結(jié)膜上皮細(xì)胞在角膜基質(zhì)中轉(zhuǎn)化為角膜上皮樣細(xì)胞的研究

程建霞 徐海濤 左 蘭 黃鑫宇 杜園園 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院 眼眶眼整形科，長(zhǎng)春 130000)

結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞來(lái)源于不同的細(xì)胞系，正常情況下，分化成熟的結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞表達(dá)不同的角蛋白，即角膜上皮細(xì)胞表達(dá)CK3/CK12 蛋白，而結(jié)膜上皮細(xì)胞表達(dá)CK4/CK13 蛋白。而且，Ck12和Ck13 分別代表終末分化的角膜和結(jié)膜上皮細(xì)胞，角膜緣干細(xì)胞或早期發(fā)育角膜細(xì)胞不表達(dá)CK4和CK13 蛋白［1］。

眼表上皮細(xì)胞分化除由其干細(xì)胞系所決定外，是否會(huì)受到其下基質(zhì)環(huán)境的影響，即成體干細(xì)胞是否具有可塑性分化潛能，目前說(shuō)法不一。如文獻(xiàn)報(bào)道，將成年鼠角膜上皮細(xì)胞與胚胎鼠生發(fā)真皮共培養(yǎng)后，角膜上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，產(chǎn)生毛囊和皮脂腺樣結(jié)構(gòu)［2］。也有研究者證實(shí)，當(dāng)結(jié)膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋在角膜基質(zhì)表面，雖然可觀察到表現(xiàn)出不同程度的角膜上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，但并不產(chǎn)生Ck12蛋白表達(dá)［3］。同樣，當(dāng)結(jié)膜上皮細(xì)胞與角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，可以觀察到低水平的Ck3 蛋白表達(dá)，但不產(chǎn)生Ck12 蛋白表達(dá)［3］。當(dāng)結(jié)膜上皮細(xì)胞在人羊膜上培養(yǎng)，同樣沒(méi)有發(fā)生角膜上皮樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。有學(xué)者從結(jié)膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)少量Ck12 蛋白陽(yáng)性表達(dá)角膜樣上皮細(xì)胞，所以認(rèn)為決定細(xì)胞命運(yùn)的是原始細(xì)胞來(lái)源，而不是其基質(zhì)環(huán)境［4］。

針對(duì)上述問(wèn)題，我們通過(guò)檢測(cè)植入角膜基質(zhì)中結(jié)膜上皮細(xì)胞Ck3、Ck12 和Ck4 蛋白表達(dá)的改變，研究和檢測(cè)角膜基質(zhì)對(duì)結(jié)膜上皮細(xì)胞基因和蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 包括1∶ 1 DMEM 和Ham F12 混合液，補(bǔ)充體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清，10 μg/L 人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor，EGF)，5 mg/L 胰島素，0.5 mg/L 氫化可的松，0.1 nmol/L霍亂毒素，100 ×103U/L 青霉素，100 mg/L 鏈霉素。鼠單克隆抗體Muc5AC 購(gòu)自Abcam Ltd (Cambridge，CB4 0FW，UK);FITC-交聯(lián)羊抗鼠IgG 抗體(A lexa-488-labled;Invitrogen，Carlsbad)，CA 鼠單克隆抗體Ck13，Ck4，Ck14，Ck3，Muc5AC;羊單克隆抗體Ck12;FITC-交聯(lián)羊抗鼠IgG 抗體與驢抗羊IgG 抗體(Alexa-488-labled);DAPI 封 固 劑(Burlingame，CA)，OCT 膠(OCT，Leica Instrument GmbH，Germany)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康新西蘭大白兔20 只，體重2～2.5 kg，將其分為4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為正常對(duì)照組、3 d 動(dòng)物模型、10 d 動(dòng)物模型及20 d 動(dòng)物模型，每組各5 只。

1.3 兔結(jié)膜上皮細(xì)胞分離及培養(yǎng) 選定的上述新西蘭大白兔全身麻醉后，眼局部消毒，摘取雙眼上穹窿部結(jié)膜上皮組織(5 ×5 mm2)，用生理鹽水洗滌三次(含100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素)，將其切分成1 ×1 mm2大小組織塊平貼于培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清培養(yǎng)液后放入37℃孵育箱中，隔日換液。日常于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁、伸展及細(xì)胞生長(zhǎng)情況。組織塊培養(yǎng)5～7 d，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液及結(jié)膜組織塊，用0.25%Trypsin 消化后離心并收集，放置在冰盒里以備進(jìn)行下一步自體角膜基質(zhì)移植用。

1.4 結(jié)膜上皮細(xì)胞在角膜基質(zhì)中轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立 將實(shí)驗(yàn)兔全身麻醉，用刮匙將顳側(cè)半部角膜上皮徹底刮除，用0.9%生理鹽水沖洗該部角膜基質(zhì)，在距角膜緣2～3 mm 的去上皮的角膜基質(zhì)層作一長(zhǎng)2.0 mm 平行于角膜緣深達(dá)一半角膜基質(zhì)的切口，由該切口向角膜中央方向作一扇形板層隧道，將收集的結(jié)膜上皮細(xì)胞(6 ×105)放入該角膜基質(zhì)板層隧道中。術(shù)畢托百士眼膏涂眼預(yù)防感染。每日用裂隙燈顯微鏡觀察角膜情況。

1.5 實(shí)驗(yàn)樣本采集 實(shí)驗(yàn)兔全身麻醉后。將移植有結(jié)膜上皮細(xì)胞部分的整片角膜組織取下包埋于OCT 膠中，分別進(jìn)行H＆E 染色及免疫熒光染色。擬行PCR 檢測(cè)的標(biāo)本則先用刀片徹底刮除角膜上皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞及后彈力膜，用直徑2 mm2的環(huán)鉆切取結(jié)膜上皮細(xì)胞最密集部位的角膜基質(zhì)，并立即放入-1 500℃冰箱中保存。

1.6 熒光免疫組化分析 將組織樣本切成5 mm厚的超薄組織切片置于載玻片上，室溫下放置半小時(shí)，待組織切片稍干后分別進(jìn)行常規(guī)H＆E 染色及免疫熒光染色。

1.7 Real-time PCR 分析 采用Tq-PCR 檢測(cè)細(xì)胞角蛋白-3、細(xì)胞角蛋白-4，波形蛋白基因的表達(dá)。應(yīng)用Trizol 試劑(Invitrogen)從冰凍組織中提取總RNA，cDNA 隨機(jī)引物采用cDNA 試劑盒(Invitrogen)按說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備，采用PRISM 7700 序列和Taq-Man 基因表達(dá)試劑盒(Applied Biosystems)應(yīng)用適當(dāng)?shù)南♂宑DNA 逆轉(zhuǎn)錄PCR。引物從AB 公司訂購(gòu)。每次實(shí)驗(yàn)均采用無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)作為cDNA 的陰性對(duì)照，無(wú)cDNA 的PCR 作為PCR 反應(yīng)的陰性對(duì)照，β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 兔結(jié)膜上皮細(xì)胞組織塊培養(yǎng)形態(tài)及蛋白表達(dá)培養(yǎng)第24～48 h，組織塊邊緣即有結(jié)膜上皮細(xì)胞爬出，第5～7 天時(shí)，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底，并匯合成單層。這時(shí)Ck14 即基底細(xì)胞標(biāo)記蛋白幾乎表達(dá)于所有的細(xì)胞中，而只有部分細(xì)胞Ck4 染色呈陽(yáng)性，并可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞Ck3 染色陽(yáng)性細(xì)胞。而Ck3 和Ck12在所有培養(yǎng)細(xì)胞中染色均呈陰性。這個(gè)結(jié)果提示，所培養(yǎng)的該階段細(xì)胞為結(jié)膜上皮基底細(xì)胞。

2.2 植入角膜基質(zhì)的結(jié)膜上皮細(xì)胞形態(tài)及免疫組化分析 植入術(shù)后第2 天角膜上皮高度水腫混濁，第3 天角膜上皮水腫逐漸減退，植入1～2 周時(shí)結(jié)膜上皮細(xì)胞在角膜基質(zhì)間呈灰白色，清晰可見(jiàn)(圖1)。

圖1 結(jié)膜上皮細(xì)胞植入角膜基質(zhì)后兔眼成像Fig.1 Micrograph of rabbit eye after implantation of cultured conjunctival epithelial cells

圖2 結(jié)膜上皮細(xì)胞植入第1 階段細(xì)胞形態(tài)及免疫熒光結(jié)果Fig.2 Immunohistochemical analysis of implanted conjunctival epithelial cells at Phase I

圖3 結(jié)膜上皮細(xì)胞植入第2 階段細(xì)胞形態(tài)及免疫熒光結(jié)果Fig.3 Immunohistochemical analysis of implanted conjunctival epithelial cells at Phase Ⅱ

圖4 結(jié)膜上皮細(xì)胞植入前后不同階段Ck3 和Ck4 基因表達(dá)結(jié)果，β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參Fig.4 Quantitative PCR analysis of CK3 and CK4 gene expression in conjunctival epithelial cells before and after implantation at different Phases Note:βactin was used as internal control for the calculation of δCt

第1 階段:結(jié)膜上皮細(xì)胞在角膜基質(zhì)內(nèi)的聚集期H＆E 染色結(jié)果顯示被移植的結(jié)膜上皮細(xì)胞在角膜基質(zhì)內(nèi)聚集在一起，呈不規(guī)則排列(圖2A)。幾乎所有植入的結(jié)膜上皮細(xì)胞均有Ck4 陽(yáng)性表達(dá)(圖2B)，少量細(xì)胞Ck3 和Ck12 表達(dá)陽(yáng)性(圖2D，2E)，Ck4/Ck12 雙染結(jié)果顯示，所有Ck12 表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)也表達(dá)Ck4 蛋白(圖2G)，雖然所培養(yǎng)的結(jié)膜上皮細(xì)胞無(wú)Ck13 表達(dá)，但其陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞散在分布于所植入的結(jié)膜上皮細(xì)胞當(dāng)中，然而Ck12/Ck13雙重染色結(jié)果顯示二者無(wú)共表達(dá)(圖2C)。Ck4 陽(yáng)性細(xì)胞與其周?chē)慕悄せ|(zhì)之間呈現(xiàn)CollagenIV 陽(yáng)性染色(圖2F)。Ck12 陽(yáng)性細(xì)胞周?chē)匆?jiàn)Laminin染色(圖2H)

第2 階段:上皮樣結(jié)構(gòu)形成期 結(jié)膜上皮細(xì)胞植入后1 周至10 d，H＆E 染色結(jié)果顯示植入的結(jié)膜上皮細(xì)胞排列規(guī)則，形成2～3 層細(xì)胞層，呈現(xiàn)上皮樣結(jié)構(gòu)(3A)。CollagenIV 和Laminin 連續(xù)性表達(dá)于植入上皮細(xì)胞周?chē)?圖3H，3I)，提示新的基底膜的產(chǎn)生。幾乎所有移植細(xì)胞均呈現(xiàn)Ck4、Ck3 和Ck12 陽(yáng)性表達(dá)(圖3B、3C 和3D);Ck4/Ck12 雙重染色結(jié)果示二者呈現(xiàn)共表達(dá)現(xiàn)象(圖3E);Ck13 陽(yáng)性表達(dá)較第1 階段減少且Ck13 和Ck12 之間無(wú)共表達(dá)現(xiàn)象(圖3F，3G)第3 階段:細(xì)胞衰退期 植入術(shù)后3 周，植入的結(jié)膜上皮細(xì)胞開(kāi)始退化、死亡，但是殘存的細(xì)胞仍可被Ck3、Ck12、Ck4 染色，CollagenIV 和Laminin 連續(xù)性表達(dá)于其周?chē)?/p>

2.3 角蛋白基因表達(dá)的定量分析 定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，3 個(gè)階段中所有植入細(xì)胞CK3 和Ck4 基因表達(dá)均呈陽(yáng)性。將α-actin 作為內(nèi)部控制，計(jì)算植入角膜基質(zhì)的結(jié)膜上皮細(xì)胞CK3 和Ck4 基因轉(zhuǎn)錄并與培養(yǎng)的結(jié)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行比較(圖4)。在植入第1 階段，與植入前培養(yǎng)的結(jié)膜上皮細(xì)胞比較，Ck4基因表達(dá)降低而Ck3 基因表達(dá)則升高;植入第2 階段，角膜基質(zhì)中的結(jié)膜上皮細(xì)胞Ck4 基因表達(dá)逐漸下降，而Ck3 基因表達(dá)略有上升;而植入第3 階段因許多植入細(xì)胞開(kāi)始衰退，Ck3 基因表達(dá)不再增加。

3 討論

關(guān)于上皮細(xì)胞分化有兩方面問(wèn)題值得我們關(guān)注，即是否上皮細(xì)胞的分化是從胚胎期或初生期開(kāi)始，并呈程序性及不可逆性發(fā)展，以及是否這些上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和分化受它們各自的基質(zhì)所影響。我們將培養(yǎng)的成體兔眼結(jié)膜上皮細(xì)胞移植入自體角膜板層基質(zhì)中，結(jié)膜上皮細(xì)胞分化會(huì)一步一步地發(fā)生轉(zhuǎn)變，而且這種轉(zhuǎn)變同時(shí)伴隨著基因表達(dá)的改變。

首先，我們證實(shí)了結(jié)膜上皮細(xì)胞可在植入兔角膜基質(zhì)中形成上皮樣結(jié)構(gòu)并存活3 周，植入的結(jié)膜上皮細(xì)胞可呈現(xiàn)Ck3 和Ck12 陽(yáng)性表達(dá)且隨著植入時(shí)間延長(zhǎng)其陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量逐漸增加。同時(shí)因植入的細(xì)胞Ck4 蛋白仍呈陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明這些細(xì)胞依舊保留結(jié)膜上皮細(xì)胞特點(diǎn)。因此我們證明植入角膜基質(zhì)的結(jié)膜上皮細(xì)胞呈現(xiàn)角、結(jié)膜上皮細(xì)胞共同特點(diǎn)。

另外，植入角膜基質(zhì)中結(jié)膜上皮細(xì)胞Ck3 蛋白表達(dá)增加。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［5］，通過(guò)Western blot 凝膠電泳顯示兔結(jié)膜上皮細(xì)胞Ck3 可呈低水平表達(dá)，當(dāng)結(jié)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)在羊膜上時(shí)這種Ck3 表達(dá)則明顯增加［3］。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之次相符，即在培養(yǎng)的兔結(jié)膜上皮細(xì)胞中可檢測(cè)到少量Ck3 表達(dá)細(xì)胞，進(jìn)而大多數(shù)植入角膜基質(zhì)中7 天后的結(jié)膜上皮細(xì)胞其Ck3 呈陽(yáng)性表達(dá)。我們沒(méi)有觀察到植入細(xì)胞的增殖，所以不支持Ck3 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞增加為初始Ck3陽(yáng)性細(xì)胞分裂增殖而來(lái)。另外，PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示植入角膜基質(zhì)的結(jié)膜上皮細(xì)胞Ck3 基因表達(dá)較培養(yǎng)的結(jié)膜上皮細(xì)胞增加，該結(jié)果支持植入結(jié)膜上皮細(xì)胞在角膜基質(zhì)環(huán)境作用下Ck3 表達(dá)增加。通過(guò)以往文獻(xiàn)報(bào)道，培養(yǎng)的結(jié)膜上皮細(xì)胞可檢測(cè)Ck3 陽(yáng)性細(xì)胞，而Ck12 則檢測(cè)不到［3，5］。

Kurpakus［6］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將牛結(jié)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)在角膜基底膜上，可出現(xiàn)Ck12 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。同樣，在培養(yǎng)的兔結(jié)膜上皮細(xì)胞熒光免疫組化染色Ck12 表達(dá)完全呈陰性，而絕大多數(shù)植入的結(jié)膜上皮細(xì)胞Ck12 蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，因Ck12 為終末分化的角膜上皮細(xì)胞標(biāo)記物，我們研究證實(shí)角膜基質(zhì)環(huán)境可以誘導(dǎo)結(jié)膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為角膜樣上皮細(xì)胞。同樣與Ck3 和Ck12 表達(dá)相似，當(dāng)結(jié)膜上皮細(xì)胞植入角膜基質(zhì)后其Ck4 表達(dá)明顯下降，但仍持續(xù)存在與植入上皮細(xì)胞中。在植入第2 階段，出現(xiàn)CK3/CK12/CK4 蛋白共表達(dá)現(xiàn)象，提示植入細(xì)胞呈現(xiàn)角、結(jié)膜上皮細(xì)胞共有特性。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)角膜基質(zhì)通過(guò)作用于低分化的結(jié)膜上皮細(xì)胞使其發(fā)生轉(zhuǎn)化。因?yàn)榕囵B(yǎng)的結(jié)膜上皮細(xì)胞通過(guò)免疫組化分析證實(shí)其Ck14 蛋白表達(dá)陽(yáng)性而Ck13 蛋白表達(dá)陰性，符合基底細(xì)胞蛋白表達(dá)特點(diǎn)［7］。這種培養(yǎng)的結(jié)膜上皮細(xì)胞角蛋白表達(dá)特點(diǎn)可能是因?yàn)槲覀兯门囵B(yǎng)液更有利于細(xì)胞增殖而不是分化。其次，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)植入的上皮細(xì)胞共表達(dá)Ck12 和Ck13，提示二者之間不存在共有蛋白表達(dá)現(xiàn)象。然而，因我們實(shí)驗(yàn)中Ck13 蛋白表達(dá)量很少，所以我們可能還需要更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)此觀點(diǎn)。此外，由于抗體產(chǎn)品的限制，我們無(wú)法檢測(cè)Ck13 和Ck3 共表達(dá)情況，以證實(shí)是否成熟的結(jié)膜上皮細(xì)胞能夠在角膜基質(zhì)誘導(dǎo)下發(fā)生轉(zhuǎn)化。

關(guān)于上皮細(xì)胞在特殊基質(zhì)環(huán)境中轉(zhuǎn)分化及相關(guān)機(jī)制，以往文獻(xiàn)也有報(bào)道［8］。如將成人角膜上皮細(xì)胞植入到胚胎真皮層中，角膜上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化并形成上皮和毛囊組織［2］。也有研究者觀察到角膜緣干細(xì)胞損傷后，覆蓋于角膜基質(zhì)的結(jié)膜上皮細(xì)胞呈現(xiàn)角膜上皮特點(diǎn)［9］。但也有人反對(duì)此觀點(diǎn)，認(rèn)為這些具有角膜樣上皮特點(diǎn)的細(xì)胞仍來(lái)源于殘存的角膜緣干細(xì)胞［10］。所以，對(duì)于角膜基質(zhì)表面的結(jié)膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為角膜樣上皮細(xì)胞目前還沒(méi)有更理想的角膜重建證據(jù)［11］。實(shí)際上，這些有關(guān)結(jié)膜上皮細(xì)胞在角膜基質(zhì)表面生長(zhǎng)、分化及轉(zhuǎn)化的動(dòng)物模型設(shè)計(jì)很容易受其他因素影響，如新生血管、淚膜和血液攜帶的炎癥因子及暴露的空氣，可能會(huì)干擾結(jié)膜上皮細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化的能力。所以我們實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)排除了這些干擾因素，單純研究角膜基質(zhì)單一誘導(dǎo)環(huán)境對(duì)于結(jié)膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用。

以往研究證實(shí)，氣液交界面是促進(jìn)結(jié)膜上皮細(xì)胞分層和分化的關(guān)鍵因素［12］。研究中發(fā)現(xiàn)，雖然在植入第2 和第3 階段結(jié)膜上皮細(xì)胞周?chē)梢杂^察到基底膜形成，但植入的結(jié)膜上皮細(xì)胞在角膜基質(zhì)中很少增殖和分層。另外，雖然Ck13 在培養(yǎng)的結(jié)膜上皮細(xì)胞中無(wú)表達(dá)，但在植入的角膜基質(zhì)細(xì)胞中可減少量表達(dá)，考慮因缺乏空氣限制了植入上皮細(xì)胞的分化和分層。但這種獨(dú)立的誘導(dǎo)環(huán)境同時(shí)也排除了細(xì)胞轉(zhuǎn)化的干擾因素。

總之，我們的研究結(jié)果顯示，結(jié)膜上皮細(xì)胞可以在角膜基質(zhì)環(huán)境誘導(dǎo)下發(fā)生橫向轉(zhuǎn)化，表達(dá)角膜上皮樣細(xì)胞特點(diǎn)。我們?cè)搶?shí)驗(yàn)的成功為成體干細(xì)胞可塑性研究提供了又一有力證據(jù)，顯示了用結(jié)膜干細(xì)胞代替角膜緣干細(xì)胞應(yīng)用于臨床的潛在前景，為組織工程化角膜上皮構(gòu)建提供了更充沛的種子來(lái)源。

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