隱丹參酮抑制人胃癌SGC—7901細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

鄧?guó)P春+++楊鈺+++趙紅曄+++王濱+++周麗++沈云虹

[摘要] 目的 探討隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響。方法 通過(guò)體外無(wú)菌傳代培養(yǎng)2013年5月所購(gòu)的人胃癌SGC-7901細(xì)胞，設(shè)空白對(duì)照組與20 μm、40 μm、60 μm、80 μm和100 μm五個(gè)濃度的隱丹參酮組，分別于6 h、12 h、24 h和48 h后采用MTT法檢測(cè)隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率，并觀察藥物作用24 h和48 h后細(xì)胞的形態(tài)變化。 結(jié)果 ①刺激6 h和12 h后，各隱丹參酮組對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率均<35%；刺激24 h后，隨著隱丹參酮濃度的遞增，其對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率從33%逐漸增加至72%；刺激48 h后，各隱丹參酮組對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率均>50%。②刺激24 h后，隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的IC50為59.11 μM，③與空白對(duì)照組相比，各隱丹參酮組對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞均有抑制作用（P<0.01），且除了20 μM與40 μM組及40 μM與60 μM組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.162和0.110），其余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且有時(shí)間和劑量依賴關(guān)系；究其原因可能是隱丹參酮能夠誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[關(guān)鍵詞] 隱丹參酮；人胃癌SGC-7901細(xì)胞；MTT；細(xì)胞凋亡

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2014）12（b）-0049-02

胃癌（Gastric Cancer）是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重危害威脅人類(lèi)健康[1-3]，因此對(duì)胃癌的防治和治療等研究成為腫瘤研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)課題。傳統(tǒng)中藥以其價(jià)格低廉、毒副作用小的優(yōu)勢(shì)，輔助治療胃癌有很好的前景。隱丹參酮（cryptotanshinone）是從活血化瘀中藥丹參中提取出的脂溶性有效成分，具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或分化的作用[4]，但有關(guān)隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞作用的研究，國(guó)內(nèi)卻鮮有報(bào)道。該研究采用MTT法檢測(cè)隱丹參酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞（2013年5月購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）增殖的抑制作用，以期進(jìn)一步豐富隱丹參酮抗腫瘤作用的基礎(chǔ)研究、拓寬隱丹參酮的應(yīng)用范圍，為胃癌患者的輔助治療提供一種新的思路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 腫瘤細(xì)胞 人胃癌SGC-7901細(xì)胞于2013年5月購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 藥品及試劑 隱丹參酮購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司（HPLC≥98%）；胎牛血清（FBS） 購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基及細(xì)胞消化液胰酶（Tyrisin）為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)瓶產(chǎn)自美國(guó)Corning公司；細(xì)胞培養(yǎng)板及針頭濾器（孔徑：0.2 um）產(chǎn)自美國(guó)Costar公司；MR1812高速冷凍離心機(jī)產(chǎn)自法國(guó)Jouan公司；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱產(chǎn)自天津市泰新特儀器有限公司；UV-2550 UV-visible speetrophoto meter，SHIMADZU Corporation Assembled in China；倒置顯微鏡（IMT-2）產(chǎn)自O(shè)lympus公司；超凈工作臺(tái)產(chǎn)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；5%CO2孵箱產(chǎn)自Thermo Electron Corporation。

1.2 方法

1.2.1 藥液配制 隱丹參酮用DMSO配成一定濃度的儲(chǔ)備液，過(guò)濾除菌，分裝凍存，臨用再前用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度（藥物作用于細(xì)胞時(shí)，DMSO的終濃度小于或等于0.1% （v/v），該濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響）。

1.2.2 隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞存活率的影響 采用MTT法比色法：取96孔培養(yǎng)板，邊緣的孔內(nèi)加PBS緩沖液填充，中間的孔作為實(shí)驗(yàn)觀察孔。除調(diào)零孔不加細(xì)胞懸液外，其它各實(shí)驗(yàn)觀察孔，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，取無(wú)菌傳代培養(yǎng)第3～8代細(xì)胞，以1×104/孔的密度接種于孔板內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)4 h后，設(shè)空白對(duì)照組和五個(gè)不同濃度的隱丹參酮組（終濃度設(shè)梯度為20、40、60、80、100 μM），每種濃度5個(gè)復(fù)孔。除空白對(duì)照組外，每孔中加入相應(yīng)濃度的隱丹參酮，分別刺激6 h、12 h、24 h、48 h后，加入0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；小心吸去培養(yǎng)液；每孔加入150 μl DMSO，置37 ℃、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm/630 nm測(cè)量各孔的吸光值。重復(fù)測(cè)定3次后，分別計(jì)算抑制率。抑制率=（對(duì)照組OD值-用藥組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。（注：每組去掉一個(gè)OD值最低值和一個(gè)最高值，取剩余三個(gè)復(fù)孔OD值來(lái)計(jì)算。）

1.2.3 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，以5.0×105/孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)空白對(duì)照組和五個(gè)不同濃度的隱丹參酮組。待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，除空白對(duì)照組外，每孔中加入相應(yīng)濃度的隱丹參酮，均于作用24 h和48 h后倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的One-Way ANOVA過(guò)程進(jìn)行方差分析，最小顯著差法（Least significant difference，LSD）進(jìn)行兩兩比較，雙側(cè)檢驗(yàn)以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。endprint

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞存活率的影響

采用MTT比色法檢測(cè)不同濃度的隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如表1所示。

結(jié)果顯示，隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞刺激6 h和12 h后，各隱丹參酮組對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用并不明顯，抑制率均低于35%；刺激24 h后，各隱丹參酮組對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用較明顯，抑制率介于33%～72%之間；刺激48 h后，各隱丹參酮組對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用明顯，但最低濃度的隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率已超過(guò)50%。故選取24 h作為隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞抑制作用的最佳時(shí)間。

刺激24 h后，隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用與藥物濃度之間呈線性關(guān)系（y=0.498x+ 20.56，R2= 0.972），并由此計(jì)算出隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）為59.11 μM，如圖1所示；與空白對(duì)照組相比，各隱丹參酮組對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞均有抑制作用（P<0.01）；各隱丹參酮組間兩兩比較結(jié)果為：隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率，在20 μM與40 μM組之間和40 μM與60 μM組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.162和0.110），其余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 不同濃度隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制增殖曲線

2.2 不同濃度的隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響

在倒置顯微鏡下，人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)如下：空白對(duì)照組的SGC-7901細(xì)胞呈現(xiàn)梭形，大小均一，細(xì)胞壁光滑，折光性好。不同濃度隱丹參酮作用SGC-7901細(xì)胞24 h后出現(xiàn)的變化：藥物濃度低時(shí)，核染色質(zhì)固縮、聚集在核膜周邊；隨著藥物濃度加大，大部分細(xì)胞的細(xì)胞膜出現(xiàn)皺縮、內(nèi)陷和芽狀突起。48 h 后出現(xiàn)的變化：藥物濃度低時(shí)，核染色質(zhì)固縮、聚集在核膜周邊；藥物濃度適中時(shí)，大部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，胞漿濃縮、胞膜起泡，出芽，細(xì)胞體積逐漸變小，出現(xiàn)凋亡小體；藥物濃度高時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物釋放。

3 討論

目前，從丹參中已提取近50種丹參酮及其衍生物[5]，隱丹參酮是眾多丹參酮中的一種，具有改善微循環(huán)、清除氧自由基、抗感染等藥理作用，近年來(lái)它的抗腫瘤活性陸續(xù)被報(bào)道[6]。

研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮對(duì)前列腺癌、膽管癌、黑色素瘤等多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞具有不良反應(yīng)，引起了廣泛關(guān)注[7-9]，但有關(guān)隱丹參酮對(duì)胃癌的影響少見(jiàn)報(bào)道。

該研究通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度的隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示：①刺激6 h和12 h后，各隱丹參酮組對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率均<35%；刺激24 h后，隨著隱丹參酮濃度的遞增，其對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率從33%逐漸增加至72%；刺激48 h后，各隱丹參酮組對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率均>50%。表明隱丹參酮具有抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的作用，抑制作用的最佳時(shí)間為24 h。②刺激24 h后，隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的IC50為59.11 μM，明顯低于陳春雷等[10]報(bào)道的隱丹參酮對(duì)人膽管癌HCCC-9810細(xì)胞作用24 h的IC50（93.77μM），表明隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用更為顯著。③與空白對(duì)照組相比，各隱丹參酮組對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞均有抑制作用（P<0.01），且除了20 μM與40 μM組及40 μM與60 μM組之間無(wú)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.162和0.110）之外，其余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明隱丹參酮對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的抑制作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

不同濃度隱丹參酮作用人胃癌SGC-7901細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)不同的形態(tài)特征，濃度很低時(shí)，胞質(zhì)均勻，DNA逐漸變成不規(guī)則狀，核質(zhì)固縮聚集，有出泡現(xiàn)象。隨著濃度增加，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的核固縮，染色質(zhì)片段化和邊緣化，形成凋亡小體；最后細(xì)胞呈壞死狀，細(xì)胞變圓，裂解，漂浮于培養(yǎng)液中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隱丹參酮能夠誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡，且細(xì)胞凋亡在一定范圍內(nèi)跟藥物濃度呈依賴性關(guān)系。

今后，該研究將從細(xì)胞、分子及基因水平探索隱丹參酮抗腫瘤作用機(jī)理，以期進(jìn)一步豐富隱丹參酮抗腫瘤作用的基礎(chǔ)研究、拓寬隱丹參酮的應(yīng)用范圍，為其在腫瘤治療領(lǐng)域的臨床應(yīng)用積累試驗(yàn)和理論依據(jù)。

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（收稿日期：2014-09-11）endprint