線粒體移植對(duì)水牛卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響

高亞可，陸鳳花，吳柱連，馬 帆，劉曉華，杜姍姍，石德順

(廣西大學(xué)亞熱帶生物資源保護(hù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530005)

線粒體移植對(duì)水牛卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響

高亞可，陸鳳花，吳柱連，馬 帆，劉曉華，杜姍姍，石德順*

(廣西大學(xué)亞熱帶生物資源保護(hù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530005)

本研究以水牛卵泡顆粒細(xì)胞作為線粒體的來(lái)源細(xì)胞，初步探討水牛卵母細(xì)胞進(jìn)行線粒體移植(MIT)后對(duì)其發(fā)育潛能的影響。試驗(yàn)比較了不同級(jí)別水牛卵母細(xì)胞mtDNA的拷貝數(shù)，并研究了水牛卵母細(xì)胞進(jìn)行MIT后，其后續(xù)早期胚胎發(fā)育及胚胎線粒體膜電位(ΔΨm)的變化情況。結(jié)果顯示：一級(jí)卵母細(xì)胞組的平均mtDNA拷貝數(shù)極顯著高于二、三級(jí)卵母細(xì)胞組((202 101±74 432)vs(118 483±17 028)，(39 177±7 938)，P<0.01)，二級(jí)卵母細(xì)胞組的平均mtDNA拷貝數(shù)極顯著高于三級(jí)卵母細(xì)胞組((118 483±17 028)vs(39 177±7 938)，P<0.01)；孤雌激活處理后發(fā)現(xiàn)：一級(jí)卵母細(xì)胞組的卵裂率和囊胚率也都極顯著高于二、三級(jí)卵母細(xì)胞組(P<0.01)，而二級(jí)卵母細(xì)胞組激活后胚胎的卵裂率和囊胚率亦極顯著高于三級(jí)卵母細(xì)胞組(P<0.01)。用Mito-Tracker探針標(biāo)記的外源線粒體經(jīng)移植后，會(huì)隨著胚胎的發(fā)育而發(fā)生移動(dòng)，分布到各個(gè)卵裂球中；且發(fā)現(xiàn)二級(jí)卵母細(xì)胞MIT組孤雌激活后的囊胚率顯著高于對(duì)照組和空注組(27.3%vs17.4%，7.84%，P<0.05)，而三級(jí)卵母細(xì)胞MIT組激活后的囊胚率與對(duì)照組和空注組差異不顯著(P>0.05)；對(duì)胚胎ΔΨm檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，水牛植入前各時(shí)期胚胎ΔΨm總體呈上升趨勢(shì)，線粒體移植后胚胎各時(shí)期的ΔΨm均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。綜上表明：不同質(zhì)量的水牛卵母細(xì)胞其mtDNA拷貝數(shù)存在顯著差異，且mtDNA拷貝數(shù)與卵母細(xì)胞質(zhì)量和發(fā)育能力成正相關(guān)；通過(guò)移植外源線粒體可以提高二級(jí)水牛卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。

線粒體移植；mtDNA拷貝數(shù)；線粒體膜電位；水牛；卵泡顆粒細(xì)胞

線粒體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中含量最為豐富的細(xì)胞器，其基本功能是為細(xì)胞的一切生命活動(dòng)提供能量(ATP)，同時(shí)還對(duì)配子的成熟和早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生重要的影響。在卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程中，線粒體的數(shù)量、結(jié)構(gòu)及分布不是固定不變的，它會(huì)隨著卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中對(duì)能量的需求變化而變化。但隨著卵母細(xì)胞的成熟完成，mtDNA將不再進(jìn)行自我復(fù)制，直至囊胚孵化階段才恢復(fù)復(fù)制[1]，因此，早期胚胎發(fā)育各階段所需要的能量主要由卵母細(xì)胞自身所攜帶的線粒體提供。J.Van Blerkom等[2]研究發(fā)現(xiàn)，ATP的供應(yīng)能力對(duì)于卵母細(xì)胞的受精和早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要，ATP含量低的卵子雖然也具有一定的受精能力，但僅當(dāng)ATP含量≥2 pmol時(shí)，受精卵才容易繼續(xù)發(fā)育。研究表明，在胚胎發(fā)育早期需要大量的能量，尤其是4-～8-細(xì)胞期，如果能量供給不足，胚胎就會(huì)分裂減緩，染色體非整倍體率增加，繼而發(fā)育阻滯[3]。C.T.Zeng等[4]進(jìn)行患者自體顆粒細(xì)胞線粒體移植(MIT)后，成功獲得妊娠的臨床報(bào)道。2003年，中國(guó)首例MIT的雙胞胎兒順利出生并且健康狀況良好[5]。在小鼠，Y.C.Yi等[6]分別對(duì)年輕和老齡小鼠進(jìn)行MIT，與未移植的對(duì)照組相比，年輕小鼠組兩者囊胚率差異顯著，老齡小鼠組兩者囊胚率差異極顯著。因此，MIT可以一定程度上改善卵子的質(zhì)量和胚胎的發(fā)育能力。本試驗(yàn)以水牛卵泡顆粒細(xì)胞作為線粒體的來(lái)源細(xì)胞，嘗試對(duì)水牛卵母細(xì)胞進(jìn)行線粒體移植，探討線粒體移植對(duì)水牛卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響以及其在水牛卵母細(xì)胞上應(yīng)用的可行性。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料

水牛卵巢采自于南寧市屠宰場(chǎng)。

1.2 主要試劑

本試驗(yàn)所用化學(xué)試劑除特殊說(shuō)明外均購(gòu)自Sigma 公司。TCM-199、DMEM購(gòu)自Gibco公司，質(zhì)粒PMD18-T Vector、DNATaq酶、10×PCR Buffer、Taq Mastermix 和SYBR Premix Ex TaqTM 購(gòu)自大連寶生物公司(TaKaRa)；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，瓊脂糖Agarose購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司；卵母細(xì)胞裂解液(1×PCR buffer，2.5% Triton X-100，100 μg·mL-1蛋白酶K)購(gòu)自英國(guó)Huntingdon公司；線粒體提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Hermo公司；Mito-Tracker Green線粒體熒光探針購(gòu)自碧云天生物公司；JC-1線粒體熒光探針購(gòu)自美國(guó)AAT Bioquest。

1.3 主要儀器

電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)，PCR儀(Biometra)，高速離心機(jī)和紫外分光光度計(jì)(Thermo)，MILLIQ-BioCel 超純水制備系統(tǒng)(Millipore)，超凈工作臺(tái)(蘇州佳德凈化科技)，生化恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅醫(yī)療設(shè)備)，7500 Real Time PCR(Applied Biosystems)，實(shí)體顯微鏡(Nikon)，倒置顯微鏡及顯微操作系統(tǒng)(Nikon)，激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM510 meta，Leica)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，高速冷凍離心機(jī)(Sigma)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 水牛卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng) 從屠宰場(chǎng)收集的水牛卵巢置于30 ℃左右高壓滅菌生理鹽水中2～3 h運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。卵巢先用75%酒精潤(rùn)洗消毒后，再用預(yù)熱滅菌生理鹽水清洗2～3遍，用帶有12號(hào)針頭的10 mL注射器抽取卵巢皮質(zhì)層2～5 mm直徑的卵泡。抽卵前先吸取少量預(yù)熱的CCM液(TCM-199+5 mmol·L-1HEPES+5 mmol·L-1NaHCO3+3% FBS)，體視顯微鏡下揀出卵泡液中的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)。經(jīng)CCM液清洗2～3遍后，放入預(yù)熱M液(TCM-199+5 mmol·L-1HEPES+26.2 mmol·L-1NaHCO3+0.1 μg·mL-1FSH+5% FBS)中過(guò)渡處理3 min，然后移入另一份M液中，每100 μL體積M液中放入10～20枚COCs。置于38.5 ℃ 5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)22～24 h。

1.4.2 體外成熟卵母細(xì)胞的分類(lèi) 根據(jù)體外成熟后卵母細(xì)胞的形態(tài)和卵丘顆粒細(xì)胞的層數(shù)，可將卵母細(xì)胞大致分為5類(lèi)[7]：A類(lèi)卵母細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，卵丘顆粒細(xì)胞致密，至少包裹有5層以上卵丘顆粒細(xì)胞；B類(lèi)卵母細(xì)胞形態(tài)基本規(guī)則，卵丘顆粒細(xì)胞為2～4層，基本上包裹卵母細(xì)胞；C類(lèi)卵母細(xì)胞大部分被卵丘顆粒細(xì)胞包裹，形態(tài)基本規(guī)則；D類(lèi)卵母細(xì)胞外只有少量卵丘顆粒細(xì)胞存在，形態(tài)基本規(guī)則；E類(lèi)卵母細(xì)胞為裸卵，形態(tài)基本規(guī)則。其中A、B類(lèi)卵母細(xì)胞歸為一級(jí)，C、D類(lèi)卵母細(xì)胞歸為二級(jí)，E類(lèi)卵母細(xì)胞歸為三級(jí)。

1.4.3 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.4.3.1 PCR擴(kuò)增：將去除顆粒細(xì)胞后的5枚水牛卵母細(xì)胞移入10 μL裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，作為PCR擴(kuò)增的模板。參考GenBank中牛線粒體全基因組(NC_006853)和文獻(xiàn)[8]，設(shè)計(jì)引物序列(上游：5′-CAGTGAGAATGCCCTCTAGG-3′；下游：5′-TTTACGCCGTACTCCTGT-3′)。在200 μL滅菌PCR中依次加入Taq Mastermix 10 μL、引物各0.5 μL、模板1 μL、雙蒸水8 μL，PCR擴(kuò)增程序：95 ℃變性3 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，30循環(huán)；72 ℃10 min。擴(kuò)增后產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳(110 V 30 min)，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照觀察。

1.4.3.2 目的片段的克隆、鑒定：切下目標(biāo)條帶，回收并純化PCR產(chǎn)物(天根生化科技有限公司)。利用pMD18-T 載體進(jìn)行連接，于16 ℃水浴過(guò)夜，次日進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化前先預(yù)熱復(fù)蘇液和培養(yǎng)基，取5 μL連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)菌中冰浴30 min，將混合物放入42 ℃水浴鍋，水浴60 s，冰上放置2 min，加入1 mL復(fù)蘇液于混合物中，搖床中混勻45 min后離心。棄去上層800 μL 液體，將剩余液體混勻涂于加入抗生素的LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h 后挑菌、搖菌。提取質(zhì)粒前，先進(jìn)行菌液cracking鑒定，挑選陽(yáng)性菌液提取重組質(zhì)粒(天根生化科技公司)。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，若重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，則測(cè)定其濃度，并對(duì)其梯度稀釋保存。1.4.3.3 熒光定量PCR：將上述梯度稀釋好的質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為實(shí)時(shí)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)體系:SYBR II 10 μL、ROX染料0.4 μL、引物各0.3 μL、雙蒸水8 μL、模板1 μL，共20 μL；反應(yīng)條件:95 ℃5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)。

1.4.4 mtDNA拷貝數(shù)測(cè)定 按上述分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)分別收集不同級(jí)別的卵母細(xì)胞，5枚一組放入10 μL細(xì)胞裂解液內(nèi)，55 ℃水浴鍋內(nèi)放置20～30 min，100 ℃沸水中放置5 min，再以1 000 r·min-1離心2 min，取10 μL上清液稀釋20倍后作為 PCR 模板。熒光定量 PCR 反應(yīng)體系同1.4.3.3，以雙蒸水和裂解液作為陰性對(duì)照組。

1.4.5 孤雌激活處理 分別對(duì)各級(jí)別卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活處理。先用5 μmol·L-1的離子霉素激活處理 5 min，用培養(yǎng)液清洗3遍，然后移入含 2 mmol·L-1的二甲氨基嘌呤(6-DMAP)的培養(yǎng)液中激活處理3 h。激活后用培養(yǎng)液清洗3遍，移入水牛顆粒細(xì)胞單層的培養(yǎng)微滴內(nèi)，置于38.5 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每48 h換液1次。24 h后統(tǒng)計(jì)各組胚胎卵裂率，7 d后統(tǒng)計(jì)各組胚胎囊胚率。

1.4.6 水牛卵泡顆粒細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng) 具體方法參照文獻(xiàn)[9]。

1.4.7 線粒體的提取及活性檢測(cè) 水牛顆粒細(xì)胞培養(yǎng)匯合至70%～80% 時(shí)，用胰酶消化、收集細(xì)胞，單次提取的細(xì)胞數(shù)量約5×107。依據(jù)線粒體提取試劑盒(Thermo公司)操作要求，將收集的顆粒細(xì)胞洗滌后加入預(yù)冷的2 mL玻璃勻漿器中，加入800 μL分離液A，冰上研磨30～40 s使細(xì)胞破裂(可取少量研磨液鏡下觀察細(xì)胞破裂程度)，加入500 μL分離液C并一起轉(zhuǎn)移到滅菌EP管內(nèi)，1 500 r·min-1離心5 min，取上清12 000 r·min-1離心 20 min，棄上清，加入500 μL分離液C重懸洗滌，1 500 r·min-1離心5 min，取上清12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，線粒體沉淀在管底，加入5 μL保存液混勻懸浮備用。活性線粒體經(jīng)Mito-Tracker Green染色后可以發(fā)出綠色熒光，活性較低或失去活性的線粒體則熒光強(qiáng)度較弱或沒(méi)有熒光。檢測(cè)時(shí)，將Mito-Tracker熒光探針工作液200 μL與提取的線粒體混勻，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，洗滌2～3次后12 000 r·min-1離心10 min回收線粒體，熒光顯微鏡下檢測(cè)線粒體的熒光強(qiáng)度。

1.4.8 線粒體移植 將事先提取好的線粒體放入CO2培養(yǎng)箱中溫育30 min。在操作盤(pán)中分別做5 μL線粒體懸液滴、30 μL胰酶溶液滴各1個(gè)，30 μL培養(yǎng)液(CM)液滴(放置卵母細(xì)胞)若干滴，覆蓋石蠟油，將操作盤(pán)置于CO2培養(yǎng)箱中溫育5～10 min。借助顯微操作系統(tǒng)，使用內(nèi)徑6～7 μm 的顯微注射針，先吸取一定量(相當(dāng)于1～1.5個(gè)卵母細(xì)胞直徑長(zhǎng)度)的線粒體懸液，再緩緩注入單個(gè)卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。線粒體移植后用CM液清洗卵母細(xì)胞2～3次，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)恢復(fù)處理1 h后進(jìn)行孤雌激活處理。1.4.9 胚胎線粒體膜電位(ΔΨm)測(cè)定 按照線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制JC-1工作液，染色前先將工作液在CO2培養(yǎng)箱中溫育30 min，使用時(shí)與CM培養(yǎng)液1∶1混勻。收集各時(shí)期(2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑椹胚和囊胚)胚胎，置于JC-1工作液中避光染色30 min。由于JC-1探針的水溶性較差，會(huì)有輕微絮狀不容物附在胚胎表面，染色結(jié)束后需用CM液多次洗滌，可輕微吹打。熒光顯微鏡下分別于綠色和紅色熒光模塊下觀察，獲取熒光圖像，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量同一胚胎的紅、綠熒光值，最后計(jì)算同一胚胎的紅、綠熒光比值即為胚胎的線粒體膜電位值(ΔΨm)。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)與卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系 收集經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后不同級(jí)別的水牛卵母細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)卵母細(xì)胞mtDNA 的拷貝數(shù)，并分別對(duì)各級(jí)別卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活處理，觀察統(tǒng)計(jì)其胚胎發(fā)育情況，初步分析mtDNA拷貝數(shù)與卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系。

1.5.2 線粒體的活性檢測(cè)及移植后的追蹤觀察 以水牛卵泡顆粒細(xì)胞作為線粒體提取的供源細(xì)胞，將提取出的線粒體用Mito-Tracker熒光探針標(biāo)記后，熒光顯微鏡下觀測(cè)線粒體的活性值；同時(shí)借助顯微操作系統(tǒng)，將一定量的標(biāo)記后的線粒體植入體外成熟培養(yǎng)24 h后的卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，然后進(jìn)行孤雌激活處理。熒光顯微鏡下觀察外源線粒體在胚胎發(fā)育過(guò)程中的分布及存活情況。

1.5.3 線粒體移植對(duì)水牛胚胎發(fā)育的影響 試驗(yàn)以二、三級(jí)水牛卵母細(xì)胞為研究對(duì)象，初步探討MIT對(duì)二、三級(jí)水牛卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響。將提取的活性線粒體移植到二、三級(jí)卵母細(xì)胞胞質(zhì)后進(jìn)行孤雌激活處理，設(shè)置空注組(注入等量的線粒體懸浮液)和對(duì)照組(不移植)，觀察并統(tǒng)計(jì)各組胚胎發(fā)育情況。

1.5.4 線粒體移植對(duì)水牛植入前胚胎線粒體膜電位的影響 本試驗(yàn)旨在探索MIT對(duì)水牛植入前胚胎線粒體膜電位的影響。收集體外成熟培養(yǎng)24 h后的水牛二級(jí)卵母細(xì)胞，隨機(jī)分為兩組，一組進(jìn)行線粒體移植，另一組為對(duì)照組，然后分別進(jìn)行孤雌激活處理并進(jìn)行胚胎培養(yǎng)。收集兩組各階段胚胎，通過(guò)JC-1熒光探針染色來(lái)檢測(cè)不同時(shí)期胚胎的ΔΨm值，熒光顯微鏡下分別于綠色和紅色熒光模塊下觀察，獲取熒光圖像，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量同一胚胎的紅、綠熒光值，最后計(jì)算同一胚胎的紅、綠熒光比值即為胚胎的線粒體膜電位值(ΔΨm)。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增出225 bp大小目的片段(圖1 A)，擴(kuò)增條帶清晰明亮，沒(méi)有拖帶現(xiàn)象。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定(圖1B)：重組質(zhì)粒大小約3 000 bp，條帶清晰明亮，雙酶切檢測(cè)切下片段約為300 bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

將梯度稀釋的質(zhì)粒經(jīng)real-time PCR反應(yīng)后，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.396，截距為36.492，R2值為0.997，其線性范圍可達(dá)6個(gè)數(shù)量級(jí)，其重組質(zhì)粒濃度與相應(yīng)的Ct值線性關(guān)系良好，可用于量化樣品中mtDNA的拷貝數(shù)。

2.2 不同級(jí)別水牛卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)

采用qRT-PCR檢測(cè)不同級(jí)別水牛卵母細(xì)胞mtDNA 拷貝數(shù)的分析結(jié)果：一級(jí)卵母細(xì)胞組的平均mtDNA拷貝數(shù)極顯著高于二、三級(jí)卵母細(xì)胞組((202 101±74 432)vs(118 483±17 028)，(39 177±7 938)，P<0.01)；二級(jí)卵母細(xì)胞組的平均mtDNA拷貝數(shù)亦極顯著高于三級(jí)卵母細(xì)胞組((118 483±17 028)vs(39 177±7 938)，P<0.01)。表明不同質(zhì)量的水牛卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)存在顯著差異。

M1.Marker Ⅰ;M2.Super marker;M3.Marker Ⅲ圖1 PCR擴(kuò)增目的基因片段(A)和重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定(B)Fig.1 The target gene fragment of PCR amplification(A)and double digestion of the recombinant plasmid(B)

圖2 mtDNA 拷貝數(shù)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of mtDNA copy number

2.3 不同級(jí)別水牛卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎的發(fā)育

不同級(jí)別水牛卵母細(xì)胞孤雌激活處理后胚胎發(fā)育情況見(jiàn)表1，一級(jí)卵母細(xì)胞經(jīng)孤雌激活處理后的胚胎卵裂率和囊胚率都極顯著高于二、三級(jí)卵母細(xì)胞組(P<0.01)；而二級(jí)卵母細(xì)胞激活后胚胎的卵裂率和囊胚率亦極顯著高于三級(jí)卵母細(xì)胞組(P<0.01)。表明水牛卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)與胚胎發(fā)育的能力成正相關(guān)(圖3)。

同組不同大寫(xiě)字母標(biāo)注表示差異極顯著(P<0.01)Data with different capital letters indicate highly significant difference (P<0.01)圖3 卵母細(xì)胞mtDNA 拷貝數(shù)與胚胎發(fā)育能力的關(guān)系Fig.3 The relationship between oocyte mtDNA copy number and embryo development

表1 不同級(jí)別水牛卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎的發(fā)育情況

Table 1 The development of parthenogenetic embryos from different quality of buffalo oocytes

組別Groups卵母細(xì)胞數(shù)No.ofoocytes分裂率/%Cleavagerate囊胚率/%Blastocystrate一級(jí)卵母細(xì)胞Thefirstlevelofoocytes11771.83±2.60A42.85±2.86A二級(jí)卵母細(xì)胞Thesecondlevelofoocytes14341.61±5.52B25.06±2.04B三級(jí)卵母細(xì)胞Thethirdlevelofoocytes12915.26±1.41C2.25±0.79C

同列標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同

Data with different small letters in the same column mean significant difference (P<0.05)，different capital letters indicate highly significant difference (P<0.01).The same as below

2.4 線粒體的活性檢測(cè)及移植后的追蹤觀察

從水牛顆粒細(xì)胞中提取線粒體，活性線粒體經(jīng)Mito-Tracker Green熒光探針標(biāo)記后呈綠色熒光，如圖4A和4B所示，熒光探針標(biāo)記染色結(jié)果顯示從水牛顆粒細(xì)胞提取的線粒體活性良好。線粒體移植后，在熒光顯微鏡下觀察外源線粒體在胚胎發(fā)育過(guò)程中的分布及存活情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：外源線粒體移植后隨著胚胎發(fā)育而發(fā)生移動(dòng)，并分配到每個(gè)卵裂球中。說(shuō)明顆粒細(xì)胞線粒體移植后，在一定時(shí)間內(nèi)，持續(xù)具有活性并參與了早期胚胎發(fā)育的過(guò)程(圖4C和4D)。

A．常光下線粒體懸液圖，B.綠色熒光下線粒體懸液圖；C．線粒體移植2 h后熒光下胚胎圖；D.線粒體移植24 h后熒光下胚胎圖A.Suspension droplet of mitochondria under bright-field；B.Suspension droplet of mitochondria under fluorescence；C.The embryos after MIT for 2 h under fluorescence；D.The embryos after MIT for 24 h under fluorescence圖4 線粒體移植前線粒體懸液及注射后胚胎熒光觀察400×Fig.4 The fluorescence observing of suspension droplet of mitochondria before MIT and embryos in different stage after MIT 400×

2.5 線粒體移植對(duì)水牛卵母細(xì)胞后續(xù)胚胎發(fā)育的影響

線粒體移植對(duì)二、三級(jí)水牛卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎發(fā)育的影響(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：二級(jí)卵母細(xì)胞線粒體移植后的孤雌激活胚胎的囊胚發(fā)育率顯著高于對(duì)照組和空注組(27.3%vs17.4%，7.84%，P<0.05)；而三級(jí)卵母細(xì)胞線粒體移植后孤雌激活胚胎的囊胚率與對(duì)照組和空注組無(wú)顯著差異(4.73%vs3.43%，1.36%，P>0.05)。說(shuō)明水牛顆粒細(xì)胞線粒體移植可以改善二級(jí)卵母細(xì)胞后續(xù)胚胎的發(fā)育潛能，但對(duì)三級(jí)卵母細(xì)胞無(wú)明顯作用。

表2 MIT對(duì)水牛二、三級(jí)卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎發(fā)育的影響

Table 2 The effect of MIT on parthenogenetic embryonic development of the second and the third level of buffalo oocytes %

組別Groups二級(jí)卵母細(xì)胞Thesecondlevelofoocytes三級(jí)卵母細(xì)胞Thethirdlevelofoocytes細(xì)胞數(shù)No.ofoocytes卵裂率Cleavagerate8-細(xì)胞胚胎率8-cellembryorate囊胚率Blastocystrate細(xì)胞數(shù)No.ofoocytes卵裂率Cleavagerate8-細(xì)胞胚胎率8-cellembryorate囊胚率Blastocystrate注射組Injectiongroup143(84)58.7a(70)48.9a(39)27.3a169(31)18.3a(20)11.8a(8)4.73對(duì)照組Control115(71)61.8a(45)39.1b(20)17.4b175(34)19.4a(19)10.9a(6)3.43空注組Nothinginjection102(42)41.2b(19)18.6c(8)7.84c147(13)8.84b(7)4.76b(2)1.36

2.6 線粒體移植對(duì)水牛胚胎線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位ΔΨm是在線粒體內(nèi)膜兩側(cè)離子泵的作用下形成的，是保證線粒體電子傳遞鏈和氧化磷酸化形成的前提，從而保證了ATP的正常供應(yīng)。本試驗(yàn)主要通過(guò)JC-1熒光探針染色(圖5)來(lái)檢測(cè)不同時(shí)期胚胎的ΔΨm值，其結(jié)果見(jiàn)表3，從2-細(xì)胞～囊胚的ΔΨm 總體呈上升趨勢(shì)，MIT組2-細(xì)胞、4-細(xì)胞的ΔΨm極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，8-細(xì)胞期、桑椹胚和囊胚ΔΨm顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。可見(jiàn)，線粒體移植可以明顯提高水牛孤雌激活胚胎各時(shí)期的ΔΨm，但不改變?cè)谂咛グl(fā)育過(guò)程中ΔΨm的總體變化趨勢(shì)(圖6)。

表3 MIT對(duì)水牛胚胎線粒體膜電位的影響

Table 3 The effect of MIT on mitochondrial membrane potential of buffalo embryo

組別Groups線粒體膜電位值ΔΨm2-細(xì)胞2-cell4-細(xì)胞4-cell8-細(xì)胞8-cell桑椹胚M(jìn)orula囊胚Blastocyst移植組Transplantation0.3428±0.0742A0.3371±0.0556A0.3079±0.0814a0.4552±0.0427a0.5518±0.0538a對(duì)照組Control0.2306±0.0433B0.2318±0.0471B0.2460±0.0533b0.3915±0.0411b0.5165±0.0494b

A1～A3、B1～B3、C1～C3、D1～D3和E1～E3.2-細(xì)胞期胚胎、4-細(xì)胞期胚胎、桑椹胚、囊胚和孵化囊胚A1-A3，B1-B3，C1-C3，D1-D3，E1-E3.Respectively 2- cell stage embryos，4- cell stage embryos，8- cell stage embryos，morula，blastocyst and hatched blastocyst from top to bottom圖5 各時(shí)期胚胎JC-1探針染色后可見(jiàn)光、綠色熒光、紅色熒光圖 400×Fig.5 Images in each row are embryos stained by JC-1 under a visible light，green fluorescence and red fluorescence 400×

圖6 水牛孤雌激活胚胎各時(shí)期ΔΨmFig.6 The ΔΨm of buffalo parthenogenetic embryos in different stage

3 討 論

mtDNA拷貝數(shù)是影響哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量和早期胚胎發(fā)育能力的重要因素。在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的mtDNA不斷進(jìn)行復(fù)制，線粒體的數(shù)量和分布也會(huì)隨著卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中對(duì)能量需求的變化而變化。細(xì)胞成熟后mtDNA停止復(fù)制，直到囊胚孵化階段才逐漸恢復(fù)復(fù)制。T A.Santos等[10]通過(guò)對(duì)不同受精結(jié)局的卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常受精組高于受精失敗組和退化組。J.Hansen等[11]認(rèn)為，高齡婦女卵母細(xì)胞發(fā)育潛能低可能是由于卵母細(xì)胞中完整的mtDNA 拷貝數(shù)下降，或者mtDNA轉(zhuǎn)錄水平下降所至。此外，卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)還與卵母細(xì)胞凋亡[12]以及胚胎發(fā)育阻滯等密切相關(guān)[13]。因此，線粒體mtDNA拷貝數(shù)可以一定程度上作為評(píng)估水牛卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量和隨后胚胎發(fā)育能力的指標(biāo)。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)三級(jí)水牛卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)極顯著低于一、二級(jí)卵母細(xì)胞組，且孤雌激活胚胎的發(fā)育能力顯著低于一、二級(jí)卵母細(xì)胞組，說(shuō)明三級(jí)水牛卵母細(xì)胞(裸卵)在體外成熟過(guò)程中未能正常進(jìn)行mtDNA復(fù)制，細(xì)胞成熟不完全，同時(shí)也表明了水牛卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)與卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育的能力成正相關(guān)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二級(jí)卵母細(xì)胞經(jīng)線粒體移植后可以顯著提高其孤雌激活胚胎的發(fā)育能力，這一結(jié)果與王曉磊等的試驗(yàn)結(jié)果相似[14]；試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，雖然MIT組與對(duì)照組相比卵裂率無(wú)顯著差異，但都顯著高于空注組(P<0.01)，說(shuō)明了顯微操作會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的機(jī)械損傷，同時(shí)也說(shuō)明線粒體移植對(duì)胚胎的發(fā)育有明顯的改善作用。另外試驗(yàn)結(jié)果顯示，MIT對(duì)三級(jí)卵母細(xì)胞的胚胎發(fā)育率并無(wú)明顯改善作用，這可能是由于三級(jí)水牛卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)過(guò)低，卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟不完全，顯著降低了其胚胎的發(fā)育能力。同時(shí)依據(jù)J.Van Blekrom等[2]的研究結(jié)果，卵母細(xì)胞內(nèi)ATP的含量要達(dá)到一定的閾值胚胎才能正常受精和發(fā)育，而對(duì)三級(jí)水牛卵母細(xì)胞注入有限的外源線粒體可能無(wú)法提高其ATP的含量達(dá)到這個(gè)閾值，因而對(duì)胚胎的發(fā)育無(wú)明顯改善作用。

在對(duì)卵胞質(zhì)移植和體細(xì)胞核移植的研究發(fā)現(xiàn)，雖然供體細(xì)胞的mtDNA進(jìn)入受體卵母細(xì)胞后會(huì)隨著胚胎的發(fā)育發(fā)生遺傳漂變或降解而逐漸減少，甚至全部消失，但也有少量的mtDNA可以被同化并參與受體胚胎的發(fā)育，且可以遺傳給后代[15]。這說(shuō)明在受體卵母細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有生物學(xué)機(jī)制上可以徹底破壞外源線粒體的酶類(lèi)存在，受體卵母細(xì)胞胞質(zhì)對(duì)外源線粒體具有一定程度的可兼容性。本試驗(yàn)將顆粒細(xì)胞線粒體移植到水牛卵母細(xì)胞中并進(jìn)行孤雌激活處理，發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記的外源線粒體會(huì)隨著胚胎的發(fā)育發(fā)生移動(dòng)，并被分配到卵裂球中，說(shuō)明外源線粒體移植后在一定時(shí)間內(nèi)可持續(xù)具有活性，并參與了胚胎的早期發(fā)育。但多數(shù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度會(huì)隨著胚胎發(fā)育越來(lái)越弱，這可能是由于移植的線粒體數(shù)量相對(duì)有限，且隨著胚胎發(fā)育部分外源線粒體被逐步降解，同時(shí)線粒體活性熒光探針也會(huì)隨著觀察次數(shù)的增多而發(fā)生熒光淬滅。線粒體膜電位(ΔΨm)是通過(guò)線粒體內(nèi)膜兩側(cè)“質(zhì)子泵”的作用形成，是保證電子傳遞以及氧化磷酸化反應(yīng)正常進(jìn)行，促使細(xì)胞能量物質(zhì) ATP 形成的前提[16]，此外，ΔΨm與卵母細(xì)胞成熟、受精和卵裂過(guò)程中線粒體的空間穩(wěn)定，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，維護(hù)鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程也直接相關(guān)[17-19]。因此，ΔΨm被認(rèn)為是影響卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育潛能的重要因素之一。本試驗(yàn)在對(duì)早期胚胎ΔΨm測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，正常水牛孤雌激活胚胎從2-細(xì)胞～囊胚，其ΔΨm總體呈上升趨勢(shì)，這與劉延荷等對(duì)小鼠的研究結(jié)果一致[20]。這可能是由于隨著胚胎的發(fā)育進(jìn)行，胚胎的耗能越來(lái)越多，會(huì)不斷激活一些原來(lái)可能處于“休眠”狀態(tài)的線粒體參與供能，從而提高了胚胎的ΔΨm值。同時(shí)，MIT組的卵母細(xì)胞孤雌激活后各個(gè)時(shí)期胚胎的ΔΨm均明顯高于對(duì)照組。這可能是由于被移植的外源線粒體具有較高的活性，并有部分外源線粒體參與了胚胎的發(fā)育過(guò)程，從而增加了胚胎整體的ΔΨm值。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，外源線粒體移植雖然改變了水牛各時(shí)期胚胎的ΔΨm，但未改變胚胎發(fā)育過(guò)程中ΔΨm的總體變化趨勢(shì)。綜上所述，卵母細(xì)胞線粒體移植可以一定程度上提高水牛卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。

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(編輯 程金華)

Effects of Mitochondrial Transplant on the Developmental Potential of Buffalo Oocytes

GAO Ya-ke，LU Feng-hua，WU Zhu-lian，MA Fan，LIU Xiao-hua，DU Shan-shan，SHI De-shun*

(StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofSubtropicalAgro-bioresources，GuangxiUniversity，Nanning530005，China)

The aim of present study was to investigate the effects of mitochondrial transplant (MIT) on the developmental potential of buffalo oocytes.The mitochondrial DNA (mtDNA) copy number in the oocyte，and the developmental competence，exogenous mitochondria distribution，as well as mitochondrial membrane potential (ΔΨm) in the preimplantation embryos after the MIT were examined.The result showed that the average mtDNA copy number of buffalo oocytes in the first level of oocytes was evidently higher than the second and the third level of oocytes ((202 101±74 432)vs(118 483±17 028)，(39 177±7 938)，P<0.01)，and the average mtDNA copy number in the second level of oocytes was significantly higher than that of the third level of oocytes ((118 483±17 028)vs(39 177±7 938)，P<0.01).Furthermore，the cleavage rates and blastocyst rates of the first level of oocytes were significantly higher than those of the second and the third level of oocytes after parthenogenetic activation (P<0.01)，and the cleavage rates and blastocyst rates of the second level of oocytes were remarkably higher than those of the third level of oocytes (P<0.01).The exogenetic mitochondria labeled with Mito-Tracker fluorescent probe distributed into each of blastomeres with the embryonic development after MIT.Moreover，more the second level of oocytes that received MIT developed to the blastocyst stage after parthenogenetic activation in comparison with oocytes that did not received MIT or were injected with solution (27.3%vs17.4%，7.84%，P<0.05)，however，there were no significant difference in the blastocyst rates of the third level of oocytes than the control group and the nothing injection group after MIT.The ΔΨm of buffalo preimplantation embryo presented an increased trend during embryonic development，and the ΔΨm of embryo derived from MIT group was significantly higher than that of the control group (P<0.05).These results showed that the mtDNA copy numbers in different quality buffalo oocytes have significant differences，and the mtDNA copy numbers of buffalo oocytes are positively related with the quality of oocytes and their developmental potential，and the developmental ability of the second level of oocytes can be improve by MIT.

mitochondrial transplantation；mtDNA copy number；mitochondrial membrane potential；buffalo；follicular granulosa cell

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.011

2014-10-30

國(guó)家“863”項(xiàng)目(2011AA100607)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)博導(dǎo)基金項(xiàng)目(20114501110001)；教育部回國(guó)基金項(xiàng)目(AC150070)；廣西科學(xué)基金項(xiàng)目(2012GXNSFFA060004)；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目(T3340098603)

高亞可(1987-)，男，河南許昌人，碩士生，主要從事動(dòng)物胚胎工程研究，E-mail：gaoyake_2008@163.com

*通信作者：石德順，博導(dǎo)，研究員，主要從事動(dòng)物胚胎工程與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究，E-mail：ardsshi@gxu.edu.cn

S823.8+3；S814

A

0366-6964(2015)04-0583-09