新疆石河子地區(qū)漢族人群HLA-DPB1 基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感的相關(guān)性研究①

盧麗君 吳江東 左維澤 張萬江 章 樂 吳 芳

(石河子大學(xué)新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子 832000)

肺結(jié)核是本世紀(jì)威脅人類健康的主要傳染病，全球有約1/3 的人感染結(jié)核分枝桿菌，在不發(fā)達和發(fā)展中國家尤為嚴(yán)重，國內(nèi)形勢也不容樂觀。全國第5 次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查顯示我國活動性肺結(jié)核患病率459/10 萬［1］。所感染人群，約10%的人可發(fā)展成活動性肺結(jié)核，提示可能有相關(guān)基因參與疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來，國內(nèi)外已有大量研究顯示肺結(jié)核與白細胞分化抗原(HLA)Ⅱ類基因密切相關(guān)。

HLA 位于人類第六號染色體的短臂，長約3 600 kb，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類，其中HLA Ⅱ類可分為HLA-DR、HLA-DQ 和HLA-DP 區(qū)，HLA-DQ 和HLA-DR 基因與肺結(jié)核的相關(guān)性國內(nèi)外學(xué)者已進行了廣泛研究，而HLA-DP 也開始受到關(guān)注。1978 年Wank 等預(yù)處理淋巴細胞分型(Primed lymphocyte typing，PLT)時發(fā)現(xiàn)DR、DQ 不一樣的新抗原，使預(yù)處理T 淋巴細胞產(chǎn)生很強的二次反應(yīng)，導(dǎo)致后來HLA-DP 抗原的發(fā)現(xiàn)。到目前為止IMGT/HLA 數(shù)據(jù)庫經(jīng)WHO 確認報道的HLA-DPB1 等位基因已有489 個(http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/docs/release.html，2015，2.5)。HLA-DP 是表達于B 細胞、抗原提呈細胞和激活的T 細胞表面的糖蛋白。DP 分子是異二聚體，由一條α 鏈和β 鏈組成，后者具有高度多態(tài)性。迄今為止，國外僅有印度南部研究顯示HLA-DPB1* 04 與肺結(jié)核密切相關(guān)，具有預(yù)防及保護性作用［2，3］，國內(nèi)暫無HLA-DPB1 與肺結(jié)核相關(guān)性的研究。為此，本研究采用SBT 方法從群體遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)角度分析新疆石河子地區(qū)漢族肺結(jié)核患者與HLA-DPB1 等位基因的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 病例組為2014 年3 月至2014 年9 月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染科門診和住院部的肺結(jié)核患者，共93 例，均符合肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)。收集其相關(guān)資料并與其簽署知情同意書。其中男58 例，女35 例;年齡16～85 歲，平均(46.1±13.5)歲。健康對照組為肺結(jié)核患者周圍環(huán)境同時期進行健康體檢的人群。共96 例，已排除其他各類慢性疾病，其中男70 例，女26 例;年齡20～78歲，平均(41.3 ±10.6)歲。對照組與病例組按性別和年齡(±5 歲)配比選取，兩組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。所選研究對象在新疆生活均超過20 年，祖籍以河南(27.3%)、甘肅(21.5%)、陜西(12.0%)和山東(10.8%)為主，個體之間無血緣關(guān)系。

1.2 方法 DNA 的提取:抽取病例組和對照組人群外周靜脈血3 ml，EDTA 抗凝，用天根公司DNA提取試劑盒(the mini column whole blood DNA extraction kit from tiangen)提取基因組DNA 。用紫外分光光度計測定DNA 濃度和純度，根據(jù)A260/A280 值計算DNA 提取的純度。

HLA-DPB1 等位基因檢測:HLA-DPB1 基因分型采用美國Invitrogen 公司(美國life technologiest公司產(chǎn)品)SeCoreTMHLA 測序試劑盒［5351925，SeCore DPB1 Locus Sequencing Kit，Group Specific Set(RUO)］，其中HLA-DPB1 基因檢測2 號外顯子正向反向測序。操作步驟:首先PCR 擴增、產(chǎn)物經(jīng)酶切純化后作為測序反應(yīng)模版，按照試劑盒操作進行測序反應(yīng)利用ABI 3730 DNA 測序儀進行電泳分析。采用uTYPE Dx 序列分析軟件指定型別。樣本分型均在國家認證實驗室采用標(biāo)準(zhǔn)化分型方法，操作依據(jù)國際認證試劑盒按照說明書，經(jīng)專業(yè)人員進行分型分析，實驗中采用雙盲對照方法，隨機重復(fù)實驗樣本，來檢查實驗的準(zhǔn)確性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Arlequin3.5 檢驗分析Hardy-Weinberg 平衡。采用SPSS17.0 以χ2檢驗比較各等位基因頻率在不同組之間的差異，對于頻數(shù)小于5 的采用fisher 確切指定方法計算。以比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)表示各等位基因攜帶個體發(fā)生肺結(jié)核的風(fēng)險度。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對照組等位基因分布情況及Hardy-Weinberg 平衡檢驗 自93 例新疆石河子地區(qū)漢族肺結(jié)核患者和96 例新疆石河子地區(qū)漢族健康對照個體的HLA-DPB1 基因外顯子二核酸序列通過與HLA-DPB1 基因型數(shù)據(jù)庫比較分析，共檢出有16 種HLA-DPB1 等位基因型別。其中以DPB1* 0501 等位基因的頻率最高。病例組占38.2%，對照組占28.1%。其次為DPB1* 0201(16.7%;27.6%)。另一個頻率較高的等位基因為DPB1 * 0401(17.1%;15.1%)，在新疆漢族人群中這三個基因超過DPB1 等位基因的70%。其余基因頻率為0.5%～5.0%，其中對照組中有四個等位基因在病例組中未檢出來，詳見表2。病例組和對照組的HLA-DPB1等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡，見表1。

表1 病例組和對照組HLA-DPB1 的Hardy-Weinberg 平衡檢驗Tab.1 Hardy-Weinberg equilibrium for HLA-DPB1 in patients and controls

表2 在肺結(jié)核病例組和健康對照組中HLA-DPB1 等位基因的頻率Tab.2 Frequencies of HLA-DPB1 alleles in patients and controls

2.2 病例組與對照組基因頻率對比及差異性比較在新疆石河子地區(qū)漢族肺結(jié)核患者與新疆石河子地區(qū)漢族健康對照組中的HLA-DPB1 等位基因頻率見表2。可觀察出對照組中HLA-DPB1* 0201 等位基因頻率明顯高于病例組(27.6% vs 16.7%，OR=0.525，P=0.011);而HLA-DPB1* 0501 在病例組的頻率顯著高于對照組(38.2% vs 28.1%，OR=1.578，P=0.038)。檢出的其余等位基因在病例組與對照組中頻率分布無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討論

HLA 基因在機體免疫調(diào)節(jié)中作用重大，尤其是HLA-Ⅱ類分子是在T 細胞介導(dǎo)的細胞免疫中所必需的分子，它主要參與了抗原肽的特異結(jié)合，并將之呈遞給CD4+T 細胞，形成MHC-抗原-T 細胞復(fù)合物，進而引起機體免疫反應(yīng)。由于它在免疫反應(yīng)中的重要性和自身的高度多態(tài)性，HLA 基因在疾病相關(guān)性研究中日益受到重視，尤其是HLA-Ⅱ類基因。已有研究發(fā)現(xiàn)HLA 系統(tǒng)與500 余種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并且在器官移植中應(yīng)用廣泛。

近20 年來，國內(nèi)外已對多個種族和地區(qū)的人群HLA-Ⅱ類等位基因頻率進行了群體遺傳學(xué)分析，并在此基礎(chǔ)上研究HLA 基因型別與疾病的關(guān)聯(lián)，獲得了很多有意義的資料。

在中華人民共和國建國前，新疆長期居住的漢族人群極少，自解放來，響應(yīng)黨中央“建設(shè)大西北”號召，來自五湖四海的漢族人群構(gòu)成了新疆漢族人群的基礎(chǔ)，而石河子地區(qū)位屬北疆，又是兵團城市，漢族人群居多，依據(jù)我們采集樣本數(shù)據(jù)分析，此地區(qū)漢族人群祖籍多以河南、甘肅、陜西、山東等地為主。由于長期受新疆獨特的氣候、地理環(huán)境、生活方式等影響，為了適應(yīng)環(huán)境，新疆漢族人群經(jīng)過幾十年的融合變遷，HLA-DPB1 等位基因有了頻率分布的自身特點，但仍然偏北方人群。

本研究對照組數(shù)據(jù)顯示HLA-DPB1* 0501(28.1%)、HLA-DPB1* 0201(27.6%)、HLA-DPB1*0401(15.1%)是新疆石河子地區(qū)漢族人群的高頻基因，之前有文獻報道我國其他地區(qū)漢族人群HLADPB1 頻率分布情況，關(guān)于新疆漢族人群卻未見報道，依據(jù)HLA 頻率分布趨勢，我國漢族人群可分為南北兩大群體。北方地區(qū)(如沈陽、山東35%左右)HLA-DPB1* 0501 頻率普遍低于南方地區(qū)(如四川、浙江、廣東40%左右)，呈北低南高的趨勢;而HLADPB1* 0201 的頻率則是北方(如沈陽、山東20%左右)高于南方(如浙江、四川、廣東15%左右)，呈北高南低的趨勢，HLA-DPB1* 0401 及其他基因無明顯分布規(guī)律［4-7］。新疆哈薩克族與維吾爾族人群的HLA-DPB1 基因與新疆漢族人群相比較，HLA-DPB1* 0401 所占比例最大(哈薩克族21.4%;維吾爾族31.6%)，而HLA-DPB1* 0501 比例卻明顯降低(哈薩克族20.2%;維吾爾族7.0%)［8，9］。亞洲其他國家(如韓國、日本)人群HLA-DPB1 基因與中國新疆漢族相比較，前三位HLA-DPB1* 0501、0201、0401所占比例大體一致，HLA-DPB1* 0402 基因在中國漢族所占比例很小，基本在10%以下，而在韓國、日本卻占10%以上［10，11］。本研究所選研究對象皆是在新疆石河子生活超過20 年的漢族人群，具有一定的代表性，本研究可為新疆本地漢族的人類學(xué)及疾病相關(guān)性研究提供依據(jù)和參考。

HLA-Ⅱ類分子主要參與外源性抗原的傳遞，是與結(jié)核分枝桿菌相關(guān)性最高的一類分子，但結(jié)核病的發(fā)病機制尚不十分清楚，大量的研究證實肺結(jié)核與遺傳和環(huán)境因素密切相關(guān)，是遺傳與環(huán)境相互作用的結(jié)果［12-14］。因此對HLA 進行分型并分析其與肺結(jié)核的相關(guān)性已研究甚廣。HLA 分型方法早期主要基于血清學(xué)和細胞學(xué)的方法，該法分辨率低、成本高。目前已被DNA 為基礎(chǔ)的分型方法取代:順序特異性引物法(Sequence specific oligonucleotide probe，SSP)，該法以少量樣本檢測、低分辨率為主;順序特異性寡核苷酸探針法(Sequence specific oligotide，SSOP)則適合高通量、中分辨率樣本檢測;近些年使用的基于測序的分型方法(Sequence-based typing，SBT)，是目前HLA 分型檢測公認的金標(biāo)準(zhǔn)，具有高通量、高分辨率的特點?；谶@個特點，本研究采用目前分辨率最高的基因型分型方法—SBT 方法分析HLA-DPB1 基因與肺結(jié)核的相關(guān)性，該分型方法可保證本研究中等位基因分型的可信度和特異性。HLA-Ⅱ類基因與結(jié)核的研究多限于HLADRB1 與HLA-DQB1，對于HLA-DPB1 與結(jié)核的研究國外研究非常有限，僅限于印度［2，3］，國內(nèi)暫無其與肺結(jié)核的研究，HLA-DPB1 分子與HLA-DRB1 和HLA-DQB1 非常相似，都參與抗原提呈給T 細胞并誘導(dǎo)二次增殖反應(yīng)。但是HLA-DPB1 與其他疾病的研究國內(nèi)外較多，例如研究顯示HLA-DPB1* 0501可能為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的保護基因［15］;HLA-DPB1*0402 可能為陣發(fā)性睡眠和I 型糖尿病的保護基因［16-18］;HLA-DPB1* 0201 可能為哮喘的保護性因素［19，20］，HLA-DPB1* 0301 與阿司匹林不耐受哮喘的易感強相關(guān)［21］?？煽闯鯤LA-DPB1 在疾病中傾向于明顯的保護作用。本研究對照組中HLA-DPB1* 0201 等位基因頻率明顯高于病例組(OR=0.525，P=0.011)，可以認為HLA-DPB1* 0201 可能是肺結(jié)核的保護基因，統(tǒng)計學(xué)差異顯著。而HLADPB1* 0501 在病例組的頻率顯著高于對照組(OR=1.578，P=0.038)，則認為HLA-DPB1* 0501 可能為肺結(jié)核的易感基因，但由于此P 值接近0.05，不排除因為樣本量小而產(chǎn)生的偏倚和誤差或因HLA-DPB1 等位基因與其他基因座位的連鎖作用，所以HLA-DPB1*0501 為肺結(jié)核的易感基因的可信度相對較低，需加大樣本量、進一步分析其單倍型驗證。

近幾十年在不同地域、人群、種族之間進行了很多HLA-Ⅱ類基因與肺結(jié)核的研究，但結(jié)果不太一致，甚至自相矛盾，可能除了與技術(shù)手段有限和樣本量低有關(guān)外，還可能與多個基因表達同一種特定肽有關(guān)，而這個肽與疾病易感的重要性可能遠遠超過基因本身。因此，需在發(fā)現(xiàn)相關(guān)易感基因基礎(chǔ)上進一步做功能學(xué)驗證。

本研究的結(jié)果是初步的，受研究樣本小和HLADPB1 與相關(guān)HLA-Ⅱ類基因連鎖的作用的影響，今后還需進一步擴大樣本量，結(jié)合家系調(diào)查，從HLADPB1 單倍型及與其他基因連鎖不平衡分型等方面進行分析驗證。從基因水平上研究有利于了解肺結(jié)核的發(fā)病機制，為新型抗結(jié)核疫苗的開發(fā)、疾病有效防治策略及新疆石河子地區(qū)漢族人群肺結(jié)核個體化治療提供有益的參考。

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