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    對(duì)利福平與異煙肼多個(gè)基因耐藥初治結(jié)核病1例報(bào)告

    2015-03-21 06:07:32秦萬(wàn)歐維正蒙俊羅志穎駱科文王燕
    貴州醫(yī)藥 2015年12期
    關(guān)鍵詞:突變型基因芯片異煙肼

    秦萬(wàn) 歐維正 蒙俊 羅志穎 駱科文 王燕

    (貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心檢驗(yàn)科,貴州貴陽(yáng)550006)

    結(jié)核耐藥機(jī)制十分復(fù)雜,包括結(jié)核菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與組成變化、結(jié)核菌自身的藥物外排泵系統(tǒng)、結(jié)構(gòu)藥物靶編碼基因發(fā)生突變[1]。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展,對(duì)藥物基因檢測(cè)試驗(yàn)不斷進(jìn)步,藥敏檢測(cè)的時(shí)間大大縮短,而且還可精確到某個(gè)基因。我院首次發(fā)現(xiàn)1例初治結(jié)核患者對(duì)利福平(RFP)與異煙肼(INH)的3個(gè)耐藥相關(guān)基因rpoB基因、katG基因及inhA基因都有耐藥性。現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 患者,男,42歲,無(wú)業(yè)。既往史,10年前因“膽結(jié)石”行“膽囊切除術(shù)”(具體不詳),個(gè)人史,生長(zhǎng)于原籍,否認(rèn)疫區(qū)久居史,吸煙20+年,每天20支,飲酒20+年,2~3次/周,每次500g左右。于2014年11月10日門(mén)診入院,2014年11月13日出院,住院號(hào),1408258;入院前治療情況,2014年4月予抗癆治療至今。但治療情況較差,患者仍有咳嗽、嘔血、體質(zhì)量減輕等臨床癥狀。入院后檢查項(xiàng)目及結(jié)果:胸部CT示雙肺彌漫條射、斑點(diǎn)影、右上葉多發(fā)不規(guī)則空洞影、大部分病灶邊緣清晰、右上葉部分支氣管狹窄閉塞、肺門(mén)縱膈未見(jiàn)腫大淋巴結(jié)、右側(cè)局部胸膜反應(yīng)增厚、雙側(cè)未見(jiàn)胸腔積液。痰抗酸染色示陽(yáng)性;痰分支桿菌核酸檢測(cè)示陽(yáng)性;基因芯片法藥敏試驗(yàn)示RFP與INH均耐藥;比例法藥敏提示利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素均耐藥,氧氟沙星與卡拉霉素敏感。血常規(guī),中性粒細(xì)胞百分比79.60偏高,余正常;血?dú)?、電解質(zhì)、肝功能未見(jiàn)異常;血沉:63mm/h偏高;尿常規(guī):尿糖+1,余正常;血糖15.40mmol/L。入院診斷:繼發(fā)性肺結(jié)核,初治多重耐藥結(jié)核(MDR-TB)。

    1.2 檢測(cè)方法 PCR-熒光探針?lè)ㄌ崛『怂幔换蛐酒z測(cè)耐藥基因,檢測(cè)指標(biāo)包括RFP及INH的3個(gè)耐藥相關(guān)基因rpoB基因、katG基因及inhA基因啟動(dòng)子的野生型及不同突變型。其中RFP耐藥相關(guān)基因rpoB基因檢測(cè)6個(gè)位點(diǎn),包括531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG等13種突變型,對(duì)于INH耐藥相關(guān)基因katG基因及inhA基因啟動(dòng)子各檢測(cè)1個(gè)位點(diǎn),分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC兩個(gè)突變型,inhA基因啟動(dòng)子-15位C→T突變型;液化液10%NaOH由實(shí)驗(yàn)室自行配制;核酸提取洗滌液用無(wú)菌生理鹽水或PCR-熒光探針?lè)z測(cè)試劑盒配裝;芯片洗滌液按DNA基因芯片試劑盒配裝要求自行配制。儀器:95℃K30干式恒溫器(恒溫金屬浴)由上海之信儀器有限公司提供;ExtractorTM36核酸快速提取儀由博奧生物有限公司提供;ABI 7300PCR儀由ABI公司提供;TC-96/G/H(b)生命快車(chē)基因擴(kuò)增儀、BioMixerTMⅡ芯片雜交儀、SlideWasherTM8芯片洗干儀、LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀均由博奧生物有限公司提供。質(zhì)量控制:本試劑盒陽(yáng)性對(duì)照品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為“rpoB野生型”、“katG野生型”及“inhA野生型”;陰性對(duì)照品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為“無(wú)結(jié)核分枝桿菌”。如果其中任何一個(gè)對(duì)照品結(jié)果錯(cuò)誤,則同一次實(shí)驗(yàn)全部樣品結(jié)果定為無(wú)效,需要進(jìn)行復(fù)檢。

    2 結(jié) 果

    RFP:rpoB 511(T-C)突變型,rpoB 516(A-G)突變型被檢者標(biāo)本發(fā)現(xiàn)與利福平耐藥相關(guān)的基因突變,該菌株對(duì)利福平耐藥。INH:katG 315(G-C)突變型,inhA-15(C-T)突變型被檢者標(biāo)本發(fā)現(xiàn)與異煙肼耐藥相關(guān)的基因突變,該菌株對(duì)異煙肼耐藥。

    3 討 論

    結(jié)核病疫情惡化的原因之一是MDR-TB的出現(xiàn)和流行[2]。自從我院PCR實(shí)驗(yàn)室建立兩年多來(lái)對(duì)RFP與INH3個(gè)耐藥相關(guān)基因rpoB基因、katG基因及inhA基因的耐藥檢測(cè)以來(lái),對(duì)rpoB基因、katG基因耐藥的比較常見(jiàn),而對(duì)inhA基因耐藥的比較少見(jiàn)。除此之外,對(duì)rpoB基因耐藥的一般都是以某一個(gè)基因點(diǎn)耐藥比較多見(jiàn),而對(duì)兩個(gè)以上基因點(diǎn)都耐藥的并不多見(jiàn),而同時(shí)對(duì)3個(gè)耐藥相關(guān)基因都耐藥的又極少見(jiàn)。故對(duì)該病例進(jìn)行詳細(xì)討論。在實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐中,RFP rpoB基因的耐藥率比較高,這可能是與突變的相對(duì)集中,探針設(shè)計(jì)的合理有關(guān),INH katG基因及inhA基因耐藥檢出率較低些,未檢出的樣品可能是由于它的突變類(lèi)型在本檢測(cè)膜芯片設(shè)計(jì)的探針之外,或者產(chǎn)生耐藥的突變基因不是katG基因和inhA基因。從以上該患者的臨床資料可知,該患者每天吸煙和每周飲酒的量都特別大,而且時(shí)間也比較長(zhǎng),因此這些都有可能與他初治的結(jié)核藥產(chǎn)生耐藥有關(guān)。因?yàn)殚L(zhǎng)期過(guò)量飲酒或吸煙都有可能會(huì)改變自身免疫性下降,以致耐藥性的產(chǎn)生。而從檢測(cè)的結(jié)果還可看出,該患者對(duì)RFPrpoB基因耐藥有兩個(gè)基因點(diǎn);對(duì)INHkatG基因及inhA基因都耐藥,即對(duì)RFP與INH有多個(gè)耐藥基因產(chǎn)生。此外,由于基因芯片法試劑盒本身的局限性,即其檢測(cè)的基因位點(diǎn)僅用于RFP與INH耐藥性的定性檢測(cè),同時(shí)還有未完全包括結(jié)核分支桿菌耐藥基因突變位點(diǎn),故此患者對(duì)RFP與INH的耐藥點(diǎn)是否還有其他的耐藥基因點(diǎn),還有待此技術(shù)的不斷提高和完善來(lái)證明。從以上臨床資料還可知該患者除了對(duì)RFP與INH耐藥外,還對(duì)鏈霉素和乙胺丁醇都有耐藥,故之前予以HRZE抗癆治療效果依然欠佳,該患者是一個(gè)典型的初治耐多藥結(jié)核者。也許還對(duì)其他抗癆藥耐藥,由于我院條件限制,其他抗結(jié)核藥還未開(kāi)展。因此,應(yīng)用基因芯片快速檢出rpoB基因、katG基因及inhA基因突變可以作為耐多藥結(jié)核病的診斷指標(biāo)[3]。在此筆者建議初治的結(jié)核患者如果一旦確診為結(jié)核,就應(yīng)該到專(zhuān)科的結(jié)核病醫(yī)院就診,快速的檢測(cè)其耐藥篩選情況,盡早制定出科學(xué)有效的治療方案,以便得到規(guī)范的治療和病情的控制。

    [1] 閆雪梅,張朝霞.結(jié)核分支桿菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,2(35):249.

    [2] 歐維正,駱科文,王燕,等.基因芯片和比例法藥敏性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分支桿菌對(duì)利福平和異煙肼耐藥性的比較研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,5(28):406.

    [3] 張俊仙,吳雪瓊,陽(yáng)幼榮,等.應(yīng)用基因芯片方法檢測(cè)結(jié)核分支桿菌利福平和異煙肼的耐藥性[J].中國(guó)防癆雜志,2011,33(10):684.

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