柔嫩艾美耳球蟲5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶基因的克隆、原核表達及酶活性分析

廖申權(quán)，吳彩艷，戚南山，李 娟，呂敏娜，張健騑，謝明權(quán)，孫銘飛

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣州 510640)

柔嫩艾美耳球蟲5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶基因的克隆、原核表達及酶活性分析

廖申權(quán)，吳彩艷，戚南山，李 娟，呂敏娜，張健騑，謝明權(quán)，孫銘飛*

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣州 510640)

旨在克隆柔嫩艾美耳球蟲5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶(EtDXR)基因，初步分析EtDXR的酶活性。根據(jù)EuPathDB數(shù)據(jù)庫信息注釋、拼接Etdxr基因序列，設計特異性引物擴增Etdxr基因，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pCold I-EtDXR，轉(zhuǎn)化E.coliRosetta(DE3)，IPTG誘導表達，進行SDS-PAGE及Western blot分析，純化rEtDXR，對rEtDXR進行酶活性分析，測定pH和Mg2+離子濃度對酶活性的影響。結(jié)果顯示，Etdxr基因完整編碼序列為1 746 bp，氨基酸序列具有與其他物種高度保守的酶活性中心；成功構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pCold I-EtDXR，SDS-PAGE以及Western blot分析顯示，得到約50 ku的蛋白質(zhì)；利用直接檢測底物NADPH 消耗速率的方法分析EtDXR酶活性，結(jié)果顯示，不同pH和離子濃度對EtDXR的酶活性有顯著影響，其最佳的酶反應條件為pH 7.0，Mg2+離子濃度4.5 mmol·L-1。本研究為進一步以EtDXR為藥靶篩選抗球蟲先導化合物奠定了基礎。

柔嫩艾美耳球蟲；5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶；克??；原核表達；酶活性

柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)是一種細胞內(nèi)寄生的頂復門原蟲，它引起的雞球蟲病對養(yǎng)禽業(yè)危害極大。雞球蟲病傳統(tǒng)的控制策略依賴于抗球蟲藥物的應用，但隨著球蟲耐藥性的產(chǎn)生與持續(xù)增加，使得藥物防治雞球蟲病舉步維艱，新的抗球蟲藥物的研制已成為生產(chǎn)實際的迫切需求。

頂質(zhì)體(apicoplast)是頂復門原蟲特有的細胞器，類似植物葉綠體樣質(zhì)體。寄生原蟲的頂質(zhì)體內(nèi)存在一些特殊且必需的代謝途徑，參與寄生原蟲脂肪酸、血紅素及類異戊二烯的生物合成，對寄生原蟲的生存、發(fā)育起著十分重要的作用[1]。這類特殊代謝途徑及其關鍵酶為抗寄生蟲藥物的研發(fā)提供了潛在藥靶。5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR)是類異戊二烯合成途徑關鍵酶，已成為抗寄生原蟲藥物研發(fā)的關鍵靶標[2]。以DXR為靶標篩選的抑制劑膦胺霉素成功用于抗惡性瘧原蟲的臨床試驗[3]。本研究對柔嫩艾美耳球蟲5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶進行基因克隆、原核表達、分離純化，并初步對rEtDXR的酶活性進行分析，為深入研究EtDXR的生物學特性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌株、質(zhì)粒和主要試劑

E.tenella(GD株)、E.coliDH5α、E.coliRosetta(DE3)由廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所寄生生物室保存；pMD18-T 載體購自寶生物(大連)有限公司；pCold I表達載體由南京農(nóng)業(yè)大學茅翔教授饋贈。LATaqDNA 聚合酶、DNA Marker、BamHⅠ、HindⅢ、RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司；TRIzol 購自Invitrogen公司；E.Z.N.A質(zhì)粒小量制備試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自Omega公司；Ni-NTA Resin 購自Novagen公司；1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate，DXP)，輔酶NADPH購自Sigma公司。

1.2 基因注釋

利用EuPathDB數(shù)據(jù)庫(http://eupathdb.org)信息，查找寄生原蟲，惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)、剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)、牛巴貝斯蟲(Babesiabovis)、環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulata)等類異戊二烯合成途徑關鍵酶DXR的基因序列。利用在線多重比對工具ClustaW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)分析頂復門原蟲dxr的保守序列；利用保守的氨基酸序列作為種子序列，搜索柔嫩艾美耳球蟲基因組數(shù)據(jù)庫(http://toxodb.org/toxo/)，注釋、拼接Etdxr的基因序列。分析發(fā)現(xiàn)ETH_00017440、ETH_0003428含有dxr的保守序列，注釋、拼接Etdxr基因序列。

1.3 裂殖子純化及總RNA的提取

裂殖子的純化參照謝氏方法[4]進行。以1×105個孢子化卵囊·只-1經(jīng)口感染14日齡無球蟲感染健康雞，感染后112 h剖殺試驗雞，取盲腸純化第二代裂殖子。應用Trizol法提取E.tenella第二代裂殖子總RNA，以該RNA為模板，用一步法RT-PCR試劑盒進行擴增。

1.4Etdxr基因的擴增

根據(jù)注釋序列設計特異性擴增引物：上游引物，EtdxrF：5′-CGCGGATCCATGAGGCGGCGGTGGTTTGTC-3′ (含BamHⅠ酶切位點)；下游引物EtdxrR：5′-CGCAAGCTTTCAGGGGCCCCCTTC-CCCC-3′ (含Hind Ⅲ酶切位點)。RT-PCR擴增目的基因Etdxr，回收目的片段PCR產(chǎn)物，連接T載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、鑒定，送陽性克隆測序。

1.5Etdxr基因序列分析

利用在線分析工具ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)，將EtDXR與其他物種DXR氨基酸序列進行多重比對分析，分析預測轉(zhuǎn)導序列及酶活性位點。

1.6 密碼子優(yōu)化

利用http://gcua.schoedl.de/index分析，選用E.coli偏好性密碼子，對EtDXR 141-224位(即成熟蛋白質(zhì)1—84位)氨基酸密碼子進行優(yōu)化，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司全基因合成，并運用重疊延伸PCR方法重疊合成改造后的基因，與T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，篩選陽性克隆進行測序驗證。

1.7 表達載體構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pMD18T-Etdxr和載體pCold I，切膠回收后經(jīng)T4 DNA Ligase連接，構(gòu)建pCold I-Etdxr表達載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，篩選陽性克隆進行測序驗證。

1.8 重組質(zhì)粒在E.Coli中的表達及純化

將測序正確的pCold I-Etdxr轉(zhuǎn)入E.ColiRosetta (DE3)，篩選陽性單克隆在10 mL LB(含Amp)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h，按1∶100擴大培養(yǎng)于LB(含Amp)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600 nm為0.4～0.6時，0.5 mmol·L-1IPTG，22 ℃過夜誘導表達，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物，以Ni-NTA Resin純化目的蛋白質(zhì)，具體參照M.Sun等的方法[5]。

1.9 重組蛋白質(zhì)的Western blot檢測

參照《分子克隆實驗指南》的方法進行。將純化的重組蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE分析，再將SDS-PAGE中的蛋白質(zhì)以電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至NC膜上，以封閉液(PBST + 5% BSA)封閉2 h，與鼠抗His-tag抗體室溫反應2 h，以PBST 洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗(1∶5 000)，室溫反應2 h，洗膜3次，以HPR/DAB顯色試劑盒避光顯色。

1.10 重組EtDXR酶活性的測定

EtDXR催化DXP轉(zhuǎn)化為2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP)。DXR 的催化活性需要NADPH作為輔酶及二價金屬離子(Mg2+、Mn2+或 Co2+)作為輔離子。本研究采用直接檢測底物消耗速率的方法，以Varioskan Flash 全波長掃描式多功能讀數(shù)儀在激發(fā)波長340 nm和發(fā)射波長460 nm測定的相對熒光值(RFU)檢測NADPH降解速率，測定該酶的酶活性[6]。反應體系：100 mmol·L-1MOPS、4.5 mmol·L-1MgCl2、0.3 mmol·L-1DXP、0.15 mmol·L-1NADPH、10 μg·mL-1EtDXR，反應溶液于30 ℃孵育5 min，加入EtDXR開始反應。

為分析pH和Mg2+離子濃度對EtDXR酶活性的影響，本研究采用響應曲面法(response surface methodology，RSM)確定酶最適反應條件，以SAS/Statistic分析酶的最佳反應條件。試驗設pH和離子濃度2個因素，具體反應設計見表1。

表1 影響因素的試驗設計

Table 1 Range of factors used in the experimental design

影響因素Factor試驗因素的水平Leveloffactor-1.41-1011.41pH4.175799.83I/(mmol·L-1)014.589.45

2 結(jié) 果

2.1Etdxr基因的注釋與PCR擴增

利用EuPathDB數(shù)據(jù)庫信息，進行生物信息學分析，注釋、拼接Etdxr完整編碼序列1 746 bp。以TRIzol方法提取第二代裂殖子總RNA，根據(jù)預測基因片段設計的特異性引物，以第二代裂殖體總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，在1 800 bp處有目的條帶，與預期片段大小一致(圖1)；將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，篩選陽性克隆送測序，測序結(jié)果顯示所擴增目的片段大小為1 746 bp。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1、2.RT-PCR擴增產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker；1，2.RT-PCR products of Etdxr圖1 Etdxr基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 RT-PCR amplification of Etdxr gene

2.2Etdxr基因序列分析

利用在線分析工具ClustalW將EtDXR與其他物種DXR氨基酸序列進行多重比對分析，結(jié)果顯示，頂復門原蟲均具有保守的酶活性位點，如圖2。經(jīng)比對分析，推測E.tenelladxr存在轉(zhuǎn)導肽序列(1—140位氨基酸)，與頂復門的T.gondii、P.falciparumdxr基因類似，存在轉(zhuǎn)導肽序列，其蛋白質(zhì)在細胞質(zhì)中合成后經(jīng)轉(zhuǎn)運靶向蟲體的頂質(zhì)體。

2.3 密碼子優(yōu)化基因的原核表達與鑒定

利用重疊延伸PCR方法重疊全基因合成的EtDXR(141—224)及EtDXR(225-581)，構(gòu)建pCold I-EtDXR表達質(zhì)粒，經(jīng)測序分析正確后，將pCold I-EtDXR轉(zhuǎn)化E.ColiRosetta (DE3)，鑒定為陽性的E.coliRosetta (DE3) (pCold I-EtDXR)以0.5 mmol·L-1IPTG，22 ℃低溫誘導表達，收集菌體，重組表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析，見圖3A。以PBS重懸菌體，冰浴超聲破碎，離心取上清過親和層析柱，梯度洗脫，250 mmol·L-1咪唑洗滌，獲得較純的His-EtDXR融合蛋白質(zhì)，約50 ku(圖3B)。將純化后的融合蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE分析，切膠轉(zhuǎn)膜至NC膜上，封閉液封閉2 h，鼠抗His標簽一抗孵育2 h，HRP標記羊抗鼠二抗孵育2 h，顯色，Western blot結(jié)果顯示純化獲得目的蛋白質(zhì)，見圖3C。

下劃線標記為保守的酶活性位點Conserved domains are highlighted in underline圖2 E.tenella DXR與其他物種DXR的多重比對結(jié)果Fig.2 Alignment of the amino acid sequences of E.tenella DXR with other DXR sequences

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；A1.誘導的pCold I-EtDXR/ Rosetta (DE3)；A2.未誘導的pCold I-EtDXR/ Rosetta (DE3)；B1.純化的His-EtDXR；C1.純化的His-EtDXRM.Protein marker；A1.Induced pCold I-EtDXR/ Rosetta (DE3)；A2.Non-induced pCold I-EtDXR/ Rosetta (DE3)；B1.Purified His-EtDXR；C1.Purified His-EtDXR圖3 重組蛋白質(zhì)的表達及分析Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant EtDXR

2.4 重組EtDXR的酶活性分析

利用生物化學的方法對重組EtDXR進行了酶活性測定，分析了pH和Mg2+離子濃度對其酶活性的影響。結(jié)果顯示，重組EtDXR可以利用底物1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸與NADPH，具有5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶的催化活性。響應曲面法分析結(jié)果顯示，不同pH和離子濃度對大腸桿菌表達EtDXR的酶活性有顯著影響，其酶動力學反應的最佳條件為pH 7.0，Mg2+離子濃度4.5 mmol·L-1，見圖4。

圖4 離子濃度及pH對EtDXR酶活性的影響Fig.4 Effects of ion concentration and reaction pH on enzymatic activity

3 討 論

類異戊二烯及其衍生物構(gòu)成自然界極為多樣性的化合物，這些化合物是泛醌、多萜醇的前體。類異戊二烯的衍生物泛醌參與電子傳遞，長醇參與蛋白的糖基化，蛋白的法尼基化和牻牛兒基化對原蟲的生存是必需的[7]。早期研究認為類異戊二烯通過甲羥戊酸途徑(the mevalonic acid pathway，MVA)合成。直至1993年，報道真細菌利用甲基赤藻糖醇途徑(the methylerythritol pathway，MEP)合成類異戊二烯。研究顯示，頂復門原蟲(如Plasmodiumspp.、Trypanosomaspp.、T.gondii、Eimeriaspp.及Babesiaspp.)等[8-9]僅利用MEP途徑合成類異戊二烯；而宿主則利用MVA途徑合成類異戊二烯，MEP途徑的關鍵酶已成為備受關注的藥物靶標。5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶(DXR)是MEP途徑的關鍵酶，催化1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)化為2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)。由于1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸可以合成硫胺素焦磷酸和磷酸吡哆醇，因此，MEP是類異戊二烯生物合成途徑中真正意義上的關鍵中間體，DXR催化的反應是MEP生物合成途徑“碳流”的分支點，也是進行調(diào)控的有效靶點，成為研究抗感染性藥物的重要靶標[10-11]。

目前仍未見柔嫩艾美耳球蟲dxr基因序列及功能研究的報道，本研究利用生物信息學預測并注釋Etdxr基因，克隆獲得Etdxr完整編碼序列。結(jié)果顯示，擴增的序列與預測序列完全一致；不同物種間多重比對發(fā)現(xiàn)，EtDXR與其他物種DXR存在相同的酶活性位點；T.gondii、P.falciparum及E.tenellaDXR都存在轉(zhuǎn)導肽序列，蛋白質(zhì)在細胞質(zhì)中合成后經(jīng)轉(zhuǎn)運靶向頂質(zhì)體，在頂質(zhì)體內(nèi)發(fā)揮生物學功能。

在前期試驗過程中，嘗試將未優(yōu)化的Etdxr更換不同的原核表達載體及優(yōu)化原核表達條件，均未發(fā)現(xiàn)Etdxr在大腸桿菌中的表達。Etdxr序列的GC含量非常高，達到67.87%，可能導致Etdxr在大腸桿菌中難以表達。研究表明，影響外源基因表達效率的主要因素為密碼子選用、mRNA穩(wěn)定性、翻譯起始效率和載體選擇等。其中密碼子偏愛性極大地影響外源蛋白質(zhì)的表達量，研究表明按照宿主細胞的偏愛性將目的基因編碼區(qū)全部進行優(yōu)化，將使表達量提高10～50倍，即使僅將5′端編碼區(qū)進行改造或者改變其中的稀有密碼子，也可大幅度提高蛋白質(zhì)的表達量[12]。本研究采用優(yōu)化5′端編碼區(qū)的方法，優(yōu)化成熟蛋白質(zhì)的前84個氨基酸，優(yōu)化后Etdxr序列GC含量為58.81%。試驗證實優(yōu)化后的序列在大腸桿菌中能有效表達，經(jīng)純化、鑒定，獲得可溶性目的蛋白質(zhì)。

對EtDXR的生化分析顯示，原核表達的EtDXR具有酶活性。利用響應曲面法分析發(fā)現(xiàn)，EtDXR的酶活性受pH和Mg2+離子濃度的影響，其酶動力學反應的最佳條件為pH 7.0，Mg2+離子濃度4.5 mmol·L-1，與J.Cheleski等[13]的報道相似?；趯Υ竽c桿菌、結(jié)核分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌等重要致病菌DXR結(jié)構(gòu)信息學的解析，已經(jīng)篩選出具有抗菌活性的先導化合物[14-15]，為頂復門原蟲DXR抑制劑的設計及篩選提供了試驗依據(jù)。本研究初步分析了柔嫩艾美耳球蟲5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶的酶活性，并篩選到最佳酶反應條件，為進一步以EtDXR為藥靶篩選抗球蟲先導化合物奠定基礎。

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(編輯 白永平)

Cloning，Prokaryotic Expression and Enzymatic Activity of 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate Reductoisomerase ofE.tenella

LIAO Shen-quan，WU Cai-yan，QI Nan-shan，LI Juan，Lü Min-na，ZHANG Jian-fei，XIE Ming-quan，SUN Ming-fei*

(GuangdongLaboratoryforAnimalDiseases,GuangdongOpenLaboratoryofVeterinaryPublicHealth,InstituteofAnimalHealth，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences，Guangzhou510640，China)

The aim of this study was to clone 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR) gene inEimeriatenella，and analyze its enzymatic activity.The predicted sequences ofEtdxrwere obtained from EuPathDB by bioinformatics analysis.The full-length cDNA was amplified by PCR and then cloned into pCold I vector.The recombinant plasmid was transformed intoE.coliRosetta (DE3) and induced by IPTG.The expression products were analyzed by SDS-PAGE and Western blot，and then were purified.We further evaluated the enzymatic activity of EtDXR by monitoring the consumption of NADPH.The results showed that the open reading frame ofE.tenellaDXR was 1 746 bp.Further analysis of the amino acid sequence revealed that EtDXR contains the conserved domains with other DXRs.The results showed that the recombinant vector pCold I-EtDXR was constructed successfully.The SDS-PAGE and Western blot results showed that the purified protein was 50 kDa.The characterizations of reaction conditions used in the experiments，such as pH and ion concentration have significant effects on the enzymatic activity of rEtDXR.According to the response surface plots，the maximum enzymatic activity was pH 7.0 and 4.5 mmol·L-1Mg2+.This study provides a foundation for the further study to select inhibitors ofE.tenellaDXR.

Eimeriatenella；1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase；cloning；prokaryotic expression；enzymatic activity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.017

2014-07-28

國家自然科學基金項目 (31201902；31302087；31402186)；廣州市珠江科技新星項目(2012J2200059)；廣東省自然科學基金項目(S2013040015220)；廣東省科技計劃項目(2011B050700007)；廣州市科技計劃項目(2014J4100230)；廣東省農(nóng)業(yè)科學院院長基金(201413)

廖申權(quán)(1981-)，女，重慶榮昌人，博士，主要從事雞球蟲生化代謝研究，E-mail：lsq6969@163.com

*通信作者：孫銘飛，副研究員，E-mail：smf7810@126.com

S852.723

A

0366-6964(2015)04-0631-06