新孢子蟲與宿主關(guān)系研究進(jìn)展

郭衍冰，曹利利＊，姚新華，苑淑賢，程榮華，王英賀

（1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長春130062；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春130118）

犬新孢子蟲（Neosporacaninum）簡稱新孢子蟲，是一種頂復(fù)門胞內(nèi)寄生蟲，屬孢子蟲綱，真球蟲目，肉孢子蟲科，新孢子蟲屬。傳播途徑有水平傳播和垂直傳播，其中以在牛、羊、鼠、貓等動物中的垂直傳播為新孢子蟲的主要傳播方式［1］。該寄生原蟲主要有3個傳染性生長階段，分別是包囊、卵囊和速殖子，其宿主可分為中間宿主和終末宿主，其中牛、羊、豬、馬、兔、鹿等可作為中間宿主［2］，郊狼、狐貍等可作為終末宿主［3］，而犬既是中間宿主，又是終末宿主。由此可知，犬新孢子蟲病能夠在多種動物及種群間相互傳播，使感染孕畜流產(chǎn)、死胎，或?qū)π律旱纳窠?jīng)系統(tǒng)及運(yùn)動造成影響［4］，且以其流行范圍廣的特點(diǎn)給世界各國養(yǎng)殖業(yè)，尤其是奶牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。

據(jù)報(bào)道，有部分國家采用疫苗防控犬新孢子蟲病，效果并不十分理想［5］?？梢哉f，時至今日，世界范圍內(nèi)針對預(yù)防和治療該寄生蟲病尚無特效藥物［6］。隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展和寄生蟲學(xué)研究的不斷深入，越來越多的人們關(guān)注犬新孢子蟲與其宿主間關(guān)系的研究，力爭探索并創(chuàng)造出更有效診斷及防控該寄生蟲病的方法和藥物。因此，本文從以下幾個方面對兩者間關(guān)系進(jìn)行闡述。

1 犬新孢子蟲侵入相關(guān)抗原

1.1 表面抗原

犬新孢子蟲侵入至宿主細(xì)胞的過程十分復(fù)雜，而在這一過程中蟲體的表面抗原發(fā)揮著介導(dǎo)入侵及黏附宿主細(xì)胞的重要作用?，F(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)的表面蛋白主要有表面抗原（surface antigen，SAG）及相關(guān)表面抗原相關(guān)序列（surface antigen-related sequences，SRS）基因家族，因在診斷抗原及免疫抗原過程中，表面蛋白因其表現(xiàn)出的雙重價值而備受關(guān)注。

1.1.1 SAG1（Nc-p36） SAG1作為介導(dǎo)蟲體入侵及黏附宿主細(xì)胞的重要表面蛋白，該蛋白分子質(zhì)量為36ku，含有疏水性氨基端和羧基端，僅產(chǎn)生于速殖子階段，是區(qū)分弓形蟲與新孢子蟲的主要診斷抗原。2011年張守發(fā)等［7］將重組質(zhì)粒pVAX-SAG1轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞上進(jìn)行表達(dá)并免疫Balb／c小鼠，結(jié)果顯示，能夠提高其體液及細(xì)胞免疫水平，說明SAG1是免疫組化反應(yīng)檢測感染宿主組織中速殖子的的重要診斷依據(jù)［8］。

1.1.2 SRS2（Nc-p43） SRS2作為介導(dǎo)蟲體入侵至宿主細(xì)胞的重要跨膜蛋白，該蛋白分子質(zhì)量為43 ku，含有疏水性羧基端和帶有信號肽的氨基端，均能產(chǎn)生于速殖子和緩殖子階段。Nishikawa Y等［9］將帶有NcSRS2的重組苗注射Balb／c小鼠，結(jié)果使其產(chǎn)生保護(hù)性免疫力，說明SRS2可作為診斷研究及疫苗研制的免疫原。據(jù)報(bào)道，SRS基因家族與弓形蟲相似，而SRS2能夠有助于人們區(qū)別弓形蟲進(jìn)行犬新孢子蟲診斷，但目前對于SRS系列基因不甚了解，有待深入研究［10］。

1.2 致密顆粒抗原

致密顆粒常以幾個至幾十個的數(shù)量分布于蟲體細(xì)胞，當(dāng)蟲體全部進(jìn)入宿主細(xì)胞時，這種分泌細(xì)胞器在容納蟲體空泡（PV）的形成初期開始分泌致密顆粒蛋白，因而人們認(rèn)為致密顆粒蛋白在PV形成過程中發(fā)揮了一定的作用，但其分泌途徑有待進(jìn)一步研究。目前，人們對犬新孢子蟲致密顆?？乖╠ense granule antigen，GRA）的了解并不十分透徹，據(jù)了解已篩選出5種蛋白，分別是NcGRA1、NcGRA2、NcGRA6、NcDG1 和 NTPase［11］。Vonlaufen N等［12］在空泡（PV）的囊壁中發(fā)現(xiàn) NcGRA1、NcGRA2、NcDG1。已知NcGRA2能夠在速殖子階段大量表達(dá)，Ellis J T 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，以 NcGRA2所構(gòu)建的疫苗具有降低感染率的效果，亦可說明致密顆粒蛋白具有一定修飾空泡（PV）的作用。Nc-DG1表達(dá)于速殖子階段，Liu Z K 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，宿主染重發(fā)病后，始終可在空泡（PV）膜中發(fā)現(xiàn)Nc-DG1的存在，表明NcDG1在PV的形成及其膜的修飾過程中具有一定作用。據(jù)以往研究表明，NcGRA6與NcDG1可用于預(yù)防及診斷新孢子蟲病，且與弓形蟲無交叉免疫原性。新孢子蟲與弓形蟲兩者NTPase的酶活力相似，氨基酸序列幾乎一致且具有交叉免疫原性。

1.3 微線體蛋白抗原

微線體作為新孢子蟲的一種分泌型細(xì)胞器能夠產(chǎn)生的近20種蛋白，而其分泌的微線蛋白抗原（micronemal protein antigen，MIC）在蟲體黏附宿主細(xì)胞及運(yùn)動過程中發(fā)揮著一定的介導(dǎo)作用。NcMIC2是頂復(fù)門寄生蟲易位相關(guān)蛋白（translocon-associated protein，TRAP）家族中的一員，包含了一個帶有整合蛋白（I）的氨基端，一個數(shù)量可變的血小板反應(yīng)蛋白（thrombospondin，TSP）樣重復(fù)序列，一個跨膜結(jié)構(gòu)域及一個延伸至細(xì)胞質(zhì)中的羧基端，而TSP樣重復(fù)序列常用于判定該微線蛋白的同源性，據(jù)了解，新孢子蟲MIC2與弓形蟲MIC2同源性達(dá)61%。NcMIC3含有4個連續(xù)的表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量為38ku，是一種分泌于速殖子及緩殖子階段的微線蛋白，功能與NcMIC2類似，都參與了新孢子蟲入侵及黏附宿主細(xì)胞的過程［15］。

1.4 棒狀體蛋白抗原

致密顆粒、微線體和棒狀體是犬新孢子蟲重要的3種分泌型細(xì)胞器。依據(jù)蟲體速殖子時期中棒狀體其致密度高的構(gòu)造，可通過光學(xué)顯微鏡將其與弓形蟲相區(qū)別，而目前人們對棒狀體所分泌的棒狀體蛋白抗原（rhoptry protein antigen，ROP）家族蛋白的了解尚不十分清楚［16］。

2 宿主免疫應(yīng)答

據(jù)以往研究表明，感染后的宿主針對犬新孢子蟲的不同生長階段產(chǎn)生不同的免疫應(yīng)答，表現(xiàn)為某一階段的免疫應(yīng)答主要起到保護(hù)宿主的作用，即Th1型免疫應(yīng)答，而某一階段主要保護(hù)新孢子蟲，即Th2型免疫應(yīng)答。Nazir M M 等［17］研究表明，感染新孢子蟲后的宿主能夠產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)力，引起宿主的細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)，但兩者相較而言以細(xì)胞免疫應(yīng)答為主。

2.1 Th1型免疫反應(yīng)

Th1型免疫反應(yīng)能夠使機(jī)體CD4＋T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ及TNF-α等，促進(jìn)IgG2a和IgG2b等抗體生成以抑制犬新孢子蟲在宿主細(xì)胞中的繁殖，同時激活具有殺傷效果的氧自由基、一氧化氮（NO）及其代謝產(chǎn)物等，并且抑制IgG1、IgM和IgE的生成。但值得注意的是，在幫助宿主抗蟲體感染的同時，一些Th1型細(xì)胞因子還會損壞宿主相關(guān)組織。

據(jù)了解，IL-2細(xì)胞因子能夠破壞胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，進(jìn)而影響母體對胎兒的繼續(xù)培養(yǎng)。IL-12的不斷分泌能夠維持Th1型免疫反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，而IFN-γ不僅具有激活巨噬及其他單核細(xì)胞以促發(fā)炎癥反應(yīng)的功效，還可介導(dǎo)IL-12及IgG2的產(chǎn)生，在抗蟲體感染初期發(fā)揮著重要作用。分泌的TNF-α能夠活化某些細(xì)胞毒性因子，可導(dǎo)致機(jī)體組織損傷。一氧化氮（NO）是一種能活化巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)分子，在發(fā)揮抗蟲體感染及繁殖作用的同時，通過抑制線粒體呼吸酶和DNA合成酶等酶活性，能夠使宿主細(xì)胞凋亡。

2.2 Th2型免疫反應(yīng)

Th2型免疫反應(yīng)能夠使機(jī)體CD4＋T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-5及IL-10等，雖然減弱了宿主對犬新孢子蟲的抵抗，但對妊娠過程胎盤等組織發(fā)育起到了營養(yǎng)和保護(hù)作用，而這一時期的新孢子蟲更傾向于進(jìn)行垂直傳播［18］。研究表明，IL-4細(xì)胞因子水平的高低直接影響著蟲體在宿主中的垂直傳播情況，同時其水平的提高有助于促進(jìn)B細(xì)胞分泌IgG1抗體［19］。 據(jù)報(bào)道，IL-10 與 IFN-γ呈負(fù)相關(guān)［20］，當(dāng)宿主處于懷孕期時，其細(xì)胞因子IL-10水平會有所提升，因其具有抑制IFN-γ生成的作用，可使機(jī)體減弱自身的抗蟲能力，降低對母體懷孕的影響。

3 蟲體侵入宿主細(xì)胞的機(jī)制

犬新孢子蟲依據(jù)其不同發(fā)育階段可分為速殖子、胞囊和卵囊等形態(tài)，而侵入宿主細(xì)胞這一復(fù)雜過程是由速殖子階段的新孢子蟲完成，該機(jī)制主要以黏附及侵入兩個階段組成，簡單來說，在宿主細(xì)胞內(nèi)的速殖子就是循環(huán)進(jìn)行黏附、侵入、繁殖以及釋放的一個過程：①黏附。速殖子接觸宿主細(xì)胞后將信號傳導(dǎo)至蟲體前端并再次定位，同時誘導(dǎo)微線體分泌能夠與宿主細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合的蛋白，以構(gòu)成可移動的連接區(qū)域。②侵入。在棒狀體蛋白的修飾及蟲體自身的滑動作用下，連接區(qū)域的宿主細(xì)胞膜開始不斷內(nèi)陷，使蟲體自前端起逐漸移進(jìn)宿主細(xì)胞內(nèi)，直至全部侵入且后端連接區(qū)域的細(xì)胞膜融合，最終在宿主細(xì)胞核附近形成了容納蟲體的空泡（PV）。③繁殖。致密顆粒所分泌的蛋白對空泡進(jìn)行修飾，以使空泡不被宿主胞內(nèi)溶酶體裂解或酸化，以此隔離宿主內(nèi)吞噬系統(tǒng)，有利于新孢子蟲進(jìn)行二分裂繁殖，存在于空泡（PV）中的速殖子繁殖十分迅速，約48h～72h則可繁殖5代～6代。④釋放。在信號系統(tǒng)作用下，宿主細(xì)胞發(fā)生裂解，將胞內(nèi)的速殖子釋放出去，被釋放的新孢子蟲速殖子則可對宿主細(xì)胞發(fā)起新一輪的侵入。

4 妊娠期間宿主與蟲體間關(guān)系

新孢子蟲四季均可感染發(fā)病，但以夏季為高發(fā)季節(jié)，以垂直傳播為主要傳播途徑的新孢子蟲能夠引起懷孕母畜寄生蟲血癥，且被感染母體無年齡差異，可使胎兒發(fā)生母源感染或持續(xù)性的內(nèi)源感染。母體妊娠的整個階段中，隨著妊娠時期的不斷發(fā)展，母體會在Th1型與Th2型免疫應(yīng)答間自然的變化，從而使宿主與蟲體間的關(guān)系發(fā)生動態(tài)改變。

妊娠初期，母體感染新孢子蟲后會產(chǎn)生較強(qiáng)的炎癥應(yīng)答，如產(chǎn)生IL-12或IFN-γ等利于Th1型免疫反應(yīng)的因子，這些因子能夠一定程度上阻止蟲體的侵入與繁殖，同時對胎盤等組織的發(fā)育造成損傷，因而這種炎癥反應(yīng)在大多產(chǎn)下死胎的母體中普遍存在［21］。而以往試驗(yàn)結(jié)果表明，懷孕初期感染低劑量新孢子蟲，初乳前血清檢測未發(fā)現(xiàn)陽性，但在其死后的腦與脊髓中卻能檢測到該寄生蟲特異性DNA。妊娠中期，是被感母體流產(chǎn)的高發(fā)時期，許多調(diào)查研究表明，由新孢子蟲病引起的流產(chǎn)都發(fā)生于母體妊娠的4月～6月，為了有效抵抗新孢子蟲，細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ等的分泌，增強(qiáng)了Th1型免疫反應(yīng)效果，導(dǎo)致胎兒或死于母體子宮內(nèi)，或被母體吸收成木乃伊胎，可以說細(xì)胞因子在母體妊娠期間是把雙刃劍，在抵抗新孢子蟲感染的同時，亦可損傷胎兒。據(jù)了解，懷孕母體會不斷合成孕酮，抑制NO的產(chǎn)生和NK細(xì)胞活性，同時促進(jìn)Th2型細(xì)胞分化，Innes E A等 研究結(jié)果表明，新孢子蟲更易在懷孕母體細(xì)胞內(nèi)繁殖且進(jìn)行垂直傳播。妊娠后期，IL-4及IL-5水平的不斷提高，Th2型免疫反應(yīng)會增強(qiáng)對宿主胎兒的保護(hù)及營養(yǎng)作用。隨著母體妊娠期的不斷發(fā)展，胎兒自身的免疫系統(tǒng)也不斷發(fā)育，這有助于胎兒更好的抵抗新孢子蟲的感染［23］?？傊?，維持Th1與Th2的動態(tài)變化對妊娠期間宿主與新孢子蟲間關(guān)系至關(guān)重要［24］，蟲體對宿主母體感染的程度與受感染時間、母源保護(hù)性以及胎兒自身免疫活性息息相關(guān)。

5 結(jié)語

犬新孢子蟲作為危害性大、涉及范圍廣的寄生蟲病已引起廣泛關(guān)注，各國專家對該病進(jìn)行了多方面研究并獲得較大進(jìn)展［25］，而犬新孢子蟲與宿主間關(guān)系極為復(fù)雜，且存在許多研究難題尚待解決，如對蟲體侵入宿主細(xì)胞相關(guān)蛋白及其機(jī)制的掌握較少，對宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答機(jī)制的探索深度不夠，蟲體致病及遺傳變異等相關(guān)研究也有待深入等，而現(xiàn)有研究尚駐足于探索發(fā)現(xiàn)蟲體侵入和毒力蛋白及其功能的初步驗(yàn)證上，這也阻礙了人們對有效防控該寄生蟲病藥物的研制與開發(fā)，目前雖尚未研究出針對預(yù)防犬新孢子蟲的有效疫苗及治療藥劑，但隨著研究的不斷深入，相信未來在眾多科研人員的共同努力下，定能攻克這一影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展的難題。

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