曼氏裂頭蚴病診斷方法及其在蛇蛙的應(yīng)用研究進(jìn)展

楊光大，肖嘉杰，龔世平，王付民＊，魏玉峰

（1.廣東省野生動物救護(hù)中心，廣東廣州510520；2.廣東省昆蟲研究所，廣東廣州510260；3.廣東省野生動物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510260）

曼氏裂頭蚴（Plerocercoid）為曼氏迭宮絳蟲（Spirometramansoni）的幼蟲階段，是原尾蚴隨受感染蝌蚪發(fā)育而成，具較強(qiáng)的感染性和致病性，可侵入人體引起危害嚴(yán)重的曼氏裂頭蚴?。⊿parganosis mansoni）。該病廣泛流行于東亞和東南亞地區(qū)，在歐洲、美洲和非洲也有報道［1］。在我國已有數(shù)千例報告，其中廣東省報道的病例最多，占全國的10%左右［2］。近年來，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、金標(biāo)免疫滲濾技術(shù)（dot immunogold filtration assay，DIGFA）和免疫印跡（Western blot）技術(shù)已逐漸應(yīng)用于人體曼氏裂頭蚴病的診斷，并建立了明確的衛(wèi)生學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。然而，在蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷方面，類似快速診斷技術(shù)近乎空白，更無商品化檢測試劑盒的推出。蛇蛙是曼氏迭宮絳蟲重要的第二中間宿主和轉(zhuǎn)續(xù)宿主，在人曼氏裂頭蚴病感染上有著重要作用［2］；此外，蛇蛙曼氏裂頭蚴病可嚴(yán)重影響蛇蛙的生長和繁殖，對食用蛇蛙養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化和無公害發(fā)展具有重要影響。因此，論文針對近年來曼氏裂頭蚴病診斷方法的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，期望對蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷技術(shù)的研究提供參考。

1 曼氏裂頭蚴病的診斷

1.1 病原學(xué)診斷

病原學(xué)檢查是曼氏裂頭蚴診斷的金標(biāo)準(zhǔn)［4］。在人體臨床診斷中，通常采用活體組織檢查方法來獲得蟲體，進(jìn)而通過形態(tài)學(xué)觀察來判定是否為裂頭蚴感染［5］。迄今為止，已明確的曼氏裂頭蚴蟲體基本形態(tài)學(xué)特征為：呈長帶形，乳白色或淡黃色，長0.5 cm～30cm，寬0.3cm～1cm；蟲體不分節(jié)，但有不規(guī)則橫皺褶，體前端無吸槽；蟲體的頂端中央有一孔向內(nèi)凹陷成隧道狀，向后延伸一定距離后形成盲管［3］。曼氏裂頭蚴病組織病理切片的組織學(xué)和免疫組化鑒定是病原學(xué)診斷另一重要手段，對蟲體不完整或形態(tài)學(xué)鑒定較為困難的蟲體標(biāo)本具有重要的應(yīng)用價值［4］。組織病理切片觀察曼氏裂頭蚴具有四大鑒定特征：體壁皺褶、密集的體毛、體腔內(nèi)的石灰小體和較細(xì)的肌束，這些特征會因?yàn)槿忧腥〔课徊煌杂胁町悾?，6］。另外，曼氏裂頭蚴可以在人體內(nèi)不斷遷移，在某些部位造成組織炎癥與肉芽腫反應(yīng)，蟲體感染周圍組織的病理學(xué)特征也常作為病原學(xué)檢查的依據(jù)［6］。在人體中，寄生于深部組織或中樞神經(jīng)系統(tǒng)等部位的蟲體不易發(fā)現(xiàn)病灶，漏檢率高，誤診性大，故病原學(xué)診斷方法的局限性也較大［4］。

1.2 影像學(xué)診斷

近年來電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）等技術(shù)越來越多應(yīng)用于曼氏裂頭蚴病的鑒別診斷，特別是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)裂頭蚴?。?，7］。目前，已成熟或明確的影像學(xué)方法有兩種：（1）CT檢查［3］。CT檢查腦曼氏裂頭蚴病具有以下影像學(xué)特征：①白質(zhì)區(qū)不規(guī)則的低密度占位灶，反映白質(zhì)退行性病變；②點(diǎn)狀鈣化灶；③病灶結(jié)節(jié)狀或不規(guī)則增強(qiáng)，可能出現(xiàn)感染肉芽腫。（2）MRI檢查［7］。MRI也多應(yīng)用于腦裂頭蚴病的臨床診斷，其影像學(xué)特征為：①CT上白質(zhì)區(qū)不規(guī)則、不均勻的低密度占位灶，MRI上表現(xiàn)為T1W低信號，T2W高信號，鄰近腦室可有擴(kuò)大，即所謂負(fù)效應(yīng)；②點(diǎn)狀鈣化影；③病灶點(diǎn)狀增強(qiáng)或迂曲的線條狀增強(qiáng)或串珠狀增強(qiáng)影；④反復(fù)檢查發(fā)現(xiàn)病灶遷徙性。但CT和MRI檢查多用于寄生于深部組織或中樞神經(jīng)系統(tǒng)等部位的蟲體的輔助診斷，且需要多次檢查進(jìn)行比較和鑒別診斷，比較費(fèi)時費(fèi)力，也有一定局限性［7］。

1.3 血清免疫學(xué)診斷

血清免疫學(xué)診斷方法具有創(chuàng)傷小、敏感性高、特異性強(qiáng)和簡便經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于人體曼氏裂頭蚴病診斷中，對輕度感染、早期感染、隱性感染和深部組織寄生的病例，是一種良好的檢查手段，可彌補(bǔ)病原學(xué)和影像學(xué)診斷的不足［3，8-9］。目前，國內(nèi)市場上已有多種基于人體血清中特異性抗體IgY或IgM的試劑盒［10］。近年來，國內(nèi)外已建立數(shù)十種血清免疫學(xué)診斷方法，其中3種已列入衛(wèi)生學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］：①酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。該方法以曼氏裂頭蚴排泄-分泌抗原（excretory-secretory，ES）作為診斷抗原，通過間接ELISA方法檢測病人血清中蟲體特異性IgG抗體，具有高度的敏感性和特異性，穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，易于大范圍推廣。但該方法尚不能完全消除與其他寄生蟲病的交叉性反應(yīng)［3，8］；②斑點(diǎn)免疫金滲濾法（DIGFA）。該方法將曼氏裂頭蚴可溶性抗原點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上，以膠體金-SPA為檢測標(biāo)記物，采用垂直流滲濾裝置檢測病人血清中特異性IgG抗體。該方法操作簡單，不需特殊設(shè)備，但所用抗原為蟲體粗抗原，與其他寄生蟲病存在明顯的交叉反應(yīng)，僅適用于疑似病例的初篩或輔助檢查［3］；③免疫印跡。該方法以曼氏裂頭蚴ES抗原作為診斷抗原，進(jìn)行常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并制備抗原膜，再進(jìn)行免疫學(xué)檢測，當(dāng)分子質(zhì)量36ku和29ku抗原帶出現(xiàn)陽性反應(yīng)時判定為陽性結(jié)果［3，9］。

1.4 分子生物學(xué)診斷

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展為曼氏裂頭蚴病診斷提供了新途徑。目前，曼氏裂頭蚴cDNA文庫已成功構(gòu)建［10-11］，通過大規(guī)模測序篩選和生物信息學(xué)分析，從中已挑選具有潛在診斷價值的Sm18、W1和 W2等抗原基因［10-11］；其中，進(jìn)行Sm18基因已進(jìn)行克隆表達(dá)，已制備出可用于免疫診斷的重組抗原（Sm18），為研制曼氏裂頭蚴免疫診斷試劑盒提供良好基礎(chǔ)［10］。蘭智華［12］用曼氏裂頭蚴線粒體細(xì)胞色素C氧化酶1（cox1）特異性基因引物作重復(fù)PCR擴(kuò)增，對鑒定裂頭蚴蟲體感染重要意義。Bennett H M 等［13］在一例腦裂頭蚴病診斷中，以cox1基因?yàn)闃?biāo)記并進(jìn)行序列分析，確診了腦曼氏裂頭蚴感染。整體上而言，分子生物學(xué)診斷方法目前尚不成熟，其敏感性、特異性和可靠性需要進(jìn)一步提高或驗(yàn)證，客觀上也極大限制了該方法在臨床檢測中的應(yīng)用［10-11，13］。

2 蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷技術(shù)

2.1 病原學(xué)和分子生物學(xué)診斷

迄今為止，病原學(xué)檢查是蛇蛙曼氏裂頭蚴病流行病學(xué)調(diào)查中最常用的方法。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，該方法在烏梢蛇（Zoacysdhumnades）、滑鼠蛇（Ptyas mucosus）、灰鼠蛇（Ptyaskorros）和眼鏡蛇（Naja najaatra）等23種蛇類和虎紋蛙（Ranarugulosus）、黑斑蛙（Rananigromaculata）、金線蛙（Rana plancyi）和澤陸蛙（Fejervaryamultistriata）等15種蛙類檢測中運(yùn)用［1，14-24］。近些年，PCR技術(shù)也迅速應(yīng)用于蛇蛙曼氏裂頭蚴DNA診斷鑒定方面［20-24］。Liu W 等［20］對黑斑蛙裂頭蚴cox1基因進(jìn)行擴(kuò)增測序分析，系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，所有黑斑蛙均為曼氏裂頭蚴感染。黎建華［21］通過對黑斑蛙裂頭蚴線粒體DNApnad5和prrnS基因的多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)pnad5和prrnS兩段基因可以作為蛙曼氏裂頭蚴有效的遺傳標(biāo)記，并為種內(nèi)遺傳多態(tài)性研究提供基礎(chǔ)。曾利娟等［22］以湖南4個地區(qū)黑斑蛙中采集的曼氏裂頭蚴作為研究對象，PCR擴(kuò)增其nad1基因的部分序列（pnad1）并進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示曼氏裂頭蚴nad1序列為570bp，為曼氏裂頭蚴進(jìn)一步的分類、鑒定和遺傳變異研究奠定了基礎(chǔ)。李雯雯等［23］以從草腹鏈蛇（Amphiesmastolatum）分離到的1株裂頭蚴為研究對象，分別利用核糖體小亞基（18SrDNA）、大亞基（28SrDNA）、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和cox1對分離的裂頭蚴進(jìn)行分類鑒定，結(jié)果顯示該蟲株為曼氏裂頭蚴，并通過分子種系發(fā)育關(guān)系推斷cox1比ITS更適合用于種內(nèi)遺傳多態(tài)性研究，ITS則適合做定種的分子標(biāo)記。吳有陵［24］對王錦蛇（Elaphecarinata）、赤鏈蛇（Dinodonrufozonatum）和黑眉錦蛇（Elaphetaeniura）分離到裂頭蚴為對象，以cox1基因?yàn)榉诸惢?，種系發(fā)育樹分析顯示所分離的裂頭蚴都是曼氏裂頭蚴。

2.2 蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷中存在的問題

目前，蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷主要依靠蟲體基本形態(tài)學(xué)特征來鑒定，分子生物學(xué)檢測技術(shù)也有一定的進(jìn)展。然而，在蛇蛙曼氏裂頭蚴病鑒定方面仍存在一些問題和挑戰(zhàn)。

2.2.1 病原學(xué)診斷 病原學(xué)檢查是曼氏裂頭蚴病鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)［4］，也是蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷中最常用方法。然而，在當(dāng)今的蛇蛙曼氏裂頭蚴病防控工作中，該檢查方法存在以下四個方面缺點(diǎn)：①該方法通常依賴蛇蛙整體剖檢過程來完成，需要耗費(fèi)大量的人力物力，且需要專業(yè)的現(xiàn)場及技術(shù)人員，在大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查中，不易實(shí)施。②野生蛇蛙受法律保護(hù)，部分蛇蛙為國家或省重點(diǎn)的保護(hù)動物，通過處死大量蛇蛙來開展曼氏裂頭蚴病的監(jiān)測工作，有悖于我國野生動物資源保護(hù)的工作目的及理念。③我國南方地區(qū)存在食用或藥用蛇蛙的傳統(tǒng)習(xí)俗，每年都會消費(fèi)大量的蛇蛙，通過專業(yè)人員的病原學(xué)檢查來保障和實(shí)現(xiàn)蛇蛙的無害化工作是不現(xiàn)實(shí)。④病原學(xué)鑒定的主要方式是形態(tài)學(xué)觀測，但這些方法也是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，并不能對蟲株進(jìn)行精確的定種和種內(nèi)遺傳多樣性分析［23］，需要血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)等其他技術(shù)的綜合應(yīng)用。

2.2.2 免疫學(xué)診斷 目前，免疫學(xué)診斷在蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷方面并無應(yīng)用。雖然在人體曼氏裂頭蚴病診斷方面，免疫學(xué)方法是成熟的檢測技術(shù)，且應(yīng)用廣泛，但兩爬類動物免疫特征與哺乳類有較大差異，如兩爬類動物只存在4種免疫球蛋白類型IgM、IgX（對應(yīng)于哺乳動物IgA）、IgY（被認(rèn)為是IgG和IgE的進(jìn)化前體）和IgF［25］，這給完全照搬人體免疫學(xué)診斷技術(shù)帶來了一定挑戰(zhàn)和很大不確定性。蛇蛙曼氏裂頭蚴病免疫學(xué)診斷技術(shù)的建立，要克服或解決以下四個方面問題：①蛇蛙曼氏裂頭蚴感染后的特異性抗體IgY或IgM抗體水平和動態(tài)變化，為ELISA、DIGFA和 Western blot法在蛇蛙曼氏裂頭蚴早期感染和診斷方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)；②蛇蛙IgY或IgM提取和純化技術(shù)，為DIGFA法在蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷中的應(yīng)用提供質(zhì)控IgY或IgM；③尋找可被裂頭蚴感染蛇蛙血清（特異性抗體IgY或IgM）識別的蟲體排泄分泌（ES）抗原，為Western blot法在蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷中的應(yīng)用提供技術(shù)支撐；④積累蛇蛙其他常見寄生蟲感染的陽性血清，為ELISA法在蛇蛙曼氏裂頭蚴診斷上的交叉反應(yīng)的驗(yàn)證或排除提供實(shí)驗(yàn)材料保障。

2.2.3 影像學(xué)診斷 影像學(xué)診斷技術(shù)在珍稀瀕危野生蛇蛙檢測方面具有一定前景，對珍稀瀕危野生蛇蛙資源保護(hù)具有重要應(yīng)用價值。但該診斷方法需要專業(yè)儀器設(shè)備，耗費(fèi)較大，且沒有兩棲及爬行動物專用的儀器設(shè)備，人體影像學(xué)儀器設(shè)備能否直接應(yīng)用，尚需大量驗(yàn)證和科學(xué)研究。

2.2.4 分子生物學(xué)診斷 分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展為蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷提供了新途徑，但目前仍存在一些問題：①曼氏裂頭蚴基因組數(shù)據(jù)庫還不夠完善，目的基因篩選也很有限，極大限制了可用于免疫診斷的高度特異性重組抗原的制備；②目前已建立的分子生物學(xué)檢查方法，主要用于曼氏裂頭蚴蟲株的定種和種內(nèi)遺傳多樣性分析，多從專業(yè)科研角度出發(fā)來進(jìn)行探討和研究，不利于大規(guī)模基層推廣和應(yīng)用；③PCR是分子生物學(xué)診斷核心技術(shù)，其操作復(fù)雜，對設(shè)備、技術(shù)人員及實(shí)驗(yàn)條件要求高，單個成本費(fèi)用也高，如不能基于該技術(shù)推出商品化試劑盒，將是該方法推廣應(yīng)用的瓶頸因素。

3 展望

我國南方地區(qū)食用或藥用蛇、蛙的傳統(tǒng)歷史悠久［14-16］，要在短期內(nèi)改變民眾傳統(tǒng)的消費(fèi)習(xí)俗是困難的和不現(xiàn)實(shí)的，因此我國曼氏裂頭蚴病防控工作任重而道遠(yuǎn)。展望未來，為促進(jìn)我國蛇蛙養(yǎng)殖的產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；蜔o害化發(fā)展，保障人類公共衛(wèi)生安全，需要重點(diǎn)開展4個方面工作：①建立蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷的林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。野生動物疫病監(jiān)測防控是林業(yè)行政主管部門的法定職責(zé)，廣東省已將蛇蛙曼氏裂頭蚴病列入《廣東省需要重點(diǎn)監(jiān)測的野生動物疫病名錄》。未來要爭取盡快立項(xiàng)和制訂“蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷”林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，為蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化提供技術(shù)支撐；②加大從業(yè)人員蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷技術(shù)培訓(xùn)。我國野生動物疫病監(jiān)測防控工作尚處于起步階段，有關(guān)管理人員、業(yè)務(wù)骨干和養(yǎng)殖人員對蛇蛙曼氏裂頭蚴病診斷檢測技能薄弱，難以保障和實(shí)現(xiàn)我國蛇蛙養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展和食品安全工作，因此，相關(guān)從業(yè)人員的技能培訓(xùn)工作對從食物源頭防控曼氏裂頭蚴病具有重要意義；③開發(fā)和上市蛇蛙專用曼氏裂頭蚴病診斷試劑盒。試劑盒具有簡潔、經(jīng)濟(jì)、快速和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)和上市蛇蛙專用曼氏裂頭蚴病診斷試劑盒，有利于曼氏裂頭蚴病診斷技術(shù)大規(guī)模推廣和應(yīng)用；④重點(diǎn)篩選高度特異性的曼氏裂頭蚴目的基因。在成功篩選高度特異性的曼氏裂頭蚴目的基因基礎(chǔ)上，制備高度特異性重組蛋白，進(jìn)而開發(fā)蛇蛙專用的曼氏裂頭蚴病生物工程疫苗或診斷試劑，對曼氏裂頭蚴病的源頭防控也具有重要意義。

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