亞硒酸鈉對Graves 病患者外周血中Treg 細(xì)胞的影響①

楊 渝 劉 純 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 400016)

由Robert Graves 于1835 年明確提出并詳細(xì)報(bào)道的Graves 病(Graves disease，GD)，屬于器官特異性自身免疫性疾病，Th1/Th2 細(xì)胞(Helper T cells，輔助性T 細(xì)胞)失衡為其主要發(fā)病機(jī)制［1］。近來，人們發(fā)現(xiàn)Treg 細(xì)胞也參與GD 發(fā)病。Treg 細(xì)胞(Regulatory T cells，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞)是一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，由CD4+T 細(xì)胞分化而來，可以通過抑制效應(yīng)T 細(xì)胞的功能抑制免疫反應(yīng)，其標(biāo)志物為轉(zhuǎn)錄因子Foxp3(forkhead/winged helix transcription factor p3，叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子)，還可分泌IL-10、IL-35 等細(xì)胞因子。

硒是人體重要的微量元素之一，具有清除自由基、調(diào)節(jié)免疫與代謝、拮抗有毒物質(zhì)、促進(jìn)生殖等功能。研究發(fā)現(xiàn)，血硒水平與TRAb 水平之間呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系，而TRAb 水平與復(fù)發(fā)之間明確正相關(guān)［2］。臨床醫(yī)生將硒用于GD 的治療，發(fā)現(xiàn)硒與抗甲狀腺藥物聯(lián)合運(yùn)用可以使甲功更快恢復(fù)正常［3］，可見，硒制劑的應(yīng)用對GD 的治療有益。目前，硒在細(xì)胞水平對GD 的免疫功能影響尚少見報(bào)道，本文將探討硒對GD 患者PBMC(peripheral blood mononuclear cells，外周血單核細(xì)胞)中Treg 細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 GD 組:30 名病例選自2014 年3月至2014 年5 月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科門診首次診斷GD，未服用任何抗甲狀腺藥物的就診對象。所有患者均符合2008 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì)制定的《中國甲狀腺疾病診治指南》中Graves 病的診斷標(biāo)準(zhǔn):①臨床甲亢癥狀和體征;②甲狀腺彌漫性腫大(觸診和B 超可證實(shí))，少數(shù)病例可以無甲狀腺腫大;③血清TSH 濃度降低，甲狀腺激素濃度升高。健康對照(Healthy control，HC)組:抽取性別、年齡匹配的健康人群18 名。入選者均排除其他甲狀腺疾病及其他自身免疫性疾病、肝腎疾病、惡性腫瘤及嚴(yán)重感染性疾病，未使用免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)藥物及含硒制劑。所有研究對象均簽署知情同意書，并報(bào)倫理委員會(huì)審批。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 anti-CD3、anti-CD28(美天旎，德國);亞硒酸鈉(Sigma，美國);RPMI1640、胎牛血清(Hyclone，美國);RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBE GREEN(TaKaRa，日本);IL-35 ELISA 試劑盒(基因美，中國)

1.3 標(biāo)本采集 收集研究對象靜脈血12 ml，4 ml EDTA 促凝，留取血清。8 ml 肝素鈉抗凝，送至實(shí)驗(yàn)研究中心，離心后收集血漿凍存于-80℃。運(yùn)用Ficoll 密度梯度離心法分離出PBMC 備用。

1.4 化學(xué)發(fā)光法檢測FT3、FT4、TSH、TPOAb、TRAb 使用美國UniCel DxI 800(Beckman Coulter，美國)自動(dòng)免疫測定儀進(jìn)行測定，美國Beckman 試劑盒檢測FT3、FT4、TSH、TPOAb、TgAb，德國Roch 試劑盒檢測TRAb，各試劑盒批內(nèi)變異及批間變異均＜10%。正常參考值范圍:FT3∶3.37～6.01 pmol/L;FT4∶7.85～14.41 pmol/L;TSH∶0.35～3.5 mU/L;TgAb∶＜4 U/ml;TPOAb∶＜9 U/ml;TRAb:0.3～1.8 U/L。

1.5 血清硒濃度檢測 取每例研究對象凍存血清2 ml，原子熒光光譜法(Atomic fluorescence spectrometry，AFS)檢測。

1.6 MTT 法 將PBMC 接種于96 孔板，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5 ×104個(gè)/孔，體積200 μl/孔。每孔各加anti-CD3 100 ng、anti-CD28 100 ng。分別加入四個(gè)濃度的亞硒酸鈉:10-5、10-6、10-7、10-8mmol/L。37℃，5%CO2培養(yǎng)72 h 后每孔加入20 μl MTT(5mg/ml，PBS 溶解)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 000 r/min，10 min 離心，棄去上清，加入150 μl DMSO 溶解結(jié)晶。隨后上自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm 檢測每孔吸光值(A)，選取吸光值(A)最高的濃度10-6mmol/L 為最佳濃度。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng) 將分離的PBMC 接種入24 孔板，每孔調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2 ×106個(gè)，體積1 ml。加入RPMI1640、anti-CD3 1 μg、anti-CD28 1 μg。根據(jù)亞硒酸鈉處理與否，每例研究對象均分為兩組，一組加入亞硒酸鈉進(jìn)行處理(處理后)，另一組加入含血清培養(yǎng)基作為對照(處理前)，于37℃，5% CO2培養(yǎng)72 h。

1.8 RNA 提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測Foxp3 mRNA PBMC 培養(yǎng)后，按說明書步驟提取總RNA及逆轉(zhuǎn)錄。引物序列見表1。上機(jī)擴(kuò)增程序?yàn)?5℃，30 s;95℃，5 s;60℃，30 s;重復(fù)39 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系(10 μl):cDNA 1 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，SYBE GREEN 5 μl，雙蒸水3.2 μl。熒光定量PCR 儀(CFX 96 Real-Time System，Bio-RAD，美國)讀取循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct)，以未用亞硒酸鈉處理的HC 組為對照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組目的基因的表達(dá)水平。

1.9 ELISA 法檢測IL-35 濃度 取細(xì)胞培養(yǎng)后凍存的上清液，具體操作按說明書步驟進(jìn)行。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均錄入SPSS17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的指標(biāo)采用±s，非正態(tài)分布采用中位數(shù)±IQR 表示。符合正態(tài)分布的兩組之間采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布兩組之間采用Willcoxon 秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲功及相關(guān)抗體水平 GD 組甲狀腺功能指標(biāo)中FT3、FT4 明顯高于HC 組，TSH 降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。GD 組TgAb、TPOAb、TRAb的水平均較HC 組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。見表2。

2.2 血清硒濃度 GD 組血清硒(49.4 ±15.56 μg/L)低于HC 組血清硒(84.85 ±18.27)μg/L，兩組血清硒水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

表2 兩組研究對象甲狀腺功能及抗體水平Tab.2 Thyroid function and antibody levels of subjects in two groups

表3 亞硒酸鈉處理前后Foxp3 mRNA 表達(dá)水平比較Tab.3 Expression of Foxp3 mRNA before and after intervention of sodium selenite

表4 亞硒酸鈉處理前后IL-35 水平的變化Tab.4 Levels of IL-35 before and after intervention of sodium selenite

圖1 亞硒酸鈉處理前后Foxp3 mRNA 表達(dá)水平比較Fig.1 Expression of Foxp3 mRNA before and after the intervention of sodium selenite

2.3 Foxp3 mRNA 表達(dá)水平 未用亞硒酸鈉處理時(shí)，GD 組Foxp3 mRNA 的表達(dá)水平明顯低于HC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);亞硒酸鈉處理后，兩組的Foxp3 mRNA 表達(dá)水平均有增加，且較各組自身處理前有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3、圖1。

2.4 IL-35 的分泌水平 亞硒酸鈉處理前，HC 組PBMC 上清中，IL-35 的分泌水平明顯高于GD 組，兩組間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;亞硒酸鈉處理后，HC 組IL-35 的分泌水平較處理前增加，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;GD 組的IL-35 水平較處理前上升，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表4、圖2。

圖2 亞硒酸鈉處理前后IL-35 水平的變化Fig.2 Levels of IL-35 before and after the intervention of sodium selenite

3 討論

Treg 細(xì)胞由Gershon［4］于1971 年首次報(bào)道，具有免疫抑制作用，與自身疫功能密切相關(guān)。研究表明該細(xì)胞與GD 發(fā)病關(guān)系密切，Hu 等［5］發(fā)現(xiàn)GD 患者的Treg 細(xì)胞數(shù)量減少，轉(zhuǎn)錄因子FOXP3 表達(dá)量下降;Glick 等［6］將GD 患者外周血Treg 細(xì)胞與Teff細(xì)胞按一定比例共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)GD 患者Treg 細(xì)胞對效應(yīng)T 細(xì)胞的抑制功能明顯低于健康對照組;說明GD 發(fā)病可能是因?yàn)門reg 細(xì)胞數(shù)量和功能的下降，使得它對效應(yīng)T 細(xì)胞等的抑制能力降低，體內(nèi)免疫平衡被打亂。

Treg 細(xì)胞還分泌一種新型抑制性細(xì)胞因子—IL-35，該因子由Collison［7］2007 年在Nature 上首次對其功能進(jìn)行詳細(xì)闡述。IL-35 由EBI3(Epstein-Barr virus-induced gene 3，EB 病毒誘導(dǎo)基因3)和IL-12 的p35 亞基組成的異二聚體，屬于Ⅰ型細(xì)胞因子。IL-35 可促進(jìn)Treg 細(xì)胞增殖分化，同時(shí)，還可以抑制Th17 細(xì)胞的增殖與分化［8］。它在其他免疫疾病如EAE(Experimental autoimmune encepha-lomyelitis，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎)、葡萄膜炎、哮喘等均發(fā)揮著免疫保護(hù)作用［9-11］。但在GD 中目前尚少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)檢測了初發(fā)GD 患者血漿中IL-35水平，發(fā)現(xiàn)其較HC 組明顯降低。GD 中，Treg 細(xì)胞分泌IL-35 水平下降，由此，IL-35 對Treg 細(xì)胞增殖分化促進(jìn)作用減弱，導(dǎo)致Treg 細(xì)胞數(shù)量和功能持續(xù)降低。對效應(yīng)T 細(xì)胞等的抑制作用下降，促進(jìn)疾病進(jìn)展。IL-35 在GD 中的詳細(xì)作用需要進(jìn)一步研究。

硒蛋白GPx3(Glutathione peroxidases 3，谷胱甘肽過氧化物酶3)是維持甲狀腺與全身免受H2O2等氧化物質(zhì)氧化損傷的重要物質(zhì)，低硒可使其活性降低，加重甲狀腺自身免疫損傷;同時(shí)，細(xì)胞和體液免疫機(jī)理受損，全身免疫紊亂。另外，T 細(xì)胞內(nèi)含有與其功能密切相關(guān)的硒蛋白。Shrimali 等［12］報(bào)道，硒蛋白缺陷的小鼠CD4+單陽性T 細(xì)胞數(shù)量減少，在接收到TCR 信號(hào)刺激時(shí)，T 細(xì)胞增殖率降低，IL-2產(chǎn)量下降。IL-2 有促進(jìn)Treg 細(xì)胞增殖的作用［13］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GD 患者血清中明顯的低硒狀態(tài)，與國內(nèi)外報(bào)道相一致［14，15］。因此，低硒是促進(jìn)GD 進(jìn)展的重要因素。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，亞硒酸鈉處理后的Treg 細(xì)胞的相關(guān)因子有不同程度的變化。Treg 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 上升，細(xì)胞因子IL-35 增加，可見Treg 細(xì)胞的功能有所恢復(fù)。Xue 等［16］在自身免疫性甲狀腺炎小鼠補(bǔ)硒后，也看到了類似現(xiàn)象:Treg 細(xì)胞比例上調(diào)，F(xiàn)OXP3 表達(dá)增加。2010 年Hoffmann 等［17］報(bào)道不同的硒含量喂養(yǎng)小鼠來源的CD4+T 細(xì)胞對TCR 應(yīng)答不一，高硒喂養(yǎng)的小鼠T 細(xì)胞增殖率明顯增加，對TCR 信號(hào)應(yīng)答增強(qiáng)。硒一方面通過TCR信號(hào)的應(yīng)答改變，影響CD4+T 細(xì)胞的分化，另一方面，使得CD4+T 細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子如IL-2 等發(fā)生變化。據(jù)此推測，攝入高硒時(shí)使得CD4+T 細(xì)胞的分化向Treg 細(xì)胞偏移，而Treg 細(xì)胞的增加抑制效應(yīng)T 細(xì)胞的增殖，同時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫紊亂狀態(tài)，改善病情。

綜上，Treg 細(xì)胞數(shù)量和功能的下降，對效應(yīng)T細(xì)胞等的抑制能力降低，從而參與GD 發(fā)病，IL-35的減少使得免疫紊亂持續(xù)進(jìn)展。GD 患者血清硒明顯降低，低硒是促進(jìn)GD 進(jìn)展的重要誘因。亞硒酸鈉處理后Treg 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、細(xì)胞因子IL-35 增加較處理前增強(qiáng)，使Treg 細(xì)胞功能有所恢復(fù)，有助于GD 患者免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)。因此，補(bǔ)硒可以改善GD 患者的免疫功能狀態(tài)，但其詳細(xì)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］Graves R.Newly observed affection of the thyroid:clinical lectures［J］.London Med and Sur J，1835，7:516-517.

［2］Vrca VB，Skreb F，Cepelak I，et al.Supplementation with antioxidants in the treatment of Graves' disease;the effect on glutathione peroxidase activity and concentration of selenium［J］.Clinica Chimica Acta，2004，341(1):55-63.

［3］Wertenbruch T，Willenberg HS，Sagert C，et al.Serum selenium levels in patients with remission and relapse of Graves' disease［J］.Medicinal Chemistry，2007，3(3):281-284.

［4］Gershon RK，Kondo K.Infectious immunological tolerance［J］.Immunology，1971，21(6):903.

［5］Hu Y，Tian W，Zhang LL，et al.Function of regulatory T-cells improved by dexamethasone in Graves' disease［J］.Euro J Endoc，2012，166(4):641-646.

［6］Glick AB，Wodzinski A，F(xiàn)u P，et al.Impairment of regulatory T-cell function in autoimmune thyroid disease［J］.Thyroid，2013，23(7):871-878.

［7］Collison LW，Workman CJ，Kuo TT，et al.The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function［J］.Nature，2007，450(7169):566-569.

［8］Niedbala W，Wei X，Cai B，et al.IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells［J］.European journal of immunology，2007，37(11):3021-3029.

［9］Shen P，Roch T，Lampropoulou V，et al.IL-35-producing B cells are critical regulators of immunity during autoimmune and infectious diseases［J］.Nature，2014，507(7492):366-370.

［10］Wang RX，Yu CR，Dambuza IM，et al.Interleukin-35 induces regulatory B cells that suppress autoimmune disease［J］.Nature Medicine，2014，20(6):633-641.

［11］Whitehead GS，Wilson RH，Nakano K，et al.IL-35 production by ICOS+tregs reverses established IL-17-dependent allergic airways disease［J］.J Allergy Clin Immunol，2012，129(1):207.

［12］Shrimali RK，Irons RD，Carlson BA，et al.Selenoproteins mediate T cell immunity through an antioxidant mechanism［J］.Journal of Biological Chemistry，2008，283(29):20181-20185.

［13］Zheng SG，Wang J，Wang P，et al.IL-2 is essential for TGF-β to convert naive CD4+CD25-cells to CD25+Foxp3+regulatory T cells and for expansion of these cells［J］.J Immunol，2007，178(4):2018-2027.

［14］劉 莉，平智廣，朱本章.自身免疫性甲狀腺病患者血清硒水平［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2005，21(6):537-538.

［15］Kucharzewski M，Braziewicz J，Majewska U，et al.Concentration of selenium in the whole blood and the thyroid tissue of patients with various thyroid diseases［J］.Biological Trace Element Research，2002，88(1):25-30.

［16］Xue H，Wang W，Li Y，et al.Selenium upregulates CD4(+)CD25(+)regulatory T cells in iodine-induced autoimmune thyroiditis model of NOD.H-2(h4)mice［J］.Endoc J，2009，57(7):595-601.

［17］Hoffmann FKW，Hashimoto AC，Shafer LA，et al.Dietary selenium modulates activation and differentiation of CD4+T cells in mice through a mechanism involving cellular free thiols［J］.J Nutrit，2010，140(6):1155-1161.