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    生物催化2-羥基-4-甲硫基丁腈制備羥基蛋氨酸菌株的篩選及轉(zhuǎn)化過(guò)程的研究

    2015-03-20 01:35:19李宗通金利群
    發(fā)酵科技通訊 2015年2期
    關(guān)鍵詞:硫基水解酶蛋氨酸

    李宗通,金利群

    (浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所,浙江杭州 310014)

    生物催化2-羥基-4-甲硫基丁腈制備羥基蛋氨酸菌株的篩選及轉(zhuǎn)化過(guò)程的研究

    李宗通,金利群

    (浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所,浙江杭州 310014)

    篩選得到一株產(chǎn)腈水解酶的基因工程菌株(ZJB12048),在優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件下(反應(yīng)溫度50°C,反應(yīng)體系pH值7.0(100 mmol/L檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖溶液),濕菌體濃度為0.02 g/ mL,底物濃度為150 mmol/L),其靜息細(xì)胞對(duì)2-羥基-4-甲硫基丁腈具有較高的催化活力。高效液相色譜(HPLC)、液相-質(zhì)譜(LC-MS)和核磁共振(NMR)分析結(jié)果表明,反應(yīng)液中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為羥基蛋氨酸(2-羥基-4-甲硫基丁酸)。

    篩選;2-羥基-4-甲硫基丁腈;腈水解酶;2-羥基-4-甲硫基丁酸;鑒定

    羥基蛋氨酸化學(xué)名為2-羥基-4-甲硫基丁酸(2-hydroxy-4-(methylthiol)butanoic acid,HMB),又稱(chēng)為蛋氨酸羥基類(lèi)似物,是一種蛋氨酸的類(lèi)似物替代品。蛋氨酸羥基類(lèi)似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式和蛋氨酸除了第二個(gè)碳原子上的基團(tuán)不同外,其他部分完全相同,即HMB上是一個(gè)羥基代替了蛋氨酸上的氨基。研究表明,在動(dòng)物體內(nèi)等量蛋氨酸與羥基蛋氨酸具有相同的生物效價(jià),此外羥基蛋氨酸還表現(xiàn)出一些特有的性質(zhì),如良好的抑菌效果,增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫及抗氧化能力,有效減緩熱應(yīng)激反應(yīng)的損害及良好的過(guò)瘤胃效果等[1-5]。因此,HMB作為一種性能優(yōu)越的蛋氨酸源被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)業(yè)。

    20世紀(jì)80年代,美國(guó)孟山都公司以化學(xué)合成蛋氨酸的過(guò)程中產(chǎn)生的中間體2-羥基-4-甲硫基丁腈為原料經(jīng)過(guò)兩步水解得到HMB[6-7]。在此之后,許多學(xué)者研究不同方法水解2-羥基-4-甲硫基丁腈制備HMB[8-9]?;瘜W(xué)合成HMB反應(yīng)條件比較嚴(yán)苛,對(duì)設(shè)備要求較高,使用大量有機(jī)溶劑且產(chǎn)生副產(chǎn)物,對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。相對(duì)而言,利用微生物產(chǎn)生的腈水解酶催化2-羥基-4-甲硫基丁腈水解制備HMB的工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、副產(chǎn)物少、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小,具有很廣闊的發(fā)展空間[10-12]。羅納-普朗克動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)素公司報(bào)道使用固定化腈水解酶作為生物催化劑催化2-羥基-4-甲硫基丁腈制備2-羥基-4-甲硫基丁酸或其銨鹽,收率高,不使用有機(jī)溶劑且不產(chǎn)生無(wú)機(jī)鹽,可實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)?;a(chǎn)[13]。

    本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的產(chǎn)腈水解酶菌株為基礎(chǔ),篩選出具有較高催化活力的腈水解酶產(chǎn)生菌,用于催化水解2-羥基-4-甲硫基丁腈制備HMB,并對(duì)其轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了研究,為生物催化制備羥基蛋氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 試劑

    羥基蛋氨酸標(biāo)樣購(gòu)自百靈威科技;2-羥基-4-甲硫基丁腈由實(shí)驗(yàn)室合成;其他試劑均為市售分析純。

    1.1.2 菌種

    腈水解酶產(chǎn)生菌從實(shí)驗(yàn)室保藏的野生型菌株及構(gòu)建的一系列重組菌中篩選。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    野生型菌株:

    1)種子/發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10.0,谷氨酸鈉10.0,酵母粉3.0,己內(nèi)酰胺1.0,KH2PO40.75,K2HPO4·3H2O 0.75,MgSO4·7H2O 0.5,pH 7.0,115°C下滅菌30 min。

    2)斜面/平板培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5.0,蛋白胨10.0,NaCl 5.0,pH 7.0,115°C下滅菌30 min。

    基因工程菌株:

    1)Luria-Bertani培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl,pH 7.0,121°C下滅菌20 min。

    2)斜面/平板培養(yǎng)基是在液體Luria-Bertani培養(yǎng)基中加入1.5%~2.0%的瓊脂。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 菌種的培養(yǎng)

    野生菌的培養(yǎng):從斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)菌體接入50 mL的LB液體培養(yǎng)基中,置于30°C、150 r/min條件下培養(yǎng)20 h作為種子液,按2%接種量接種至新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30°C、150 r/ min條件下培養(yǎng)48 h,9000 r/min下離心10 min收集菌體,用生理鹽水清洗兩次,冷凍保藏備用。

    工程菌的培養(yǎng):將工程菌接種至50 mL含50 μg/mL卡那霉素(Kan)的LB液體培養(yǎng)基中,37°C、150 r/min條件下培養(yǎng)10~12 h,2%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮LB液體培養(yǎng)基中,37°C、150 r/min條件下培養(yǎng)至菌體濃度OD600約為0.6~0.8,加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG,28°C、150 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h。誘導(dǎo)結(jié)束后9000 r/min下離心10 min收集菌體,用生理鹽水清洗兩次,冷凍保藏備用。

    1.2.2 菌株轉(zhuǎn)化活力的測(cè)定

    靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化:取濕重為0.1 g野生菌或工程菌的菌體,用10 mL純水重懸菌體,置于轉(zhuǎn)化瓶中,加入終濃度為10 mmol/L的2-羥基-4-甲硫基丁腈,40°C、180 r/min條件下反應(yīng),定時(shí)取樣,加HCl終止反應(yīng),離心去除沉淀,檢測(cè)上清中產(chǎn)物濃度。

    1.2.3 羥基蛋氨酸的定量分析方法

    羥基蛋氨酸的定量分析采用HPLC檢測(cè)法。HPLC分析檢測(cè)條件:C18高效液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,J&K Scientific Ltd.),流動(dòng)相采用20∶80∶0.05的乙腈∶水∶三氟乙酸(TFA),流速為1.0 mL/min,柱溫設(shè)置為40°C,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm,進(jìn)樣量為20 μL。進(jìn)樣前使用0.22 μm微孔濾膜對(duì)樣品溶液進(jìn)行除雜處理。

    1.2.4 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

    在菌株篩選過(guò)程中,轉(zhuǎn)化條件為:反應(yīng)溫度40°C,純水反應(yīng)體系,0.01 g/mL的菌體添加量,底物濃度為10 mmol/L。在原有轉(zhuǎn)化條件的基礎(chǔ)上,采用單因素試驗(yàn)分別對(duì)反應(yīng)溫度、pH值、反應(yīng)體系溶劑、菌體添加量及底物濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。

    2 結(jié)果

    2.1 產(chǎn)腈水解酶菌株篩選

    從實(shí)驗(yàn)室保藏的可以產(chǎn)腈水解酶的119株野生型菌株及30株基因工程菌株中,篩選能將2-羥基-4-甲硫基丁腈轉(zhuǎn)化為2-羥基-4-甲硫基丁酸的菌株。根據(jù)活力測(cè)定的結(jié)果,共有21株野生型菌株和10株工程菌能夠?qū)?-羥基-4-甲硫基丁腈轉(zhuǎn)化為2-羥基-4-甲硫基丁酸(部分結(jié)果見(jiàn)表1)。其中野生型菌株與基因工程菌的催化能力差別很大,前者的催化能力基本都偏低(表1)。編號(hào)為ZJB12048的基因工程菌對(duì)2-羥基-4-甲硫基丁腈的活力最高,在40°C條件下反應(yīng)25 min轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇編號(hào)為ZJB12048的基因工程菌作為2-羥基-4-甲硫基丁腈轉(zhuǎn)化為2-羥基-4-甲硫基丁酸的生物催化劑。

    表1 產(chǎn)腈水解酶菌株的篩選

    2.2 靜息細(xì)胞催化條件的優(yōu)化

    2.2.1 反應(yīng)溫度對(duì)催化反應(yīng)的影響

    考察了反應(yīng)溫度對(duì)水解反應(yīng)的影響,將反應(yīng)體系置于不同溫度(35~80°C)中保溫10 min后,加入20 mmol/L底物(2-羥基-4-甲硫基丁腈)進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)3 min取樣終止反應(yīng),測(cè)定反應(yīng)初速率,結(jié)果見(jiàn)圖1(a)。在溫度范圍為35~65°C時(shí),隨著溫度的升高,反應(yīng)的初始速率也逐漸升高;當(dāng)溫度高于65°C時(shí),反應(yīng)初始速率隨著溫度的升高急劇下降,酶活力出現(xiàn)明顯的損失,酶分子開(kāi)始明顯的變性。

    同時(shí)實(shí)驗(yàn)考察了該腈水解酶的熱穩(wěn)定性,結(jié)果見(jiàn)圖1(b)。根據(jù)熱穩(wěn)定性計(jì)算出在50、55、60、65和70°C條件下的失活常數(shù)分別為-0.01544、-0.03696、-0.04456、-0.12070和-0.31616,并計(jì)算出各溫度下相對(duì)應(yīng)的半衰期分別為44.9、18.8、15.2、5.7和2.2 h。綜合考慮溫度對(duì)催化反應(yīng)的影響和腈水解酶熱穩(wěn)定性的結(jié)果,選擇50°C作為后續(xù)試驗(yàn)的反應(yīng)溫度。

    圖1 溫度對(duì)催化反應(yīng)的影響(a)與腈水解酶的熱穩(wěn)定性(b)

    2.2.2 反應(yīng)體系pH值對(duì)催化反應(yīng)的影響

    50°C條件下,在三種不同緩沖溶液中考察了不同pH值對(duì)反應(yīng)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。在近中性反應(yīng)條件下,催化反應(yīng)具有較好的反應(yīng)速率;在偏酸性(<6)或偏堿性(>8)環(huán)境中,催化活力迅速下降。在檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖溶液pH 7.0時(shí),該菌株具有最好的催化效果。

    圖2 反應(yīng)pH值對(duì)催化反應(yīng)的影響

    2.2.3 靜息細(xì)胞添加量對(duì)催化反應(yīng)的影響

    微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中,反應(yīng)體系中靜息細(xì)胞的添加量會(huì)影響催化反應(yīng)的速率。由圖3結(jié)果可見(jiàn),隨著反應(yīng)體系中靜息細(xì)胞濃度的持續(xù)增加,細(xì)胞的催化反應(yīng)速率不斷增加,而相對(duì)酶活隨著靜息細(xì)胞濃度的增加而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),說(shuō)明靜息細(xì)胞不斷增加會(huì)出現(xiàn)催化劑飽和現(xiàn)象而無(wú)法參與催化反應(yīng)。綜合考慮催化效率及催化劑的有效利用,選擇20 g/L的靜息細(xì)胞濃度為最適濃度。

    圖3 靜息細(xì)胞添加量對(duì)催化反應(yīng)的影響

    2.2.4 底物濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響

    酶的活性中心會(huì)在底物達(dá)到一定濃度時(shí)趨于飽和,此時(shí)酶的催化效率最高;隨著底物濃度的不斷增加,底物會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生一定的抑制作用。此外,腈類(lèi)化合物有一定的毒性,高濃度對(duì)菌體的催化能力有一定的影響,因此對(duì)底物的添加量進(jìn)行了考察,測(cè)定反應(yīng)速率及最終反應(yīng)的產(chǎn)率,結(jié)果如圖4。當(dāng)濃度在0~150 mmol/L范圍內(nèi)時(shí),隨著底物濃度增加,催化活力不斷增強(qiáng),反應(yīng)初速率不斷增大,反應(yīng)最終的產(chǎn)率可以達(dá)到100%;而當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)150 mmol/L時(shí),催化反應(yīng)速率開(kāi)始下降,反應(yīng)的最終產(chǎn)率逐漸下降,底物不能夠完全被轉(zhuǎn)化,說(shuō)明底物對(duì)酶產(chǎn)生了抑制。

    圖4 底物濃度對(duì)反應(yīng)的影響

    2.3 反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定

    采用高效液相色譜(HPLC)分析產(chǎn)物標(biāo)樣及催化反應(yīng)產(chǎn)物,結(jié)果見(jiàn)圖5。其中,1號(hào)譜線是2-羥基-4-甲硫基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的分析結(jié)果,2號(hào)譜線為催化反應(yīng)液的色譜分析結(jié)果。1號(hào)譜線中保留時(shí)間5.233 min處的色譜峰為2-羥基-4-甲硫基丁酸色譜峰,在2號(hào)譜線的5.235 min保留時(shí)間處有較大峰面積的色譜峰。對(duì)比產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品與催化反應(yīng)液的色譜圖,可初步確定5.235 min的色譜峰是產(chǎn)物2-羥基-4-甲硫基丁酸的色譜峰。

    圖5 高效液相色譜分析圖

    利用液相-質(zhì)譜(LC-MS)分析方法對(duì)圖5中初步確定的目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行分子量的測(cè)定(圖6)。m/z=149.0是M-H峰,與羥基蛋氨酸的分子離子峰匹配。

    圖6 目標(biāo)產(chǎn)物的LC-MS分析結(jié)果

    利用核磁共振氫譜分析了目標(biāo)產(chǎn)物,結(jié)果如圖7。該產(chǎn)物的1H NMR的數(shù)據(jù)為:1H NMR(500 MHz,D2O):δ4.29(dd,J=8.1,4.1 Hz,1H),2.58-2.54(m,2H),2.06-1.98(m,4H),1.90(ddd,J= 16.7,11.1,7.0 Hz,1H)。

    綜合液相色譜、質(zhì)譜和核磁共振氫譜的分析結(jié)果,可以確定反應(yīng)液中的產(chǎn)物及萃取液中的物質(zhì)確為2-羥基-4-甲硫基丁酸。

    圖7 目標(biāo)產(chǎn)物核磁共振(1H NMR)分析譜圖

    3 結(jié)語(yǔ)

    本文篩選得到21野生型菌株和10株工程菌株能以2-羥基-4-甲硫基丁腈為底物轉(zhuǎn)化為2-羥基-4-甲硫基丁酸。其中,編號(hào)為ZJB12048的工程菌的活力最高。對(duì)反應(yīng)溫度,熱穩(wěn)定性,體系pH值,催化劑濃度等轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:反應(yīng)溫度50°C,pH值7.0,催化劑濃度0.02 g/mL,底物濃度150 mmol/L。優(yōu)化后反應(yīng)速率由534.11 μmol·min-1·g-1DCW提高為1346.06 μmol·min-1·g-1DCW,共提高2.52倍。該菌株對(duì)2-羥基-4-甲硫基丁腈具有良好的催化效果。

    利用HPLC、LC-MS和1H NMR對(duì)反應(yīng)液中的產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定,結(jié)果顯示反應(yīng)液中的產(chǎn)物確實(shí)是2-羥基-4-甲硫基丁酸。該菌株對(duì)2-羥基-4-甲硫基丁腈具有良好的催化效果。微生物催化劑不能連續(xù)重復(fù)使用,不能滿(mǎn)足實(shí)際中的應(yīng)用,但可以通過(guò)固定化和設(shè)計(jì)連續(xù)催化工藝來(lái)解決,相關(guān)工作正在進(jìn)行中。

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    (責(zé)任編輯:朱小惠)

    Screening and biotransformation optimization of a strain catalyzing 2-hydroxy-4-(methylthio) butyronitrile to methionine hydroxy analogue

    LI Zongtong,JIN Liqun
    (Institute of Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

    ZJB12048,a nitrilase-producing genetic engineering strain,was isolated.Under the optimized transformation conditions as followed,reaction temperature 50°C,initial pH value 7.0 (100 mmol/L citric acid/sodium citrate buffer solution),concentration of wet cells 0.02 g/mL and the concentration of substrates 150 mmol/L,2-hydroxy-4-(methylthio)butyronitrile were transferred into methionine hydroxy analogue by the rested cells.And the obtained product was identified as 2-hydroxy-4-(methylthio)butyric acid using HPLC,LC-MS and1H NMR.

    screening;2-hydroxy-4-(methylthio)butyronitrile;2-hydroxy-4-(methylthio)butyric acid;nitrilase;identification

    TQ925

    A

    1674-2214(2015)02-0007-05

    2014-05-06

    浙江省自然科學(xué)基金基礎(chǔ)青年項(xiàng)目(20110208)

    李宗通(1987—),男,河南焦作人,碩士,研究方向?yàn)樯锎呋c生物轉(zhuǎn)化,E-mail:lizongtong_1987@126.com.

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