Ⅰ型單純皰疹病毒單克隆抗體的制備及其應(yīng)用

尹炳謙 賈繼宗 趙風強 韓金樂 黃承浩 葉祥忠 張景海

(沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽 110016)

單純皰疹病毒-1(HSV-1)是引發(fā)人口唇部皮膚、口腔黏膜感染、引起發(fā)熱等的病原體，屬于皰疹病毒科a 病毒亞科的成員，可通過呼吸道、皮膚和黏膜密切接觸傳播。HSV-1 宿主范圍廣，感染效率高，具有嗜神經(jīng)性，HSV-1 可潛伏和激活，引發(fā)潰瘍、發(fā)熱等，嚴重影響健康。

HSV-1 病毒顆粒直徑約為180 nm，由包膜、皮層和核衣殼組成的雙鏈DNA 病毒。HSV-1 基因組大小為152 kb，可操作空間大，可缺失突變，也可被改造為外源基因的載體，用于治療藥物研究，目前重組HSV-1 已應(yīng)用于腫瘤治療中。缺失ICP34.5 的HSV-1 喪失嗜神經(jīng)毒性且不影響其復(fù)制［1］，為其改造成減毒活疫苗或腫瘤治療藥物打開了視窗。研究發(fā)現(xiàn)核苷酸還原酶基因突變的重組HSV-1，如核糖核苷還原酶(RR，ICP6)缺失［2］，僅能在具有增殖能力的細胞中增殖，如在腫瘤細胞中增殖并抑殺腫瘤細胞。通過插入特異性啟動子控制HSV-1 復(fù)制所必需的立即早期基因如ICP4、ICP27 等，使其靶向性感染目標細胞。另外，向重組HSV-1 中插入免疫調(diào)節(jié)因子如IL-12、GM-CSF 或B7-1 等基因［3］，可增強其溶瘤效應(yīng)。通過基因工程技術(shù)改造得到安全性好、靶向性強、復(fù)制效率高、可調(diào)控的重組HSV-1，使其作為抗腫瘤藥物成為可能［4］。目前多個溶瘤HSV-1 已進入臨床試驗階段，并在腫瘤治療方面取得較理想的結(jié)果［5］。

本文介紹一種針對HSV-1 糖蛋白中和表位的、靈敏、準確和特異的雙抗體夾心定量檢測HSV-1 抗原的ELISA 方法，為重組HSV-1 疫苗或溶瘤HSV-1藥物的研制提供一種快捷的抗原定量檢測的方法，可加速藥物研發(fā)進程或提高質(zhì)控水平。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 抗體及參考品 HSV-1 單克隆抗(1F6、2B1)由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司制備并保存。抗原定量參考品由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司制備并保存。

1.1.2 檢測樣品 單純皰疹病毒(HSV)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、巨噬細胞病毒(CMV)、柯薩奇病毒A 組16 型(CA16)、人腸道病毒71 型(EV71)、甲型肝炎病毒(HAV)由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司保存。

1.1.3 細胞 ARPE 細胞，來自ATCC，由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司保存。

1.1.4 其他試劑 牛血清白蛋白(BSA)、辣根過氧化物酶(HRP)購自Sigma 公司;BCA 試劑購自pierce 公司;HRP 標記的單克隆抗體由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司制備;硝酸纖維素膜購自whatman 公司。

1.2 單克隆抗體制備HSV-1 病毒顆粒抗原與弗氏佐劑按1∶1乳化后，經(jīng)腹腔接種SPF 級BALB/c 小鼠，100 μg/只，每2 周加強免疫1 次，50 μg/只/次，共免疫4 次，最后1 次經(jīng)尾靜脈注射HSV-1 抗原，100 μg/只，3 天后摘取脾臟并分離脾細胞。免疫的脾細胞與SP2/0 骨髓瘤細胞按PEG 方法融合，通過間接法篩選分泌抗HSV-1 抗體的雜交瘤細胞，并經(jīng)有限稀釋法克隆化培養(yǎng)。腹腔注射雜交瘤細胞，制備腹水。腹水經(jīng)硫酸銨沉淀、Protein A 柱純化得到單克隆抗體。

1.3 單抗分析

1.3.1 SDS-PAGE 分析 用12%的聚丙烯酰胺分離膠，按90 V、30 min，120 V、45 min，對純化后的單抗2B1 和1F6 進行SDS 變性凝膠電泳作純度分析。

1.3.2 Western blot 分析 將用293 細胞瞬時轉(zhuǎn)染表達的HSV-1 的各種糖蛋白(gB～gK)經(jīng)SDSPAGE 后于90 V、100 mA 下電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，膜于4℃用5%脫脂牛奶封閉過夜。次日加入合適稀釋度的單抗，于37℃搖動1 h，用PBST 洗滌，5 min/次，洗滌3 次，加入HRP 標記的羊抗鼠IgG 抗體，于37℃搖動1 h，用PBST 洗滌，5 min/次，洗滌3次，加AEC 顯色。其中HSV-1 感染的ARPE 細胞為陽性對照，ARPE 細胞蛋白為陰性對照。

1.3.3 ELISPOT 分析 將每毫升1 ×105 U2OS 細胞接種到96 微孔細胞板中，于37℃、5%CO2的溫箱中培養(yǎng)24 h 后，轉(zhuǎn)染11 種糖蛋白的真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h 之后用ELISPOT 檢測，同時設(shè)細胞對照。在微孔中加入50 μl 的1%的多聚甲醛，室溫避光5 min;1 × PBS 洗滌微孔1 次，每孔加入100 μl 的0.1%Triton 室溫下處理5 min;用1 ×PBS 洗滌微孔1 次，加入單克隆抗體，100 μl/孔，37℃孵育1 h;用1 ×PBS 洗滌微孔5 次，加入GAM-HRP 二抗，37℃孵育30min;用1 ×PBS 洗滌微孔5 次，加入TMB 顯色液，37℃孵育15 min，肉眼觀察斑點。

1.4 雙抗體夾心ELISA 法的建立 通過方陣實驗確定包被單抗1F6 和HRP 標記單抗2B1 的最佳使用濃度，用正交試驗、平行試驗設(shè)計篩選樣品稀釋液、酶稀釋液和封閉液［6］。單抗1F6 用50 mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋到3 μg/ml，包被96 孔酶標板，100 μl/孔，37℃溫育2 h，包被板用PBST(T為0.05% Tween20)洗滌1 次，用含2%BSA 的10 mmol/L PB 封閉液于37℃封閉2 h，用樣品稀釋液作2 倍比系列稀釋的樣品加入微孔中，100 μl/孔，37℃溫育60 min，用PBST 洗滌微孔，300 μl/孔，洗滌5 次，加HRP 標記的2B1，100 μl/孔，37℃溫育45 min，用PBST 洗滌微孔，300 μl/孔，洗滌5 次，加TMB 顯 色 液，100 μl/孔，37℃溫 育15 min，加2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，50 μl/孔，用450/630 讀微孔光密度值。

1.5 性能分析 根據(jù)《中華人民共和國藥典》三部(2010 版)對檢測方法驗證的要求［7］，對本試劑的線性、準確性、精密度、特異性等性能進行分析。

1.5.1 準確性試驗 用樣品稀釋液稀釋HSV-1 抗原內(nèi)部參考品為高值(2 μg/ml)、中值(1 μg/ml)、低值(0.5 μg/ml)3 個濃度后，用本方法測定。每個濃度樣品作3 份重復(fù)檢測，計算稀釋參考品的測定值和理論標示值的比值，即回收率，分析本方法的準確性。

1.5.2 精密性試驗 對高值(2 μg/ml)、中值(1 μg/ml)、低值(0.5 μg/ml)3 個濃度的HSV-1 抗原稀釋參考品，3 人次進行獨立試驗，每一稀釋度作3份重復(fù)測定。比較測定值和真實值，計算均值、標準偏差，分析試劑精密性。

1.5.3 直線性和定量限度實驗 用樣品稀釋液將HSV-1 抗原參比品稀釋到2、1、0.5、0.25、0.125、0 μg/ml 后，用本方法測定。以抗原濃度和對應(yīng)的OD值作直線回歸分析，分析最佳線性范圍，確定定量限度。

1.5.4 特異性試驗 用本方法分別檢測病毒培養(yǎng)液、ARPE 細胞蛋白、CMV、VZV 等，分析本試劑的特異性。

1.6 與病毒滴度相關(guān)性分析 HSV-1 純化的不同收集峰和不同批次的目標峰分別用本方法檢測各樣品的HSV-1 抗原活性，同時用蝕斑法檢測各個樣品的病毒滴度。通過比較兩種方法的檢測結(jié)果，分析本方法檢測與病毒滴度的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 單克隆抗體篩選 根據(jù)抗體滴度、特異性、中和效價、表位類型和配對檢測HSV-1 的靈敏度，篩選到兩株用于試劑構(gòu)建的單抗。兩株單抗的特征見圖1～3 和表1。

圖1 HSV-1 單抗的SDS 還原型凝膠電泳Fig.1 SDS-PAGE of monoclonal antibody against HSV-1

2.2 雙抗體夾心方法的建立 單抗1F6 用50 mmol/L 碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋到3.0 μg/ml包被96 孔板，100 μl/孔，37℃溫育2 h 后，棄液;封閉，200 μl/孔，37℃溫育2h，棄液;加樣，100 μl/孔，37℃溫育1 h;洗板5 次，加酶標抗體工作液，100 μl/孔，37℃溫育45 min，洗板5 次，加TMB 顯色液，100 μl/孔，37℃溫育15 min，加2 mol/L H2SO4終止液，50 μl/孔。用450/630 雙波長讀A 值。繪制標準曲線，擬定標準方程，代入樣品的A 值，計算待檢品抗原活性值。

2.3 性能分析

2.3.1 準確性和精密性 待檢品的回收率均值介于85.6%～107.1% 之間，同一試驗重復(fù)檢測和不同試驗者檢測的變異系數(shù)＜10%。準確性和精密度分析結(jié)果如表2 所示。

圖2 HSV-1 單抗的Western blot 分析Fig.2 Western blot of monoclonal antibody against HSV-1

圖3 HSV-1 單抗的表位鑒定(ELISPOT 法)Fig.3 The epitope identification of the monoclonal antibody against HSV-1

表1 兩株單抗的特性Tab.1 Characteristics of two HSV-1 monoclonal antibodies

2.3.2 線性和定量限度 用本方法測定抗原內(nèi)部參比品的線性范圍為0.125～2 μg/ml、R2=0.995 5，定量限度為0.125 μg/ml，見圖4。

2.3.3 特異性試驗 用建立的方法測定非HSV 樣品，待 檢 樣 品 的 A450/630 均 小 于 Cutoff 值(0.105)，即無交叉反應(yīng)。表明該檢測試劑的特異性良好。

2.3.4 與病毒滴度相關(guān)性分析 本方法檢測純化過程不同峰和不同批次目標峰的抗原活性與蝕斑法檢測的病毒滴度的相關(guān)性分析統(tǒng)計結(jié)果，見圖5。

表2 方法的準確性及精密性Tab.2 Accuracy and precision of developed ELISA method

圖4 HSV-1 抗原內(nèi)部參比品的標準曲線Fig.4 Standard curve of internal reference of HSV-1 antigen

圖5 兩種檢測方法的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of two detection methods

3 討論

經(jīng)過基因工程改造的重組HSV-1 能夠選擇性地在腫瘤細胞中大量增殖并最終殺死腫瘤細胞。美國Amgen 公司溶瘤免疫療法T-Vec 治療黑色素瘤的Ⅲ期臨床試驗取得積極數(shù)據(jù)［8］，并且與施貴寶的Yervoy 聯(lián)合免疫治療黑色素瘤I 期研究中效果顯著，而且未表現(xiàn)出毒性［9］。德國Medigene 公司開發(fā)的NV1020 用于治療結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移性肝癌，在I/II期臨床中取得了安全和療效數(shù)據(jù)，患者一年生存率可達到47.2%［10，11］。Feng 等［12］構(gòu)建了一種新型HSV-1 重組溶瘤病毒KTR27，即刪除了HSV-1 在正常細胞中復(fù)制所必需的ICP0 基因，同時，增加了四環(huán)素調(diào)控ICP27 基因，使病毒在腫瘤細胞中復(fù)制嚴格受四環(huán)素調(diào)控，且重組病毒在腫瘤細胞中的復(fù)制比在正常細胞更高效。重組HSV-1 已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療研究中，故開發(fā)一種快速檢測重組HSV-1的方法對加快重組HSV-1 工藝研究和提高重組HSV-1 質(zhì)量具有重要價值。

經(jīng)細胞培養(yǎng)生產(chǎn)病毒疫苗或治療藥物是病毒制劑制備的主要方式，其中，就病毒制劑而言，顆粒性病毒是基礎(chǔ)。病毒在細胞內(nèi)復(fù)制過程中產(chǎn)生多種組裝形式［13-15］，如完整病毒顆粒、無核酸的空心顆粒、病毒亞單位等。不同制備工藝產(chǎn)生的各種組裝比例有較大差別，提高顆粒病毒產(chǎn)率是病毒制備工藝優(yōu)化的方向。完整病毒量可以通過細胞培養(yǎng)法檢測病毒滴度加以判定，但是存在周期長、通量小、成本高、技術(shù)要求高等不足［16］。PCR 法檢測雖然靈敏度高，但是，樣本易污染導(dǎo)致假陽、成本也比較高、且不能反映病毒顆粒性，不能用于病毒顆粒的質(zhì)控［17］。ELISA 法具有簡潔、準確、快速、通量大等特點，可根據(jù)需要開發(fā)出針對亞單位、顆?？乖臋z測試劑，用于工藝優(yōu)化和產(chǎn)品質(zhì)控。

本文所用的兩株單抗是用純化的病毒顆粒免疫小鼠制備的雜交瘤細胞，由雜交瘤細胞分泌的，單抗由病毒顆粒及其經(jīng)熱變性的病毒經(jīng)差減篩選獲得的，僅與病毒顆粒反應(yīng)。綜合Western blot 和ELISPOT 結(jié)果可得1F6 是針對gB 糖蛋白的構(gòu)單抗，2B1是針對gC 糖蛋白的單抗，且gC 和gB 之間沒有相互作用［18，19］，只有病毒在形成顆粒時才能通過這對抗體的雙抗體夾心檢測出來，所以，這兩株單抗是檢測病毒顆粒的且本方法檢測的病毒抗原活性與蝕斑法檢測的病毒滴度具有很好的相關(guān)性，r=0.93，據(jù)此推測本方法可初步用于病毒制備的顆粒檢測甚或病毒滴度檢測，為加快重組HSV-1 的工藝研究進程提供了快速檢測方法。

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