 bp(圖1),3′端片段測序結(jié)果1 058 bp(圖1)。將克隆到的3個部分片段利用ContigExpress軟件進行拼接,獲得了枸杞AI基因全長cDNA序列,全長2 190 bp,其中ORF為1 920 bp,編碼642個氨基酸。在編碼區(qū)設(shè)計引物F2和R2, PCR擴增產(chǎn)物見圖1,測序結(jié)果為2 252 bp,與拼接結(jié)果的編碼區(qū)大小相符,說明拼接結(jié)果正確,該基因命名為LbAI,GenBank登錄號為KM191309。

2.2 枸杞LbAI氨基酸序列及進化樹分析

枸杞LbAI的cDNA序列及其推導(dǎo)氨基酸組成如圖2所示,利用DNAStar、ORF Finder和BioXM軟件分析,該序列含有完整的開放閱讀框,編碼642個氨基酸,起始密碼子為ATG,終止密碼子為TAA,編碼產(chǎn)物的分子量為70 600,等電點為5.9;其中酸性氨基酸(Asp+Glu)60個,堿性氨基酸(Arg+Lys)50個。脂肪系數(shù)為84.19,不穩(wěn)定參數(shù)為40.21,根據(jù)不穩(wěn)定參數(shù)值在40以下為穩(wěn)定蛋白質(zhì),可推斷LbAI所編碼的蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

圖1 枸杞LbAI的中間片段、5′片段、3′片段和全長PCR電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product in intermediate,5′RACE,3′RACE and full-length of LbAI gene

經(jīng)過NCBI網(wǎng)站和BLAST比對,發(fā)現(xiàn)LbAI的核苷酸序列與馬鈴薯(ABF18956.1)、番茄(ADE44160.1)和甜瓜(ABX55832.1)的LbAI核苷酸序列相似性較高,分別為86%、85%和85%;與水稻(AAD10239.1)和苜蓿(AES90955.2)的LbAI核苷酸序列相似性較低,分別為66%和60%。將枸杞與以上5個物種進行氨基酸序列多重比對(圖3),利用Mega6.06軟件將LbAI與NCBI檢索的酸性轉(zhuǎn)化酶進行氨基酸序列比對,并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果(圖4)顯示,枸杞與馬鈴薯、番茄等茄科植物親緣關(guān)較近;與梨和苜蓿等關(guān)系較遠。

圖2 枸杞LbAI基因的cDNA序列及其所推導(dǎo)氨基酸序列Fig.2 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of LbAI gene

圖3 枸杞LbAI基因編碼的氨基酸序列與其他物種同源氨基酸序列多重比對Fig.3 Alignment of the deduced amino acid sequences of wolfberry LbAI and other species

圖4 枸杞LbAI基因編碼的氨基酸序列與其他植物L(fēng)bAI基因編碼的氨基酸序列的發(fā)育樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of wolfberry and other species based on LbAI amino acid sequence

2.3 枸杞LbAI表達分析

2.3.1 不同發(fā)育階段枸杞果實中LbAI表達模式

通過qRT-PCR研究LbAI在不同發(fā)育階段枸杞果實中表達情況(圖5A),并利用氣相色譜法分析不同發(fā)育階段枸杞果實中果糖、葡萄糖和蔗糖含量變化(圖5B)。發(fā)現(xiàn)LbAI在開花后9～14 d相對表達量顯著降低,在開花后14～25 d表達量緩慢降低,在開花后25 d達到最低,之后快速升高,開花后34 d(果實成熟期)的LbAI相對表達量升至最高。

糖含量測定結(jié)果(圖5B)顯示,枸杞果實中果糖和葡萄糖含量隨著果實生長發(fā)育逐漸升高,在開花后34 d(果實成熟期)的升至最高,即為40.7 mg/g和2.49 mg/g;果實中蔗糖含量隨著果實生長發(fā)育逐漸降低,在開花后34 d的降至最低,即為0.68 mg/g。比較分析不同發(fā)育階段枸杞果實中LbAI表達量與果實中果糖、葡萄糖和蔗糖含量變化的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)果實中LbAI表達量與果糖和葡萄糖含量成線性正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.627和0.748,而與蔗糖含量成線性負相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.519。可見,在果實發(fā)育過程中,LbAI對果實中葡萄糖含量影響較大。

圖5 不同發(fā)育時期枸杞果實中LbAI基因表達量及糖含量Fig.5 Expression level of LbAI and sugar contents in wolfberry fruits at different growth and developmental stages

2.3.2 不同顏色果實中LbAI表達模式 通過對不同顏色枸杞成熟果實中LbAI的qRT-PCR分析(圖6A),發(fā)現(xiàn)該基因在黃色果實中相對表達量最高,在黑色果實中最低,紅色果實居中,其中,黃色果實中表達量是紅色果實的1.1倍,是黑色果實的300倍。分析不同顏色枸杞成熟果實中糖含量變化,結(jié)果(圖6B)顯示,果糖在紅色果實中最高,為40.7 mg/g;葡萄糖在黃色果實中最高,為2.8 mg/g;果糖與葡萄糖在黑色果實中均最低,分別為7.7 mg/g和1.1 mg/g)。蔗糖在黑色果實中最高,為1.38 mg/g;在紅色果實中最低,為0.68 mg/g。比較不同顏色枸杞果實中LbAI表達量與果實中果糖、葡萄糖和蔗糖含量變化的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)果實中LbAI表達量與果糖、葡萄糖含量成線性正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.496和0.996,而與蔗糖含量成線性負相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.995?？梢?LbAI對不同顏色果實中葡萄糖和蔗糖含量影響較大。

圖6 不同顏色枸杞果實中LbAI基因表達量及糖含量Fig.6 Expression level of LbAI and sugar contents in differently-coloured fruit of wolfberry

3 討論

自從胡蘿卜中分離出第一個酸性轉(zhuǎn)化酶基因[17]以來,現(xiàn)已從番茄[18]、馬鈴薯[19]、擬南芥[20]、葡萄[21]、甜瓜[12]、甘蔗[22]等多種作物中分離到編碼該酶的全長或部分核苷酸序列。這些基因分為兩大類:一類是堿性等電點的與細胞壁緊密相連轉(zhuǎn)化酶,另一類是酸性等電點的液泡酸性轉(zhuǎn)化酶[23]。本研究通過同源克隆法從寧夏枸杞果實中成功獲得AI的cDNA序列,并擁有完整的編碼框,根據(jù)AI基因編碼的氨基酸序列分析,枸杞與其他茄科物種具有很高的同源性。利用PSORT在線服務(wù)器進行AI基因所編碼蛋白質(zhì)亞細胞定位,發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)可能位于液泡上,可見,LbAI屬于液泡酸性轉(zhuǎn)化酶基因。

本研究通過qRT-PCR技術(shù),分析寧夏枸杞不同發(fā)育階段果實中LbAI表達特征,發(fā)現(xiàn)隨著果實生長發(fā)育LbAI表達水平呈現(xiàn)出高-低-高趨勢,其中,成熟果實中LbAI高度表達,且顯著高于其他發(fā)育階段。這與番茄TIAI在成熟果實中高度表達相一致[24],但不同于甜橙AI在果實成熟過程中的逐漸減弱表達[25]。本研究發(fā)現(xiàn)LbAI表達高峰在枸杞果實成熟期。前人對玉米[26]和木薯[27]的轉(zhuǎn)化酶基因的研究也得出相似的結(jié)論。本研究對不同顏色成熟枸杞果

實中LbAI的表達分析發(fā)現(xiàn)LbAI在3份枸杞材料中都有表達,且在黃色果實中表達量最高,在黑色果實中最低,紅色果實居中。這些結(jié)果表明LbAI參與不同顏色枸杞果實的生長發(fā)育,其在黃色果實中的高表達有利于促進果糖積累,這與AI參與甘蔗和甜橙調(diào)節(jié)果實中糖分積累[22,28]相一致,但該基因是否與枸杞果實花色素苷生物合成有關(guān)需要進一步研究。本研究測定了寧夏枸杞不同發(fā)育階段和不同顏色果實中糖含量,隨著果實的發(fā)育果糖和葡萄糖含量顯著升高,而蔗糖含量不斷降低,這與其他研究一致[4],且果糖和葡萄糖含量和LbAI表達量從開花后

14 d大體上呈現(xiàn)出相似變化趨勢,在果實成熟期兩者均達到最高值;不同顏色果實中糖含量為紅色果實果糖含量最高,黃色果實中葡萄糖含量最高,黑色果實中兩者含量均最低。枸杞果實中葡萄糖含量和

LbAI表達量呈現(xiàn)出較高的一致性(r=0.996**),這說明LbAI對枸杞果實中糖積累具有主要作用。有關(guān)果實中LbAI是否還有其他功能還有待于進一步的研究。

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(責(zé)任編輯:袁 偉)

Cloning and expression of acid invertase gene(LbAI)in wolfberry(Lycium barbarum L.)

ZHAO Jian-hua1,2, LI Hao-xia3, YIN Yue2, AN Wei2, WANG Hua-fang1, WANG Ya-jun2, SHI Zhi-gang2
(1.College of Biological Sciences and Technology,Beijing Forestry University,Beijing100083,China;2.Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences/National Wolfberry Engineering Research Center,Yinchuan 750002,China;3.Desertification Control Research Institute,Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences,Yinchuan 750002,China)

The acid invertase gene(LbAI)full-length cDNA sequence from the fruits of wolfberry(Lycium barbarum L.)was clone by rapid amplification of cDNA ends(RACE),the features of LbAI-encoded protein were analyzed by bioinformatics software,and the patterns of gene expression and accumulation of soluble sugars at different fruits growth stages and differently-colored fruits of wolfberry were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR(qRT-PCR)and gas chromatography(GC).The full length of LbAI cDNA sequence was 2 252 bp,containing a 1920 bp open reading frame(ORF)which encoded 642 amino acids with a relative molecular mass of 70 600 and isoelectric point (pI)of 5.9.The phylogenetic tree showed that LbAI had the closest genetic relationship with Solanum tuberosum and S.lycopersicum,with the similarities above 85%.The contents of glucose and fructose increased along with thefruit growth and development,while sucrose content declined.The contents of glucose and fructose in red and yellow fruits were significantly higher than those in black fruit at maturity.The content of sucrose in black fruit was the highest and in red fruit was the lowest.The expression level of LbAI was consistent with the glucose content in fruits.It was suggested that LbAI might play an important role in sugar accumulation of wolfberry fruits.

wolfberry;acid invertase;gene cloning;expression;soluble sugar

S567;Q785

A

1000-4440(2015)05-1140-09

趙建華,李浩霞,尹 躍,等.枸杞酸性轉(zhuǎn)化酶基因的克隆與表達[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2015,31(5):1140-1148.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.05.031

2015-03-09

國家自然科學(xué)基金項目(31360191、31060104);寧夏自然科學(xué)基金項目(NZ13125);寧夏農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新先導(dǎo)基金項目(NKYJ-14-07)

趙建華(1977-),男,甘肅靖遠人,博士,副研究員,主要從事枸杞種質(zhì)創(chuàng)新與利用研究。(Tel)0951-6886792; (E-mail)zhaojianhua0943@163.com

王華芳,(E-mail)hfwang@bjfu.edu.cn