多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子真核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備①

王立正 王子璇 朱 瑞 劉鎮(zhèn)天 于 彬 于湘暉 趙興紅

(吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院艾滋病疫苗國家工程實(shí)驗(yàn)室，長春 130012)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是目前世界上第二大神經(jīng)退行性疾病，在50 歲以上人群中患病率顯著上升［1-3］。PD 最重要的病理特征是黑質(zhì)致密部多巴能神經(jīng)元大量減少［4］。神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類能促進(jìn)神經(jīng)元生長并對其有保護(hù)作用的分泌性蛋白，近年來大多數(shù)被證明對多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用，并在動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得到證明［5，6］。腦多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子(Cerebral dopamine neurotrophic factor，CDNF)是屬于MANF 家族的一類神經(jīng)營養(yǎng)因子［7］，于2007 年由Lindholm 等［8］首次發(fā)現(xiàn)，并在動物水平上說明CDNF 蛋白可以保護(hù)及修復(fù)多巴胺能神經(jīng)元，具有治療帕金森病的應(yīng)用前景。

本研究通過構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVR1012-CDNF-his，轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞HEK 293T 中進(jìn)行蛋白表達(dá)，收取上清進(jìn)行鎳柱親和層析純化，以獲得純度較高的CDNF 蛋白。為方便進(jìn)一步對CDNF 功能機(jī)制及其在帕金森病中的應(yīng)用進(jìn)行研究。使用純化的蛋白免疫動物，制備出特異性較好的多克隆抗體，方便之后研究中CDNF 蛋白的鑒定及發(fā)揮生物功能過程中與其他蛋白相互作用探究。

1 材料與方法

1.1 材料 VR1012 載體及pAAV-CDNF 質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存;SalⅠ限制性內(nèi)切酶、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶及T4 連接酶購自TaKaRa 公司;CDNF 多抗購自Abcam 公司;Ni-NTA agarose、預(yù)染蛋白Marker 及Anti-his 單抗購自Invitrogen 公司;MTT 購自Biosharp 公司;DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液及小牛血清白蛋白(FBS)購自Hyclone 公司;NBT、BCIP、AP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 及AP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG 購自鼎國生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 pVR1012-CDNF-his 構(gòu)建 使用引物(正向引物:5'-CCTAGCGTCGACATGTGGTGCGCGAGCCC-3';反向引物:5'-GTAATGGATCCTCAATGGTGATGGTGATGATGGAGCTCTGTTTTGGGGTG-3')，以pAA V-CDNF 為模板通過PCR 擴(kuò)增出帶有his 標(biāo)簽堿基序列的CDNF-his 目的片段。具體PCR 程序設(shè)置為:98℃下預(yù)變性5 min;進(jìn)入30 個循環(huán)的擴(kuò)增程序:98℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸1 min;30 個循環(huán)程序結(jié)束后72℃再延伸10 min;最后降溫至4℃完成PCR。擴(kuò)增出的目的片段兩端帶有SalⅠ及BamHⅠ兩個限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。按照酶切、膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、挑單克隆、質(zhì)粒抽提等步驟，構(gòu)建pVR1012-CDNF-his。

1.3 CDNF 真核表達(dá) 預(yù)先傳代HEK 293T 細(xì)胞，待細(xì)胞生長至細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面積的70%～80%時，換成不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基，使用PEI 為轉(zhuǎn)染試劑，將pVR1012-CDNF-his 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，4～6 h 后換成含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，72 h 后收取上清進(jìn)行純化。

1.4 CDNF 純化、SDS-PAGE 檢測及Western blot 鑒定 收取的上清過0.45 μm 濾膜后進(jìn)行鎳柱親和層析，摸索洗脫條件，最終確定使用25、50、70、90 mmol/L 咪唑濃度洗脫液按照從低咪唑濃度到高咪唑濃度對CNDF-his 蛋白梯度洗脫。SDS-PAGE 檢測蛋白純度，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果用Quantity one 進(jìn)行灰度分析，估算目的蛋白純度。Western blot 對蛋白進(jìn)行鑒定。

1.5 MTT 法檢測CDNF 蛋白生物活性 96 孔板中按照1 ×105個細(xì)胞/孔鋪PC12 細(xì)胞，含2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h 后，換成不含F(xiàn)BS 的DMEM培養(yǎng)基，6-OHDA 加入孔中，同時加入CDNF 蛋白使得最終每孔中6-OHDA 濃度為200 μmol/L，CDNF蛋白濃度呈系列梯度，孵育24 h，加入MTT，孵育4 h，酶標(biāo)儀單波長OD490nm 進(jìn)行讀板。導(dǎo)出數(shù)據(jù)，分析。

1.6 多克隆抗體制備及鑒定 選取3 月齡健康新西蘭大白兔，免疫前取2 ml 血制備血清做陰性對照，-80℃保存。初次免疫使用500 μg 蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合液，間隔兩周后進(jìn)行第二次免疫，使用200 μg 蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合液，再間隔三周使用200 μg 蛋白與弗氏不完全佐劑等比混合液進(jìn)行第三次免疫，1 周后心臟采血制備血清通過Western blot 鑒定多克隆抗體。免疫時注射方法為背部多點(diǎn)注射。采用的血清制備方法為:全血4℃放置過夜，4℃離心機(jī)3 000 r/min 離心20 min 后吸取上清至新的離心管，再次4℃離心機(jī)3 000 r/min 離心20 min，收取上清即獲得血清。

2 結(jié)果

2.1 pVR1012-CDNF-his 構(gòu)建 按照圖1 所示設(shè)計構(gòu)建質(zhì)粒，構(gòu)建得到質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示成功將目的片段構(gòu)建入載體。進(jìn)行測序，結(jié)果顯示目的片段無突變，完全與預(yù)期序列匹配。

2.2 CDNF 蛋白純化SDS-PAGE 分析及Western blot 鑒定 CDNF 蛋白在20 個細(xì)胞培養(yǎng)瓶(225 cm2)的HEK 293T 細(xì)胞中(總培養(yǎng)基量為500 ml)大量表達(dá)之后，收取上清進(jìn)行鎳柱親和層析，蛋白與鎳柱結(jié)合后，摸索洗脫條件，SDS-PAGE 結(jié)果顯示(見圖2)，在50 mmol/L 咪唑濃度的洗脫液洗脫時已經(jīng)可以洗脫下目的蛋白。對電泳條帶進(jìn)行灰度分析，結(jié)果顯示70 mmol/L 及90 mmol/L 咪唑濃度洗脫液洗脫得到的蛋白純度在90%以上。最終將蛋白濃縮至約1 mg/ml 的濃度，分裝后-80℃保存。500 ml 上清可以純化出約1 mg 蛋白。使用Western blot 對純化的蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示(見圖3)，所獲得的CDNF 蛋白正確性得到驗(yàn)證。

圖1 pVR1012-CDNF-his 圖譜及質(zhì)粒酶切鑒定分析Fig.1 pVR1012-CDNF-his map and plasmid's restriction enzyme digestion analysis

圖2 SDS-PAGE 分析蛋白純化情況Fig.2 SDS-PAGE analysis for protein purification

圖3 純化得到的CDNF 蛋白Western blot 鑒定Fig.3 Western blot analysis for CDNF protein after purification

2.3 CDNF 生物活性鑒定 通過實(shí)驗(yàn)摸索6-OHDA在200 μmol/L 濃度下對PC12 細(xì)胞能起到較好的殺傷效果，因此選擇此濃度作為殺傷濃度，評價純化得到的CDNF 對PC12 是否具有保護(hù)作用。MTT 結(jié)果顯示(見圖4)，隨著CDNF 濃度的升高，PC12 細(xì)胞存活率呈上升趨勢，說明所純化獲得的蛋白具有良好的生物活性。

2.4 多克隆抗體鑒定 免疫過程中及免疫后取血制備血清，使用Western blot 來檢測多克隆抗體。結(jié)果顯示(見圖5):二免后新西蘭兔體內(nèi)已產(chǎn)生CDNF 特異性抗體，三免起到了免疫加強(qiáng)效果，兔體內(nèi)產(chǎn)生了更多的多克隆抗體。因此，CDNF 兔多克隆抗體成功制備。

3 討論

CDNF 作為一種近年來發(fā)現(xiàn)的新型神經(jīng)營養(yǎng)因子對多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用，因此具有治療帕金森病的良好前景。在對其進(jìn)行研究過程中，一般均通過昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)及后續(xù)純化［8，11］。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高且質(zhì)量好(可一定程度保證蛋白正確折疊及糖基化修飾等)以及可放大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)［9，10］。但目前市售的桿狀病毒表達(dá)試劑盒價格較高，且一般實(shí)驗(yàn)室研究蛋白需求量較小，所以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)用于純化蛋白不適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室。本研究旨在探索出一種成本較低，適合于“蛋白需求量小”的蛋白表達(dá)純化體系，使用該體系獲得具有生物活性的CDNF 蛋白。

圖4 CDNF 生物活性鑒定MTT 結(jié)果Fig.4 MTT results for biological activity identification

圖5 多克隆抗體Western blot 檢測結(jié)果Fig.5 Western blot for polyclonal antibodies analysis

HEK 293T 細(xì)胞是常用的哺乳動物細(xì)胞，且表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后表達(dá)效果較好。鎳柱親和層析是攜帶有his 標(biāo)簽蛋白的常用純化手段。因此本研究聯(lián)合“HEK 293T 細(xì)胞表達(dá)蛋白”與“鎳柱親和層析”，進(jìn)行目的蛋白CDNF 的表達(dá)純化。首先，從本實(shí)驗(yàn)室已有的pAAV-CDNF 上通過PCR 手段擴(kuò)增出CDNF表達(dá)序列:3'端帶有6 ×his 標(biāo)簽序列的片段，進(jìn)而構(gòu)建入VR1012 真核表達(dá)載體，在真核細(xì)胞HEK 293T中成功大量表達(dá)出C 端帶有6 ×his 標(biāo)簽的CDNF蛋白。同時，由于構(gòu)建入載體的CDNF 基因片段5'端具有調(diào)控表達(dá)蛋白分泌的信號肽，故細(xì)胞內(nèi)存在未剪切信號肽的未成熟CDNF 蛋白及剪切掉信號肽的成熟CDNF 蛋白兩種形式。為只獲得成熟的CDNF 蛋白，故只收取上清進(jìn)行鎳柱親和層析，獲得了純度較高的成熟的CDNF 蛋白。

有研究報道，CDNF 在6-OHDA 介導(dǎo)的PC12 損傷過程中通過抑制影響Caspase 3 及Bcl-2/Bax 相關(guān)的凋亡通路或抑制JNK 信號通路起到保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用［11，12］?；诖耍捎肕TT 法檢驗(yàn)純化獲得的蛋白對神經(jīng)細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。因此，采用MTT 法檢驗(yàn)純化獲得的蛋白是否具有保護(hù)作用。MTT 結(jié)果顯示，獲得的CDNF 蛋白對PC12細(xì)胞具有很好的保護(hù)效果。

若進(jìn)一步研究CDNF 在帕金森病等疾病中的應(yīng)用或?qū)ζ湎嚓P(guān)機(jī)理進(jìn)行研究，CDNF 的抗體必不可少。若將CDNF 蛋白應(yīng)用到帕金森病的治療中，CDNF 在腦部的含量及分布情況需要通過WB 或免疫組織化學(xué)染色的方法進(jìn)行分析，這兩種方法必不可少CDNF 的抗體［8，13，14］;若研究CDNF 蛋白的保護(hù)機(jī)理，CDNF 的抗體則可用于一系列含有CDNF目的片段的重組質(zhì)粒的表達(dá)鑒定及用于探究CDNF相互作用蛋白的實(shí)驗(yàn)中。因此，本文獲得純度較高的CDNF 蛋白后，用其免疫動物，成功刺激新西蘭大白兔產(chǎn)生特異性抗體，經(jīng)Western blot 進(jìn)行鑒定，制備獲得的多克隆抗體與CDNF 蛋白具有很好的結(jié)合特異性，且在1∶1 000 使用時獲得較好的蛋白顯色效果。至此，CNDF 蛋白的兔多克隆抗體成功制備。

綜上所述，本研究成功建立相比較桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成本較低、操作較簡單、更適用于實(shí)驗(yàn)室研究的“HEK 293T 細(xì)胞表達(dá)，鎳柱親和層析純化”的蛋白表達(dá)純化體系，獲得具有生物活性的CDNF 蛋白，并成功制備了特異性較好的CDNF 多克隆抗體。為進(jìn)一步研究CDNF 的功能、應(yīng)用及保護(hù)機(jī)制等方面奠定了基礎(chǔ)。

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