蛇床子素對(duì)稻瘟病菌侵染的影響

齊中強(qiáng)， 薛延豐， 張 猛， 李麗娜， 石志琦

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所，江蘇 南京 210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇 南京210014)

由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻生產(chǎn)上的重要病害之一，在全世界稻區(qū)均有發(fā)生。且稻瘟病菌在水稻的整個(gè)生育期均能侵染，嚴(yán)重威脅世界糧食安全［1-2］。防治稻瘟病最有效的措施是選育和利用抗病品種，但由于稻瘟病菌的高度易變性，抗病品種種植3～5年后，就降低甚至喪失對(duì)稻瘟病的抗性［3-4］，因此，化學(xué)防治仍然是防治稻瘟病的關(guān)鍵措施之一。目前中國的防治藥劑主要以春雷霉素、稻瘟靈以及三環(huán)唑?yàn)橹鳎捎谒巹┦褂幂^為單一，稻瘟病菌容易對(duì)上述藥劑產(chǎn)生抗藥性，并且存在農(nóng)藥殘留等安全隱患。因此研究和開發(fā)安全、高效、經(jīng)濟(jì)的新藥劑尤為重要。

天然化合物蛇床子素是傘形科植物蛇床子［Cnidium monnieri(L.)Cuss.］的主要成分，屬于香豆素類化合物，它對(duì)植物病原菌具有廣泛的抑制作用［5］，但其對(duì)稻瘟病是否具有防效以及對(duì)稻瘟病菌的抑制作用如何等還未有報(bào)道。本研究主要從蛇床子素對(duì)稻瘟病菌致病力，附著胞形成和菌絲生長的抑制等方面進(jìn)行研究，為開發(fā)新型、安全、優(yōu)良防效的植物源農(nóng)藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)Guy11由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院真菌與卵菌實(shí)驗(yàn)室提供。

蛇床子素(純度99.5%，購自中國藥品生物制品檢定所)用無水乙醇配制成濃度為2×104μg/ml后置4℃冰箱保存。使用前用ddH2O稀釋成不同濃度。

水稻為感病品種CO39，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院真菌與卵菌實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基為CM(完全培養(yǎng)基)，SDC(產(chǎn)孢培養(yǎng)基)［6］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌絲干質(zhì)量測(cè)定 從CM培養(yǎng)基上生長5～7 d的菌落邊緣使用直徑1 cm的打孔器切取菌絲塊，每塊菌絲塊平分為4小塊置于含有不同濃度蛇床子素的每瓶60 ml液體CM培養(yǎng)基中，每瓶12小塊。28℃，150 r/min，黑暗培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，過濾并用吸水紙壓干，置于2 ml EP管中，冷凍抽干，稱質(zhì)量。每次試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 菌絲直徑測(cè)定 從CM培養(yǎng)基上生長5～7 d的菌落邊緣上切取3 mm×3 mm的菌絲塊，接種于直徑60 mm的含有不同濃度蛇床子素的CM平板中央，28℃黑暗培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落直徑并拍照。每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.2.3 分生孢子形成測(cè)定 將野生型Guy11接種在SDC培養(yǎng)基上，28℃黑暗培養(yǎng)7 d左右，待菌絲體長滿平板后，用手術(shù)刀將表面氣生菌絲刮掉，于黑光燈下照射3 d，誘導(dǎo)分生孢子產(chǎn)生。收集孢子時(shí)，向培養(yǎng)基內(nèi)加入3 ml無菌水，輕輕用1.5 ml EP管底部將表面氣生菌絲和孢子刷下，然后經(jīng)過四層擦鏡紙過濾收集孢子。

1.2.4 附著胞形成測(cè)定 將蓋玻片(Fisherbrand，12-540-A 18×18-2)放置在載玻片上(下面滴加無菌水)，取40 μl濃度為每1 ml 5×104個(gè)的分生孢子液(含有不同濃度蛇床子素)，滴加于蓋玻片中央，隨后將載玻片放入培養(yǎng)皿中28℃黑暗保濕培養(yǎng)4 h、8 h和24 h后分別制片觀測(cè)附著胞形成率，并拍照。每次試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 水稻點(diǎn)滴致病性測(cè)定 將刷下的孢子調(diào)至濃度為1 ml 5×104個(gè)，剪取生長14 d的水稻葉片鋪于含有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，每張葉片上點(diǎn)滴孢子液3個(gè)，以點(diǎn)滴清水為對(duì)照，置于28℃黑暗培養(yǎng)24 h，期間需要保持高溫高濕狀態(tài)，接種5～7 d后，觀察結(jié)果并拍照。每次試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛇床子素對(duì)稻瘟病菌生長的影響

為了研究蛇床子素對(duì)稻瘟病菌Guy11的抑制作用，試驗(yàn)選取了含有不同濃度的蛇床子素的CM培養(yǎng)基，對(duì)Guy11的生長速率及干質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。圖1A和圖1B表明，蛇床子素濃度為32 μg/ml時(shí)，Guy11生長受到明顯抑制，當(dāng)蛇床子素濃度增加到160 μg/ml時(shí)，抑制率達(dá)到約65%。同時(shí)，檢測(cè)了蛇床子素各濃度梯度下Guy11的干質(zhì)量變化，結(jié)果如圖1C所示，Guy11在液體培養(yǎng)條件下對(duì)蛇床子素較為敏感，蛇床子素濃度為16 μg/ml時(shí)，生長受到抑制，隨著蛇床子素濃度的提高，Guy11干質(zhì)量逐漸下降，蛇床子素濃度為160 μg/ml時(shí)，Guy 11基本不生長。上述結(jié)果表明，蛇床子素對(duì)稻瘟病菌生長具有明顯的抑制作用，且液體培養(yǎng)條件下，抑制作用更為顯著。

2.2 蛇床子素對(duì)稻瘟病菌菌絲的影響

掃描電鏡觀察結(jié)果表明正常的稻瘟病菌菌絲飽滿，表面平滑，經(jīng)60 μg/ml蛇床子素處理后菌絲表面出現(xiàn)干癟及皺縮，部分菌絲甚至出現(xiàn)斷裂等現(xiàn)象(圖2)。

2.3 蛇床子素對(duì)稻瘟病發(fā)生的影響

圖3表明，添加不同濃度蛇床子素與稻瘟病菌Guy11分生孢子懸浮液混合接種水稻時(shí)，20 μg/ml蛇床子素即可降低稻瘟病菌對(duì)水稻的致病力，當(dāng)蛇床子素濃度增加到40 μg/ml，可以完全抑制稻瘟病斑的產(chǎn)生。同時(shí)，如圖4所示，先滴加不含蛇床子素的孢子懸浮液8 h和24 h后，滴加50 μg/ml蛇床子素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛇床子素均對(duì)稻瘟病的發(fā)生產(chǎn)生抑制作用。

圖1 蛇床子素對(duì)稻瘟病菌生長的影響Fig.1 The growth of Guy11 of Magnaporthe oryza exposed to different concentrations of osthol

圖2 蛇床子素對(duì)稻瘟病菌菌絲形態(tài)的影響Fig.2 Hyphae morphogenesis of Guy11 exposed to osthol

2.4 蛇床子素對(duì)稻瘟病菌附著胞形成的影響

為了探究蛇床子素對(duì)稻瘟病菌侵染抑制作用的原因，分析了蛇床子素是否影響稻瘟病菌附著胞的形成。由圖5可知，在蛇床子素濃度為20 μg/ml濃度時(shí)，培養(yǎng)4 h和8 h稻瘟病菌孢子均不能產(chǎn)生附著胞，只能萌發(fā)產(chǎn)生芽管;表1顯示培養(yǎng)24 h后能夠觀察到附著胞，但形成率顯著下降僅為50%左右，且形成的附著胞較對(duì)照變小，芽管變短，對(duì)照附著胞形成率接近100%。隨著蛇床子素濃度的提高(40 μg/ml、60 μg/ml)，稻瘟病菌孢子的萌發(fā)被完全抑制。上述結(jié)果表明蛇床子素能夠抑制稻瘟病菌孢子萌發(fā)及附著胞的形成。

3 討論

蛇床子素長期以來被應(yīng)用于醫(yī)藥上，近幾年來，其在抑制植物病原真菌方面的研究正在逐步展開。嚴(yán)清平等［7］發(fā)現(xiàn)60 μg/ml蛇床子素在處理草莓白粉菌24 h后完全抑制其分生孢子萌發(fā)，80～125 μg/ml蛇床子素對(duì)該病原菌引起的病害防效達(dá)68.7% ～79.5%;王春梅等［8］發(fā)現(xiàn) 25 μg/ml、20 μg/ml、16.7 μg/ml蛇床子素對(duì)黃瓜白粉病在第3次施藥后7 d防效達(dá)97.73%以上。夏禮如等［9］發(fā)現(xiàn)1%蛇床子素水乳劑對(duì)黃瓜霜霉病具有良好防效，但持效期較對(duì)照差。沈國濤等［10］報(bào)道蛇床子素對(duì)小麥赤霉病菌可能的作用機(jī)制是抑制小麥赤霉病菌對(duì)葡萄糖、鈣的吸收及ATP酶的活性。

分生孢子在稻瘟病菌的致病過程中具有重要作用［11］。本研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素對(duì)稻瘟病菌生長及孢子萌發(fā)具有抑制作用，尤其對(duì)孢子萌發(fā)的抑制更為顯著，40 μg/ml濃度的蛇床子素處理稻瘟病菌分生孢子即可抑制其萌發(fā)且完全抑制稻瘟病斑的產(chǎn)生。本研究結(jié)果表明蛇床子素對(duì)稻瘟病發(fā)生的抑制主要作用于稻瘟病菌的孢子萌發(fā)及附著胞形成過程，而且較低濃度下即可達(dá)到較好效果。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在接種稻瘟病菌孢子8 h和24 h后接種50 μg/ml蛇床子素仍然對(duì)稻瘟病的發(fā)生具有一定抑制作用。文獻(xiàn)報(bào)道稻瘟病菌接種8 h附著胞基本形成，24 h已經(jīng)成熟，并且開始侵入水稻，因此蛇床子素可能對(duì)稻瘟病菌的侵入及擴(kuò)展也具有影響［12］。

圖3 蛇床子素對(duì)稻瘟病菌Guy11侵染的影響Fig.3 Inhibition of osthol against Guy11

圖4 蛇床子素(50 μg/ml)對(duì)稻瘟病的治療作用Fig.4 Inhibition of osthol against Guy 11 after 8 h and 24 h

圖5 蛇床子素對(duì)稻瘟病菌孢子萌發(fā)及附著胞形成的影響Fig.5 Effects of osthol on conidium germination and appressorium formation

對(duì)稻瘟病菌生長抑制試驗(yàn)可知，32 μg/ml濃度蛇床子素處理下，菌絲生長開始受到影響;160 μg/ml濃度蛇床子素處理下，生長基本被抑制，且液體培養(yǎng)條件下，抑制作用更為明顯。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)60 μg/ml蛇床子素處理的菌絲呈現(xiàn)畸形，菌絲表面出現(xiàn)干癟及皺縮，部分菌絲出現(xiàn)斷裂等現(xiàn)象。由此推測(cè)蛇床子素破壞了稻瘟病菌菌絲細(xì)胞壁的完整性。真菌細(xì)胞壁完整性對(duì)維持其菌絲形態(tài)和對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)發(fā)揮著關(guān)鍵作用［13］。石志琦等［14］以100 μg/ml蛇床子素處理液體培養(yǎng)小麥赤霉病菌，同樣發(fā)現(xiàn)菌絲大量斷裂。因此推測(cè)菌絲斷裂現(xiàn)象發(fā)生的原因是菌絲中幾丁質(zhì)水解酶經(jīng)蛇床子素處理后，活性升高，使得合成細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)前體水解，從而造成細(xì)胞壁出現(xiàn)斷裂，嚴(yán)重影響細(xì)胞壁完整性。除此之外，稻瘟病菌在侵染后期，侵染菌絲在水稻細(xì)胞中大量擴(kuò)展，但一定濃度的蛇床子素對(duì)菌絲生長具有抑制作用，因此蛇床子素能夠抑制侵染菌絲的擴(kuò)展，這也解釋了蛇床子素為什么具有一定的治療作用。

表1 蛇床子素對(duì)稻瘟病菌附著胞形成的抑制作用Table 1 Inhibition of osthol against appressorium formation

綜上所述，蛇床子素對(duì)稻瘟病菌的抑制作用主要通過破壞菌絲體細(xì)胞完整性，影響其對(duì)營養(yǎng)成分的吸收及耐脅迫能力;其次，通過抑制分生孢子萌發(fā)及附著胞形成影響稻瘟病菌對(duì)水稻的致病力。蛇床子素抑制分生孢子萌發(fā)及附著胞形成的機(jī)制，蛇床子素的可能靶標(biāo)以及蛇床子素是否誘發(fā)水稻的免疫反應(yīng)等問題還有待進(jìn)一步研究。

［1］ TALBOT N J.On the trail of a cereal killer:exploring the biology of Magnaporthe grisea［J］.Annu Rev Microbiol，2003，57:177-202.

［2］ 張其蓉，宋發(fā)菊，田進(jìn)山，等.長江中下游稻區(qū)水稻區(qū)域試驗(yàn)品種抗稻瘟病鑒定與評(píng)價(jià)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(4): 90-91.

［3］ 劉永鋒，陳志誼，劉郵洲，等.2001-2010年江蘇省稻瘟病菌種群變化分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，26(1):1233-1237.

［4］ 唐 成，陳 露，安敏敏，等.稻瘟病誘導(dǎo)水稻幼苗葉片氧化還原系統(tǒng)的特征譜變化［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(12): 141-144.

［5］ QI Z，WANG Q，DOU X，et al.MoSwi6，an APSES family transcription factor，interacts with MoMps1 and is required for hyphal and conidial morphogenesis，appressorial function and pathogenicity of Magnaporthe oryzae［J］.Molecular Plant Pathology，2012，13: 677-689.

［6］ 石志琦，陳 浩.新型植物源創(chuàng)制農(nóng)藥蛇床子素［J］.世界農(nóng)藥，2010，32(6):52-54.

［7］ 嚴(yán)清平，陸信仁，夏禮如，等.天然化合物蛇床子素防治草莓白粉病［J］.農(nóng)藥，2005，44(3):136-137.

［8］ 王春梅，吳桂本，王英姿，等.蛇床子素防治黃瓜白粉病研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005(4):57-58.

［9］ 夏禮如，王永霞，程玲娟，等.蛇床子素水乳劑對(duì)黃瓜霜霉病的防治效果［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(6):161-162.

［10］沈國濤，石志琦，徐朗萊，等.蛇床子素對(duì)小麥赤霉病菌葡萄糖、鈣吸收和三磷酸腺苷酶活性的抑制［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，7(2):135-139.

［11］TALBOT N J，EBBOLE D J，HAMER J E.Identification and characterization of MPG1，a gene involved in pathogenicity from the rice blast fungus Magnaporthe grisea［J］.The Plant Cell，1993，5:1575-1590.

［12］THINES E，WEBER R W，TALBOT N J.MAP kinase and protein kinase a-dependent mobilization of triacylglycerol and glycogen during appressorium turgor generation by Magnaporthe grisea［J］.Plant Cell，2000，12:1703-1718.

［13］PRASAD R，KAPOOR K.Multidrug resistance in yeast Candida［J］.Inter Rev Cytol，2005，242:215-248.

［14］石志琦，沈國濤，徐朗萊，等.蛇床子素對(duì)植物病原真菌抑制機(jī)制的初步研究［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，6(2):28-32.