基于綠色熒光蛋白瞬時表達的植物亞細胞定位方法

于一帆　朱小彬　葛會敏　陳云

摘要：細胞是生命活動的基本單位，各種蛋白質(zhì)都按照其功能有序地分布在細胞的每個分區(qū)中。蛋白質(zhì)的亞細胞定位是功能基因組學(xué)的重要內(nèi)容。目前植物蛋白質(zhì)的亞細胞定位方法中應(yīng)用較普遍的是借助于報告基因表達產(chǎn)物來實現(xiàn)目標蛋白定位的融合報告基因定位法，其中綠色熒光蛋白應(yīng)用最為廣泛。綜述了基于綠色熒光蛋白瞬時表達的植物亞細胞定位方法，包括擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達、煙草葉片瞬時表達、洋蔥表皮細胞瞬時表達等，同時對上述幾種方法進行了比較分析。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)；亞細胞定位；綠色熒光蛋白；瞬時表達

中圖分類號： Q-33文獻標志碼： A

文章編號：002-302（204）2-0058-04

蛋白質(zhì)是生物功能的直接體現(xiàn)者，有序分布、動態(tài)調(diào)控的蛋白質(zhì)是保證生命個體正常生長發(fā)育的前提?；虮磉_產(chǎn)物在組織中的亞細胞定位是功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的重要研究內(nèi)容之一，是系統(tǒng)理解植物形態(tài)建成、生長發(fā)育以及對逆境的耐受性、抵抗性不可或缺的環(huán)節(jié)，也是生物學(xué)家們初步推斷蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的重要依據(jù)。蛋白質(zhì)的亞細胞定位可采取多種方法，包括生物信息學(xué)預(yù)測、免疫膠體金標記[2]、多肽序列分析[3]以及與報告基因融合瞬時表達[4]等。目前植物蛋白的亞細胞定位應(yīng)用主要是借助于融合報告基因定位法，其中綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GF）應(yīng)用最為廣泛。瞬時表達技術(shù)結(jié)合報告基因，可以有效跟蹤融合產(chǎn)物在細胞內(nèi)的運輸、亞細胞定位及代謝[5]。GF是水母（Aequorea victoria）體內(nèi)的天然蛋白，自994年Chalfie等揭示了該蛋白作為報告蛋白的潛在應(yīng)用價值[6]以來，已作為報告蛋白在多種植物、動物、微生物中成功獲得表達。由于GF作為報告蛋白不需抗體、輔助因子、酶底物等其他成分，也不影響宿主細胞，因而可以鑒定、跟蹤、分選表達GF的細胞；同時可以在活細胞中進行圖像分析，在固定細胞中進行檢測[7]。瞬時表達（transient expression）是指引入細胞的外源DNA與宿主細胞染色體DNA并不發(fā)生整合，而是隨載體進入細胞，約2 h左右可表達，基因產(chǎn)物在2～4 d內(nèi)即可被檢測出，是種快速研究基因表達、蛋白質(zhì)亞細胞定位及基因間互作的重要手段。瞬時表達能表達多種外源基因，具有時間短、重復(fù)性好等優(yōu)點，彌補了常規(guī)轉(zhuǎn)基因方式中周期長、轉(zhuǎn)化效率低等缺點[8]。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因相比，瞬時表達不需要整合到染色體上，因此具有簡單、快速、周期短、準確等優(yōu)點[9]。瞬時表達不受基因位置效應(yīng)、基因沉默的影響，表達效率較穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率高。目前，植物瞬時表達系統(tǒng)已被陸續(xù)應(yīng)用到生物學(xué)研究中，如利用該系統(tǒng)進行基因功能的鑒定分析、發(fā)現(xiàn)新型強啟動子、蛋白質(zhì)互作、亞細胞定位等。亞細胞定位瞬時表達的宿主載體主要有擬南芥原生質(zhì)體、煙草葉片、洋蔥表皮細胞等。本研究對常用的基于綠色熒光蛋白瞬時表達的植物蛋白質(zhì)亞細胞定位方法進行總結(jié)，并對相關(guān)研究進行展望，以期更高效地進行植物蛋白質(zhì)的亞細胞定位。

擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達

擬南芥瞬時表達系統(tǒng)由en Sheen教授實驗室建立并完善[0]。該方法在蛋白定位、啟動子研究以及蛋白質(zhì)相互作用等方面很有效。擬南芥（Arabidopsis thaliana）是種模式植物，一直以來，擬南芥原生質(zhì)體都是植物基因工程、植物細胞學(xué)研究的經(jīng)典材料。原生質(zhì)體作為種細胞水平的研究系統(tǒng)，由于沒有細胞壁等特點，它可以排除細胞之間的相互影響，單獨考察個細胞的全能性。原生質(zhì)體是個均一性程度很好的群體，并且在短時間內(nèi)就能獲得大量原生質(zhì)體。原生質(zhì)體是個理想的試驗系統(tǒng)，由于不受植物細胞壁的限制，其質(zhì)膜經(jīng)一定處理可以攝取外源物質(zhì)（如細胞器、病毒、DNA等），是遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體系統(tǒng)。研究表明，不同植物材料所得到的原生質(zhì)體可以保持原組織的生理生化特性，可以取代植物組織作為理想的試驗材料。

EG-Ca2 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

聚乙二醇（EG）作為種高分子化合物，20%～50%的濃度能對原生質(zhì)體產(chǎn)生瞬間沖擊效應(yīng)，使原生質(zhì)體很快發(fā)生收縮。EG也能連接Ca2等陽離子，Ca2可在帶負電荷的質(zhì)粒DNA、EG之間形成橋，從而促使質(zhì)粒進入原生質(zhì)體。EG-Ca2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是擬南芥瞬時表達體系最常用的方法。該方法的技術(shù)流程是：擬南芥土培3～4周，生長過程中要求光周期較短（～2 h）。用解剖刀將符合要求的葉片切成細小的小段，溶于5 mL酶液中（纖維素酶0225 g，離析酶02 5 g，甘露醇64 g，pH值為57的MES 5 mL，55 ℃ 0 min，冷卻至室溫，再加入 mol/L CaCl2 5 μL、β-巰基乙醇525 μL、牛血清白蛋白BSA 50 μL，加dd H2O至5 mL）。避光抽真空 h，40 r/min慢搖4 h，然后80 r/min 搖5 min使小片段完全酶解。用等體積W5溶液（09% NaCl、0% CaCl2、0037% KCl、2% pH值為57的 MES）稀釋，過2層300目細胞篩，用W5溶液補體積至40～50 mL，00 g平甩離心5 min。棄上清后，用0 mL W5溶液輕柔清洗原生質(zhì)體。用 mL Mmg溶液（093% 甘露醇、0304% MgCl2、4% MES）重懸原生質(zhì)體。00 μL原生質(zhì)體加0 μg質(zhì)粒，然后加入等體積EG/Ca2 溶液（9% 甘露醇、0% CaCl2、40% EG 4000），緩慢輕柔混勻，25 ℃暗培養(yǎng)0～5 min。逐滴加入440 μL W5溶液。加 mL WI溶液（093% 甘露醇、4% MES、003% KCl）重懸，槍頭輕打混勻。鏡檢計數(shù)后置于培養(yǎng)板25 ℃過夜培養(yǎng)，使用熒光倒置顯微鏡觀察熒光[2]。

2電擊穿孔法

在適宜的高壓電脈沖作用下，原生質(zhì)體細胞膜形成可修復(fù)的微孔，親水性物質(zhì)通過這些微孔進入細胞。Langridge等采用電擊技術(shù)分別把Ti質(zhì)粒、CAT基因等導(dǎo)入胡蘿卜原生質(zhì)體并獲得瞬間表達[3-4]。此后，在煙草、油菜、大豆、水稻、小麥、高粱、玉米等植物中都實現(xiàn)了原生質(zhì)體的電擊基因轉(zhuǎn)移及其表達。就操作而言，電擊法技術(shù)簡單方便。但是影響電擊基因?qū)搿⒈磉_的因素卻是相當(dāng)復(fù)雜的[5]。

3脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是將質(zhì)粒DNA包裹在脂質(zhì)體中，然后與原生質(zhì)體接觸融合而把外源DNA帶入原生質(zhì)體的種方法。脂質(zhì)體是種由磷脂、膽固醇、脂肪酸等脂類分子組成的球形膜囊結(jié)構(gòu)，可將DNA、RNA等大分子物質(zhì)包在脂質(zhì)體內(nèi)，免受細胞內(nèi)核酸酶的降解。脂質(zhì)體可做成單層、雙層或多層。脂質(zhì)體進入原生質(zhì)體主要發(fā)生在脂質(zhì)體與原生質(zhì)體共培養(yǎng)的起始2 h，共培養(yǎng)90 min后，加入一定濃度的EG能提高脂質(zhì)體、原生質(zhì)體融合的頻率。

4植物病毒載體介導(dǎo)法

植物病毒大多為RNA，病毒載體介導(dǎo)的外源基因瞬時表達系統(tǒng)原理是將目的基因克隆到植物病毒基因組載體上的啟動子下游，通過體外轉(zhuǎn)錄后的直接侵染，或借助基因槍、農(nóng)桿菌等將其導(dǎo)入植物細胞。病毒在植物細胞間移動可以確保其進入較大范圍甚至是整株細胞中，方便在植株整體水平開展外源基因功能研究。病毒在植物細胞內(nèi)的大量復(fù)制，使外源基因的表達量獲得顯著提高，而且外源基因與病毒外殼蛋白的融合可以將外源基因產(chǎn)物展示在病毒顆粒表面，易于提取、分析[6]。植物病毒載體介導(dǎo)法的缺點是盡管植物種類繁多，且一些病毒可以侵染的宿主細胞范圍很寬，但是目前成功開發(fā)為轉(zhuǎn)化載體的病毒還很少，一些重要的作物類型還無法使用病毒侵染；病毒載體所能插入的外源片段較小，且病毒重組可能會影響表達產(chǎn)物的穩(wěn)定。

5其他轉(zhuǎn)化方法

[3]其他遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)如激光微素法[7]、顯微注射法[8]、超聲波法[9]等也正被逐步應(yīng)用到植物原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化上來。

2煙草葉片瞬時表達

煙草生長周期短、轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟，且轉(zhuǎn)基因過程簡單易操作，常被用做試驗材料進行外源功能基因的亞細胞定位，加快了功能基因的研究進程。將定位載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，利用注射法在煙草表皮細胞實現(xiàn)蛋白的亞細胞定位[20-22]，使基因功能研究更加經(jīng)濟快捷。在煙草細胞或組織中瞬時表達外源基因，當(dāng)農(nóng)桿菌細胞滲透至葉片的細胞間隙時，可以高效率地將T-DNA導(dǎo)入植物細胞核內(nèi)，達到表達外源基因并分析外源基因功能的目的[5]。采用在煙草葉片中表達外源基因的方法，最大的優(yōu)點是簡便快捷，且容易操作，但是表達外源基因的效率要低于轉(zhuǎn)基因等方法[23]。

2注射法

采用注射器直接將農(nóng)桿菌注射至葉片下表皮細胞間隙方法的技術(shù)流程是：煙草植株2 ℃土培5～6周，光周期為 4 h/d。[2]挑取農(nóng)桿菌單菌落于4 mL YEB培養(yǎng)基中，28 ℃ 200 r/min 過夜培養(yǎng)。吸取～5 mL菌液置于50 mL YEB培養(yǎng)基中，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)8 h。室溫下2 200 g離心0 min。棄上清，用50 mL滲透液（250 mg D-葡萄糖、5 mL 50 mmol/L MES、5 mL 2 mmol/L Na3O4·2H2O、5 μL mol/L 乙酰丁香酮）重懸至D600 nm為0，室溫放置至少3 h。用無菌 mL醫(yī)用注射器吸取菌液，將針頭刺入下表皮，輕輕將菌液注射進下表皮空隙中。煙草注射菌液后繼續(xù)在22～24 ℃下培養(yǎng)，36 h 后進行熒光檢測[24-25]。

22浸染法

將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落培養(yǎng)至D600 nm為0，煙草嫩葉用HgCl2溶液消毒后剪成小塊或打孔，浸入菌液3～5 min，均勻搖晃，置于固體MS培養(yǎng)基表面，暗培養(yǎng)24～72 h，撕表皮，用熒光倒置顯微鏡觀察熒光[26]。

3洋蔥表皮細胞瞬時表達

洋蔥表皮細胞結(jié)構(gòu)清晰，取材方便，是觀察細胞部分功能、外源基因瞬時表達的好材料。洋蔥表皮細胞中瞬時表達外源基因的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法2種。

3農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)作為種天然的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，已經(jīng)成為當(dāng)今植物遺傳轉(zhuǎn)化的主流方法[27]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達快速有效，其原理是將目的基因插入載體，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，采用真空滲透或注射等方法使農(nóng)桿菌與植物材料細胞接觸，大部分T-DNA進入細胞核內(nèi)進行瞬時表達，幾天后即可檢測到外源基因的表達[28]。農(nóng)桿菌滲入法的技術(shù)流程包括載體構(gòu)建、農(nóng)桿菌培養(yǎng)、針管注射浸潤、瞬時表達等部分。針對洋蔥表皮細胞的農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法主要是先將含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落培養(yǎng)至D600 nm為06，2 800 g離心0 min，棄上清，用MS（0 mmol/L MgCl2、00 μmol/L乙酰丁香酮）重懸菌液。取洋蔥球莖內(nèi)4～7層表皮滅菌，撕 cm2 內(nèi)表皮置于農(nóng)桿菌液中20 min，將內(nèi)表皮平鋪于MS固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)6 h。用熒光倒置顯微鏡觀察熒光[29]。

32基因槍轟擊法

[2]基因槍法（gene gun）介導(dǎo)的瞬時表達應(yīng)用較早，技術(shù)也較成熟?；驑尫ㄔ硎抢酶咚亠w行的微米或亞微米級惰性粒子（鎢或金粉），將包被其外的目的基因直接導(dǎo)入受體細胞，并釋放出外源DNA，使DNA在受體細胞中獲得短暫的高水平表達，從而實現(xiàn)對受體細胞的瞬時轉(zhuǎn)化。目前，基因槍轉(zhuǎn)化包括鎢粉準備、DNA包裹鎢粉微粒以及基因槍轟擊等步驟[30-3]。

4討論

目前，上述幾種方法常被用于植物蛋白質(zhì)亞細胞定位瞬時表達研究。筆者對這幾種方法分別進行比較、總結(jié)，并對各種方法的不足之處提出改進。

4以擬南芥為宿主載體

擬南芥作為模式植物，在生物學(xué)研究中十分重要。利用擬南芥進行原生質(zhì)體相關(guān)研究，能夠克服植物細胞工程領(lǐng)域的許多困難。原生質(zhì)體細胞作為遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體，可用于轉(zhuǎn)入基因的表達定位、功能分析等研究。除了可以攝取核酸大分子外，原生質(zhì)體還可以吞噬或融合細胞器以及細菌、病毒等微生物，這有可能開辟植物細胞工程研究的新領(lǐng)域[32]。然而該系統(tǒng)也有不足的地方：一方面是植物細胞壁被酶解掉了，因此不適合研究外膜蛋白，更無法研究細胞壁；另一方面，原生質(zhì)體本身存活時間一般不超過72 h，不能連續(xù)培養(yǎng)，因此不能進行長期觀察，也不能用來研究與細胞周期有關(guān)的問題。應(yīng)用最廣泛的EG-Ca2 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的不足之處也是很明顯的。首先，用于提取原生質(zhì)體的擬南芥葉片只能選取符合要求的，且葉片需要切成 mm條狀，因此要求操作技巧較高。另外還需要長時間的抽真空、搖床慢搖等，耗時長。針對這些問題，前人提出的借助膠帶提取原生質(zhì)體的方法顯然更為高效，該方法對葉片的選擇沒有任何限制，而且無需對葉片進行切割，無需抽真空處理，水平慢搖也僅需20～60 min，相比上述方法省略了大量操作，節(jié)約了時間，葉片表皮也能較好地剝離，提取原生質(zhì)體的效率更高。

42以煙草為宿主載體

采用在煙草葉片中表達外源基因的方法最大的優(yōu)點是簡便快捷，不需要酶解制備原生質(zhì)體，但是表達外源基因的效率遠遠低于轉(zhuǎn)基因等方法。煙草葉盤較大，注射時操作簡單，目的基因與對照組可在同一張葉片上進行試驗，可以更好地控制變量，但是受侵染液濃度、侵染時間影響較大。傳統(tǒng)的注射法中，注射煙草葉片都是撕取煙草葉片的下表皮，制成臨時裝片置于熒光倒置顯微鏡下觀察。然而撕取煙草葉片下表皮需要較高的技巧、較長的時間，表皮一旦撕得不好會造成大量葉肉細胞附著，嚴重影響試驗結(jié)果，且觀察到葉肉細胞自發(fā)熒光的可能性極高，對定位結(jié)果干擾較大。筆者認為，使用打孔器對轉(zhuǎn)化的煙草葉片進行打孔，或切下5 mm×5 mm的小塊，移至加滿水的0 mL注射器中，用手指堵住出口處，用力抽吸幾下，讓葉片中充滿水，將葉片置于熒光倒置顯微鏡下直接觀察下表皮即可。該方法操作簡便，無需撕取表皮，節(jié)省了時間，且觀察時消除了葉肉細胞、自發(fā)熒光對定位結(jié)果的干擾。浸染法中，對煙草的瞬時表達體系優(yōu)化為：農(nóng)桿菌的D600 nm值為06左右，侵染6 min，共培養(yǎng)2 d，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加 20 μmol/L 乙酰丁香酮，能得到較高的煙草瞬時表達率。

43以洋蔥為宿主載體

基因槍技術(shù)的優(yōu)點主要是不受宿主限制、受體類型廣泛。該法不僅可以原生質(zhì)體作為受體材料，而且可以完整細胞、組織等（如葉片、莖或根的切段、幼胚、愈傷組織、花粉細胞等）作為受體材料進行轟擊轉(zhuǎn)化，可控度高。基因槍轟擊過程中，可根據(jù)需要將射彈射入特定層次（位置）的細胞，有利于提高轉(zhuǎn)化效率?；驑尫ǖ娜毕菀彩秋@而易見的，首先是費用較高，基因槍轟擊對于植物傷害較大，轟擊位置不均勻，細胞容易因為部分受傷害過大而死亡；其次該方法還存在轉(zhuǎn)化效率低、外源基因向植物中插入不夠精確等缺點。對于基因槍法的優(yōu)化，不同植物品種之間存在較大差異。例如在水稻中，選用金粉，通過減小射擊距離，轟擊前用甘露醇進行預(yù)處理，可以提高轉(zhuǎn)化率[33]。在小麥中，通過大幅度降低金粉用量，進行滲透壓處理，同時選擇合適的受體，可以提高轉(zhuǎn)化率[34]。在大豆中，金粉尺寸為06 μm，轟擊時氦壓力值為 00 psi，真空壓力數(shù)為27 In·Hg，轟擊距離為9 cm[35]。在玉米中，最佳轟擊參數(shù)為： 350 psi氦氣壓力，25 In·Hg真空度，6 cm射擊距離[36]。目前常以洋蔥表皮細胞作為轉(zhuǎn)化材料，采用農(nóng)桿菌侵染法，從侵染液中乙酰丁香酮的濃度、農(nóng)桿菌菌液濃度和侵染時間、共培養(yǎng)時間等方面探索最適轉(zhuǎn)化條件，但是該方法的不足之處在于對膜蛋白無法做到精準定位，需要使用30%蔗糖繼續(xù)進行質(zhì)壁分離試驗才能進一步驗證定位結(jié)果[37]。

5展望

蛋白質(zhì)的亞細胞定位與其功能發(fā)揮密切相關(guān)。細胞行使功能需要由特定空間分布的蛋白質(zhì)種類、含量、修飾的動態(tài)變化來體現(xiàn)。隨著多種蛋白質(zhì)亞細胞定位技術(shù)的建立與發(fā)展，目前已經(jīng)實現(xiàn)了從單個蛋白質(zhì)的亞細胞定位到高通量進行蛋白質(zhì)亞細胞定位的技術(shù)創(chuàng)新，并且從靜態(tài)定位研究發(fā)展到活體動態(tài)研究[38]。各種定位方法的綜合運用積累了大量亞細胞定位數(shù)據(jù)，使人們了解細胞內(nèi)不同分區(qū)中蛋白質(zhì)分布的大致輪廓成為可能。近年來，水稻的細胞分區(qū)、蛋白質(zhì)組亞細胞定位研究已經(jīng)展開[39]。有學(xué)者嘗試用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）顯微測量技術(shù)來研究活細胞蛋白質(zhì)的空間分布，包括對共定位于活細胞特定部位的蛋白質(zhì)相互作用的研究，以此實時跟蹤特定蛋白質(zhì)在細胞生長發(fā)育過程中的表達、調(diào)控機制等[40-4]。蛋白質(zhì)亞細胞定位數(shù)據(jù)的積累完善，將為深入闡明蛋白質(zhì)的功能提供依據(jù)。

[HS2][HT85H]參考文獻：[HT8SS]

[ZK（#]張松，黃波，夏學(xué)峰，等 蛋白質(zhì)亞細胞定位的生物信息學(xué)研究 生物化學(xué)與生物物理進展，2007，34（6）：573-579

[2]馮志敏 免疫金標記技術(shù)在植物蛋白質(zhì)亞細胞定位中的應(yīng)用 信陽農(nóng)業(yè)高等專科學(xué)校學(xué)報，2006，6（）：05-08

[3]李鳳敏 蛋白質(zhì)亞細胞定位的序列分析和理論預(yù)測算法研究[D] 呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)，2004

[4]夏玉鳳 以gfp為報告基因研究蛋白亞細胞定位 生物技術(shù)通報，2006（2）：-3

[5]邱礽，陶剛，李奇科，等 農(nóng)桿菌滲入法介導(dǎo)的基因瞬時表達技術(shù)及應(yīng)用 分子植物育種，2009，7（5）：032-039

[6]Chalfie M Green fluorescent protein as a marker for gene expression Trends in Genetics，994，0 （5）：5

[7]張俊蓮，王蒂，張金文，等 用綠色熒光蛋白和洋蔥表皮細胞檢測擬南芥[WTBX][STBX]rd29A[WTBZ][STBZ]基因啟動子活性的方法 植物生理學(xué)通訊，2005，4（6）：85-89

[8]周丹丹，俞嘉寧 植物細胞中瞬時表達系統(tǒng)的建立及研究進展 中國農(nóng)學(xué)通報，203，29（24）：5-56

[9]徐恒，黎萬奎，謝志健，等 苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)及GUS基因瞬時表達 四川大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，200，38（6）：905-908[ZK）]

[0][ZK（#]Yoo S D，Cho Y H，Sheen Arabidopsis mesophyll protoplasts：a versatile cell system for transient gene expression analysis Nature rotocols，2007，2（7）：565-572

Vidal S，Eriksson A R，Montesano M，et al Cell wall-degrading enzymes from Erwinia carotovora cooperate in the salicylic acid-independent induction of a plant defense response Molecular lant-Microbe Interactions，998，（）：23-32