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    金鳳顆粒對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)軟骨MMP-1/TIMP-1 表達(dá)影響①

    2015-03-18 11:42:00王曉倩郭建生朱克儉
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2015年6期
    關(guān)鍵詞:金鳳痛風(fēng)性家兔

    王曉倩 李 鑫 郭建生 朱克儉

    (湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410208)

    痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(Gouty arthritis,GA)是一種由于體內(nèi)嘌呤代謝異常,使尿酸鈉在關(guān)節(jié)腔內(nèi)沉積形成結(jié)晶,造成關(guān)節(jié)腫脹、變形的結(jié)晶性關(guān)節(jié)炎[1]。隨著居民大量的攝食蛋白質(zhì)及富含嘌呤成分的食物,痛風(fēng)已成為影響我國(guó)人口健康的重大代謝性疾病之一,引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)切[2]。

    研究認(rèn)為,痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制主要為血液中尿酸含量升高,達(dá)到飽和狀態(tài)形成尿酸鈉微結(jié)晶。當(dāng)關(guān)節(jié)腔內(nèi)的尿酸鹽結(jié)晶被白細(xì)胞吞噬后,沉積并刺激關(guān)節(jié)滑膜、軟骨及關(guān)節(jié)周?chē)M織,釋放出組胺、趨化因子及相關(guān)前炎癥因子等物質(zhì),使調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的基質(zhì)金屬蛋白酶-1(Matrix metalloproteinases,MMP-1)高表達(dá),導(dǎo)致MMP-1/TIMP-1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMP-1,組織金屬蛋白酶抑制劑-1)失衡,關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生病理性改變[3],導(dǎo)致局部血管擴(kuò)張、白細(xì)胞大量聚集,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[4],形成痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[5]。

    目前臨床治療痛風(fēng)以緩解癥狀為主,多使用秋水仙堿、吲哚美辛等非甾體類(lèi)化學(xué)藥品。然而上述藥物的使用并不能延緩病情發(fā)展,且存在腹瀉、血小板減少等副作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,痛風(fēng)以脾、腎虧虛為本,痰瘀、濕熱為標(biāo),痰瘀為病之變,濕熱為病之現(xiàn)[6]。中醫(yī)藥治療痛風(fēng)不僅療效確切,且安全性高。本課題組擬研發(fā)治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的創(chuàng)新中藥——金鳳顆粒,該藥由萆薢、鳳尾草、艾葉、金錢(qián)草等組成。前期研究顯示,金鳳顆粒能顯著降低氧嗪酸鉀鹽所致高尿酸血癥小鼠的尿酸水平[7],能有效抑制TNF-α、IL-8、IFN-γ 等促炎性因子釋放[8]。本研究擬建立痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)兔模型,研究金鳳顆粒對(duì)關(guān)節(jié)病理?yè)p傷及關(guān)節(jié)軟骨MMP-1/TIMP-1 的影響,進(jìn)而明確其治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制,為其臨床治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供科學(xué)實(shí)證依據(jù)。

    在開(kāi)展本實(shí)驗(yàn)研究工作前均簽署動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查書(shū),且所有工作的進(jìn)行均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)條件及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)的相關(guān)要求及所有規(guī)定。

    1 材料與方法

    1.1 試藥及試劑

    1.1.1 受試藥物 金鳳顆粒(No.140301),湖南省中醫(yī)藥研究院;腺嘌呤(No.0183),英國(guó)Amresco 公司;尿酸鈉(No.U2875),美國(guó)Sigma 公司;鹽酸乙胺丁醇片(No.1304041),沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司;別嘌醇片(No.20140108),廣東彼迪藥業(yè)有限公司;痛風(fēng)定膠囊(No.1405112),四川升和藥業(yè)股份有限公司。

    1.1.2 試劑 兔抗人MMP-1(No.BA0568)、TIMP-1(No.BA0575)多克隆抗體,SABC 免疫組化染色試劑盒(No.SA1022),DAB 顯色試劑盒(No.AR10 22),武漢博士德生物工程有限公司;甲醛溶液(No.20140204),天津市百世化工有限公司。

    1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭家兔,雄性,體重1.5~2 kg,湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,合格證編號(hào):SCXK(湘)2011-0003。

    1.2 方法

    1.2.1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎家兔模型建立[9]取新西蘭家兔70 只,按體重進(jìn)行隨機(jī)化分組,分為空白組(10只)和模型組(60 只)。模型組灌服腺嘌呤(200 mg/kg)和乙胺丁醇(250 mg/kg),1 次/d,連續(xù)7 d。末次給藥后30 min,將10%MSU 混懸液經(jīng)上髕骨韌帶(關(guān)節(jié)伸直45°,4 號(hào)針頭進(jìn)針,插入脛骨肌腱內(nèi)側(cè))注射入兔右踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腔,0.3 ml/只,復(fù)制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。

    1.2.2 分組及給藥 模型成功后,按體重進(jìn)行隨機(jī)化分組,分為模型組、金鳳顆粒高、中、低劑量組(19.6、9.8、4.9 g/kg)、別嘌醇組(0.028 g/kg)及痛風(fēng)定組(0.448 g/kg)。各組分別給予相應(yīng)藥液,模型組、空白組給予等容積蒸餾水,ig 給藥,8 ml/kg,1次/d,連續(xù)7 d。

    1.2.3 金鳳顆粒對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎家兔關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài)學(xué)改變的影響 末次給藥24 h 后,麻醉家兔,取關(guān)節(jié)軟骨組織,10 %甲醛溶液固定,將軟骨病理標(biāo)本做成蠟塊,間斷連續(xù)切片,切片厚約5 μm,HE 染色,采用盲法實(shí)驗(yàn)原則,選用未知分組人員觀察其病理形態(tài)學(xué)的改變,并評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1[10]。

    1.2.4 金鳳顆粒對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎家兔關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1、TIMP-1 表達(dá)的影響 末次給藥2 h 后,麻醉家兔,取關(guān)節(jié)軟骨組織,于10%甲醛溶液固定,行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作,采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP(鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶復(fù)合物)法檢測(cè)。每張切片選取5 個(gè)典型區(qū)域拍攝數(shù)碼圖像,使用圖像分析軟件分析各組照片的單位光密度值并進(jìn)行比較,根據(jù)光密度值的大小判斷各指標(biāo)表達(dá)水平。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS18.0 軟件分析,數(shù)據(jù)用±s 表示。組間比較,計(jì)量資料首先做正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),滿足方差齊性,采用Oneway ANOVA 進(jìn)行方差分析,不滿足方差齊性采用非參數(shù)法檢驗(yàn)。P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表1 關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)改變的組織學(xué)分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Histological classification criteria of synovial histologic change

    2 結(jié)果

    2.1 金鳳顆粒對(duì)家兔關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化的影響 空白組關(guān)節(jié)軟骨面完整,未見(jiàn)有血管充血、黏膜腫脹、炎細(xì)胞浸潤(rùn)及組織壞死,也未見(jiàn)有絨毛狀增生和血管翳形成。模型組家兔關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)紊亂,有血管充血及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),部分樣本關(guān)節(jié)軟骨組織壞死,與空白組比較,評(píng)分有顯著性差異(P<0.01),提示模型復(fù)制成功。經(jīng)金鳳顆粒治療后,各劑量組家兔關(guān)節(jié)軟骨組織血管充血、黏膜腫脹、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、組織壞死情況均有顯著的改善,差異具有顯著性(P<0.05 或P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2 及圖1。

    2.2 金鳳顆粒對(duì)家兔軟骨組織MMP-1、TIMP-1 表達(dá)影響 與空白組相比,模型組家兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-1 表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)、TIMP-1 表達(dá)顯著降低(P<0.01),提示模型建立成功。經(jīng)金鳳顆粒治療后,與模型組相比,高劑量組MMP-1 表達(dá)顯著降低(P<0.05),TIMP-1 表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)。中劑量組MMP-1 的表達(dá)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3,圖2、3。

    表2 關(guān)節(jié)軟骨改變的組織學(xué)分級(jí)評(píng)分結(jié)果(±s,n=10)Tab.2 Results of grading histological change of articular cartilage tissue(±s,n=10)

    表2 關(guān)節(jié)軟骨改變的組織學(xué)分級(jí)評(píng)分結(jié)果(±s,n=10)Tab.2 Results of grading histological change of articular cartilage tissue(±s,n=10)

    Note:1)P<0.01 as compared to the normal subject;2)P<0.05,3)P<0.01 as compared to the model subject.

    表3 金鳳顆粒對(duì)家兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-1、TIMP-1 及MMP-1/TIMP-1 影響(±s,n=10)Tab.3 Effect of Jinfeng granules on MMP-1,TIMP-1 and MMP-1/TIMP-1 in rabbit articular cartilage(±s,n=10)

    表3 金鳳顆粒對(duì)家兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-1、TIMP-1 及MMP-1/TIMP-1 影響(±s,n=10)Tab.3 Effect of Jinfeng granules on MMP-1,TIMP-1 and MMP-1/TIMP-1 in rabbit articular cartilage(±s,n=10)

    Note:1)P<0.01 as compared to the normal subject;2)P<0.05,3)P<0.01 as compared to the model subject.

    圖1 金鳳顆粒對(duì)家兔關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài)學(xué)影響(×400)Fig.1 Effect of Jinfeng granule on pathomorpholoy of rabbit articular cartilage tissue(×400)

    圖2 金鳳顆粒對(duì)家兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-1 表達(dá)的影響(×400)Fig.2 Effect of Jinfeng granule on expression of MMP-1 in rabbit articular cartilage tissue(×400)

    圖3 金鳳顆粒對(duì)家兔關(guān)節(jié)軟骨組織TIMP-1 表達(dá)的影響(×400)Fig.3 Effect of Jinfeng granule on expression of TIMP-1 in rabbit articular cartilage tissue(×400)

    3 討論

    MMP-1 是細(xì)胞外基質(zhì)降解最重要的蛋白系統(tǒng),參與了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)組織創(chuàng)傷修復(fù)與重塑、炎癥反應(yīng)等過(guò)程[11]。TIMP-1 是MMP-1 的天然拮抗劑,與活化的MMP-1 結(jié)合形成復(fù)合物,從而阻斷MMP-1 活性,維系MMP-1/TIMP-1 平衡[12]。有學(xué)者研究提示,MMP-1 活化濃度與關(guān)節(jié)炎癥密切相關(guān),MMP-1/TIMP-1 失衡可能是痛風(fēng)性炎癥病程中難以愈合的重要因素之一[13]。

    本研究發(fā)現(xiàn),模型組家兔關(guān)節(jié)軟骨組織排列紊亂,血管充血及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),部分樣本關(guān)節(jié)軟骨組織壞死,關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-1 顯著升高(P<0.01)、TIMP-1 顯著下降(P<0.01),MMP-1/TIMP-1 失衡(P<0.01)。提示機(jī)體受到MSU 晶體刺激后,MMP-1 表達(dá)增強(qiáng),TIMP-1 不同程度的丟失或低表達(dá),導(dǎo)致MMP-1/TIMP-1 失衡,對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力增強(qiáng),激活炎癥瀑布反應(yīng)而出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨組織嚴(yán)重充血、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、明顯腫脹、壞死,而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨嚴(yán)重受損。

    經(jīng)金鳳顆粒治療后,高劑量組MMP-1 得到明顯抑制(P<0.01),TIMP-1 表達(dá)明顯加強(qiáng)(P<0.05),MMP-1/TIMP-1 顯著降低(P<0.01);中劑量組MMP-1 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),MMP-1/TIMP-1趨向平衡(P<0.05);病理形態(tài)學(xué)改變也得到明顯改善(P<0.05 或P<0.01)。研究結(jié)果提示,金鳳顆粒的作用機(jī)制可能與通過(guò)抑制MMP-1 高表達(dá),加強(qiáng)TIMP-1 表達(dá),調(diào)節(jié)MMP-1/TIMP-1 平衡,阻斷炎癥反應(yīng)循環(huán)鏈,而實(shí)現(xiàn)其臨床療效。

    綜上,金鳳顆粒能有效抑制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病理?yè)p害,其作用機(jī)制可能是與通過(guò)阻斷MMP-1 活性,恢復(fù)MMP-1/TIMP-1 失衡有關(guān)。

    [1]黃雪芳.四妙散加味治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎臨床應(yīng)用[J].中外醫(yī)療,2012,31(4):139.

    [2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì).高尿酸血癥和痛風(fēng)治療的中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)[J].中華內(nèi)分泌代謝,2013,29(11):913-920.

    [3]Monika Merkle,Andrea Ribeiro,Simone Koppel.TNF-α enhances TLR3 dependent effects on MMP-9 expression in human mesangial cells[J].Cell Biol Int,2012,36(12):1155-1160.

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