免疫治療不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)患者群體反應(yīng)抗體、TGF-β 和nTreg表達(dá)變化的研究

任興斌 張 偉 (臨沂市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，臨沂 276003)

反復(fù)自然流產(chǎn)是妊娠常見并發(fā)癥之一，發(fā)病率高，病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，排除血型不合、解剖、內(nèi)分泌、感染等因素后，有40%～60%的患者原因不明，近年來研究發(fā)現(xiàn)，不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)與患者體內(nèi)心磷脂抗體等自身抗體的升高、母胎免疫識(shí)別的低下和過度等所形成的免疫功能紊亂有關(guān)［1，2］，且有研究表明維持機(jī)體免疫平衡的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子3陽性的天然調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(nTreg，CD4+CD25+FOXP3+)在URSA 患者外周血及蛻膜組織中的表達(dá)顯著低于健康妊娠孕婦［3］。近年來，在知情同意的原則下應(yīng)用患者配偶單個(gè)核細(xì)胞對(duì)具有適應(yīng)癥的URSA 患者進(jìn)行免疫治療成為為患者重建母胎免疫平衡從而達(dá)到成功妊娠目的的重要治療手段并得到廣泛應(yīng)用，但治療后的效果評(píng)估指標(biāo)和成功與否的成因機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。為此，筆者分別檢測(cè)了正常生育者、URSA 患者免疫治療后未孕者和成功妊娠者血清群體反應(yīng)抗體(PRA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)水平及外周血單個(gè)核細(xì)胞nTreg 表達(dá)率并作比較分析，探討其在免疫治療中的臨床意義，報(bào)道如下:

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 URSA 免疫治療組 隨機(jī)選取2011 年2 月至2013 年6 月間在我院做相關(guān)檢查并進(jìn)行免疫治療的原發(fā)性URSA 患者，其磷脂抗體、血型抗體、精子抗體等自身抗體均為陰性，排除解剖、內(nèi)分泌、染色體、感染等因素，男方精子各項(xiàng)參數(shù)正常。入組時(shí)經(jīng)1 個(gè)周期2 個(gè)療程的免疫治療，經(jīng)免疫治療后未孕組28 例(28～34 歲)，成功妊娠組32 例(27～32歲)。

1.1.2 正常妊娠組 26 例(26～32 歲)，正常妊娠4～6 個(gè)月，男女雙方均無內(nèi)分泌及免疫性疾患史，接受免疫學(xué)檢查時(shí)處于正常妊娠狀態(tài)。

1.2 免疫治療方法 采取患者配偶肝素抗凝靜脈血40～50 ml，常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，經(jīng)患者上肢皮內(nèi)6 點(diǎn)注射免疫療法，間隔3 周免疫1 次，3 次為1 療程，第一療程結(jié)束2 周后，安排受孕，并繼續(xù)第二療程的治療，至第二療程結(jié)束后檢測(cè)本研究的各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 樣本的采集與處理 采取URSA 患者或正常妊娠組女性待檢者全血4 ml，分裝2 管，1 管肝素抗凝常規(guī)分離PBMC，調(diào)細(xì)胞濃度至1 ×107ml-1，用于檢測(cè)nTreg。另1 管自凝，1 h 內(nèi)分離出血清，超低溫冰箱保存，用于PRA 抗體、TGF-β 檢測(cè)。

1.4 儀器、試劑與檢測(cè)方法

1.4.1 儀器、試劑 采用Beckman-Coulter 公司的EPICS-XL4 型流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述處理后單個(gè)核細(xì)胞的nTreg 表達(dá)率。Human T Regulatory T cell staining kit(其中含有抗人CD4-FITC 抗體、抗人CD25-PE 抗體、抗人FOXP3-PE-Cy5 抗體以及配套的固定和透膜試劑)，購(gòu)自eBioscience 公司，TGF-β 定量ELISA 試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司。主要設(shè)備為三洋超低溫冰箱、BioTek-ELX800 酶標(biāo)儀、Beckman-Coulter公司EPICS-XL4型流式細(xì)胞儀等。

1.4.2 檢測(cè)方法

1.4.2.1 PRA 的測(cè)定 采用美國(guó)oneLamhda 公司的萊姆德抗原板(LAT1240)酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELIASA)，嚴(yán)格按試劑盒操作說明書操作。萊姆德抗原Terasaki 微孔板每人份40 孔，包被有21 種HLA-A 抗原，44 種HLA-B 抗原，15 種HLA-Cw 抗原和18 種HLA-DR 抗原、7 種HLA-DQ 抗原、23 種HLA-DP 抗原，可同時(shí)檢測(cè)血清中的HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ類抗體。結(jié)果判斷:PRA 總陽性率(%)=(陽性反應(yīng)數(shù)÷40)×100%。

1.4.2.2 Human TGF-β 檢測(cè)按試劑盒說明書操作，集中檢測(cè)。

1.4.2.3 nTreg 檢測(cè) 常規(guī)分離PBMC，取細(xì)胞懸液100 μl 分別加10 μl CD4-FITC 和CD25-PE 后，孵育30 min，PBS 洗1 次，再加入1 ml 經(jīng)過稀釋的固定、透膜劑，反應(yīng)40 min 后以透膜緩沖液洗滌并重懸，再加入15 μl PE-Cy5 標(biāo)記FOXP3 抗體(同時(shí)設(shè)同型對(duì)照反應(yīng)管)，反應(yīng)30 min 后洗滌，以500 μl PBS 重懸，采用Beckman-Coulter 公司EPICS-XL4 型流式細(xì)胞儀，在FSC-SSC 散點(diǎn)圖上選定淋巴細(xì)胞群，以CD4 和SSC 設(shè)門，選擇CD4+細(xì)胞，分析CD25+FOXP3+細(xì)胞所占比例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，病例資料呈非正態(tài)分布，以Kruskal-Wallis法檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間兩兩比較采用Bonferroni 法，P＜0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

正常妊娠婦女血清PRA 陽性率中位數(shù)為7.5%;TGF-β 含量中位數(shù)為:190.65 pg/L;nTreg 表達(dá)率中位數(shù)為:11.35%。經(jīng)免疫治療后URSA 患者未孕組、妊娠組PRA 陽性率中位數(shù)分別為:27.5%、68.75%(P＜0.01);TGF-β含量中位數(shù)分別為:107.7 pg/L、189.4 pg/L(P＜0.01);nTreg 表達(dá)率中位數(shù)分別為:5.05%、8.05%(P＜0.01)。免疫治療后URSA 未孕組患者在血清PRA 陽性率、TGFβ 含量及nTreg 表達(dá)率中位數(shù)均低于免疫治療后妊娠組患者。除正常妊娠組與USRA 治療后妊娠組在血清TGF-β 含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其余各組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果見表1、2。

表1 正常妊娠組、URSA 患者免疫治療后未孕組及妊娠組血清PRA、TGF-β 和nTreg 的比較Tab.1 Comparison of PRA，TGF-β and nTreg among normal pregnancy group，unpregnancy group after immunotherapy and pregnancy group after immunotherapy

表2 正常妊娠組、URSA 患者免疫治療后未孕組及妊娠組血清PRA、TGF-β 和nTreg 的兩兩比較Tab.2 Paired-comparisons of PRA，TGF-β and nTreg among normal pregnancy group，unpregnancy group after immunotherapy and pregnancy group after immunotherapy

3 討論

生殖免疫學(xué)研究認(rèn)為妊娠是一種同種半異體移植現(xiàn)象，胚胎可看作是具有父系和母系各50% 遺傳物質(zhì)的同種移植物。妊娠中胎兒作為一種同種半異體抗原不被母體排斥反而產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答有賴于母體對(duì)胎兒的半同種異體移植免疫耐受。群體反應(yīng)性抗體(Panel reactive antibodies，PRA)是指患者血清內(nèi)的抗人類白細(xì)胞抗原(HLA)的抗體，該抗體主要出現(xiàn)在輸血、生育、組織及器官移植等人群中。人類白細(xì)胞抗原(HLA)是由位于人類第6 號(hào)染色體短臂上有224 個(gè)基因座的人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體(HLA 復(fù)合體)編碼產(chǎn)生的主要表達(dá)在細(xì)胞膜表面的一組蛋白，擔(dān)負(fù)著控制細(xì)胞間相互識(shí)別、抗原處理和提呈、參與T 細(xì)胞分化、誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等生物學(xué)作用和功能。李立新等［4］大量前期的免疫治療結(jié)果報(bào)道顯示:夫婦間HLA 抗原的相容程度與URSA 有關(guān)、在正常妊娠中父系HLA 抗原刺激母體產(chǎn)生稱為封閉抗體的相應(yīng)抗體并與胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞的HLA 抗原形成復(fù)合物，保護(hù)胎盤免受母體免疫細(xì)胞的損傷。免疫治療過程中分離的URSA 患者配偶的PBMC 包括了富含HLA-Ⅰ抗原的淋巴細(xì)胞、血小板及表達(dá)HLA-Ⅱ類抗原的單核細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞，其配偶PBMC 中HLA 抗原成分及免疫源特性和URSA 患者的反應(yīng)性不同，產(chǎn)生相應(yīng)抗體的幾率和數(shù)量會(huì)有差異。LAT1240PRA 檢測(cè)試劑中具備能檢測(cè)HLA-Ⅰ類抗原和HLA-Ⅱ類抗原亞型抗體的檢測(cè)能力，能較全面地反映URSA 患者經(jīng)免疫治療后封閉抗體的產(chǎn)生狀態(tài)，因URSA 患者的個(gè)體狀態(tài)及其對(duì)配偶HLA 抗原相容度的差異，相應(yīng)抗體的產(chǎn)生種類和數(shù)量及對(duì)自身免疫系統(tǒng)的影響也會(huì)不同，從而影響個(gè)體的免疫再平衡狀態(tài)。本研究PRA 檢測(cè)結(jié)果顯示:URSA 患者經(jīng)免疫治療后妊娠組血清PRA陽性率較免疫治療后未孕組明顯提高(P＜0.01)，提示URSA 患者經(jīng)過其配偶PBMC 免疫治療后，在提升URSA 患者自身免疫耐受和免疫抑制功能的同時(shí)，產(chǎn)生的針對(duì)其配偶HLA 抗原的封閉抗體，抑制了URSA 患者對(duì)其胚胎父系抗原的處理和提呈，下調(diào)了免疫應(yīng)答強(qiáng)度，對(duì)克服URSA 及后續(xù)的成功妊娠起到了首要作用。

URSA 患者母胎免疫耐受的失衡及流產(chǎn)的發(fā)生，與激活患者體內(nèi)T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答相關(guān)，而調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在維持免疫應(yīng)答平衡發(fā)揮著重要作用，按表面標(biāo)記分類，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞可分為CD4+和CD8+兩大類。CD4+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞又可分為天然型調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(nTreg，CD4+CD25+FOXP3+)和誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞Tr1 和Th3，Th3 調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞主要通過分泌TGF-β 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［5］。

TGF-β 是一種重要的內(nèi)源性免疫抑制因子，通過自分泌或者旁分泌的形式抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖、分化和活化，抑制抗原提呈細(xì)胞表面HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ類分子表達(dá)，抑制NK 活性以及抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生如抑制PBMC 中IFN-γ、TNF-α 的產(chǎn)生和IL-2等促炎性細(xì)胞因子的功能，促進(jìn)B 細(xì)胞分泌Ig 類型轉(zhuǎn)換為IgA 和IgE 和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)如膠原蛋白、纖黏連蛋白的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生、增殖和分化過程起著重要作用，有利于胚胎發(fā)育和細(xì)胞修復(fù)［6］。故TGF-β 起著以“負(fù)調(diào)節(jié)”為主的免疫平衡調(diào)節(jié)作用。本研究顯示URSA 未孕組患者TGF-β水平較正常妊娠組明顯降低(P＜0.01)，提示患者免疫抑制功能缺陷，使其對(duì)父系抗原的反應(yīng)性增強(qiáng)，促使了URSA 的發(fā)生。經(jīng)免疫治療后，父系PBMC誘導(dǎo)URSA 患者調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞效應(yīng)分子TGF-β 的表達(dá)達(dá)上調(diào)，抑制了URSA 患者對(duì)胚胎抗原的排斥反應(yīng)，緩解了URSA 患者的免疫失衡狀態(tài)，使胚胎能正常著床和發(fā)育，達(dá)到URSA 患者成功妊娠的目的。而未孕組免疫治療后TGF-β 含量較成功妊娠組明顯偏低，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，也提示部分URSA 患者TGF-β 偏低是免疫治療后不能成功妊娠的因素之一。

具有FOXP3 特異性標(biāo)志的nTreg 在胸腺中分化發(fā)育成熟后進(jìn)入外周淋巴組織，主要通過細(xì)胞接觸的方式，抑制Th1 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答及B 細(xì)胞增殖，在維持機(jī)體免疫自穩(wěn)、調(diào)控免疫應(yīng)答方面起重要作用。本研究結(jié)果顯示，治療組URSA 患者外周血nTreg 表達(dá)率均較正常妊娠組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，未孕組nTreg 表達(dá)率也明顯低于妊娠組(P＜0.01)。提示URSA 患者由于nTreg 細(xì)胞數(shù)量減少或功能受損，減弱了對(duì)T 細(xì)胞免疫功能的抑制作用，成為URSA 發(fā)病的主要原因，患者經(jīng)免疫治療刺激后，伴隨著nTreg 細(xì)胞表達(dá)數(shù)量的增高，免疫抑制作用逐漸增強(qiáng)，減弱了患者對(duì)胚胎半抗原的免疫排斥反應(yīng)，維持了正常的免疫平衡，達(dá)到能夠成功妊娠的目的。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)URSA 患者經(jīng)免疫治療后，產(chǎn)生的針對(duì)其配偶HLA 抗原的保護(hù)性抗體，下調(diào)了母體的免疫應(yīng)答強(qiáng)度，降低了母體對(duì)胎兒父系抗原的遞呈作用并逐漸形成耐受狀態(tài)，同時(shí)患者TGF-β 及nTreg 的水平提高和表達(dá)增強(qiáng)協(xié)同增加了對(duì)患者免疫反應(yīng)的抑制強(qiáng)度，達(dá)到了患者母胎免疫耐受的重新平衡而成功妊娠。PRA、TGF-β 及nTreg 的檢測(cè)對(duì)及時(shí)采取合適的免疫劑量和頻率進(jìn)行免疫治療，減少治療過程中的不良反應(yīng)，提高妊娠的成功率有重要意義。但針對(duì)治療前后不同時(shí)段各類HLA 抗原亞型抗體的作用、URSA 患者的個(gè)體差異和反應(yīng)性、免疫治療的作用機(jī)制和療效動(dòng)態(tài)觀測(cè)指標(biāo)的篩選等問題尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和創(chuàng)新研究方法繼續(xù)研究探討。

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