• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    糖原合酶激酶-3β 抑制劑TWS119 對(duì)γδT 細(xì)胞增殖及表型的影響①

    2015-03-18 11:41:40陳永強(qiáng)劉軍權(quán)呂小婷周忠海陳復(fù)興
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2015年6期
    關(guān)鍵詞:純度表型淋巴細(xì)胞

    陳永強(qiáng) 鄭 璐 劉軍權(quán) 呂小婷 周 燏 陳 玲 徐 晶 周忠海 陳復(fù)興

    (解放軍第97 醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,徐州 221004)

    4,6-二取代吡咯并嘧啶(TWS119)是糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)抑制劑,目前研究發(fā)現(xiàn)TWS119 通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻滯CD8+T 淋巴細(xì)胞的分化獲得表達(dá)CD45RA+CD62L+CCR7+CD95+的干細(xì)胞樣記憶細(xì)胞(Stem cells memory T cells,TSCM)和CD45RA+CD62L+的早期分化細(xì)胞,這群細(xì)胞在體內(nèi)具有強(qiáng)增殖能力和抗腫瘤活性[1-3]。γδT 細(xì)胞是T 淋巴細(xì)胞中表達(dá)γδTCR 的一個(gè)亞群,約占外周血T 淋巴細(xì)胞的0.5%~5%,在機(jī)體的抗感染、抗腫瘤和免疫監(jiān)視等方面起到重要作用[4]。體外常規(guī)擴(kuò)增的γδT細(xì)胞已經(jīng)用于多種腫瘤的治療,并取得較好的療效[5]。為了提高γδT 細(xì)胞治療效果,我們認(rèn)為使回輸?shù)襟w內(nèi)的γδT 細(xì)胞能在體內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間的生存并能遷移到腫瘤部位,從而發(fā)揮有效的免疫監(jiān)視和殺傷腫瘤的作用至關(guān)重要。因此,本研究觀察TWS119 調(diào)控Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路對(duì)γδT 細(xì)胞增殖和表型的影響,以期獲得新型的γδT 細(xì)胞。

    1 材料與方法

    1.1 材料 TWS119 購(gòu)自Sigma 公司,用二甲亞砜(DMSO)溶解配制母液為8 mmol/L,實(shí)驗(yàn)時(shí)再用RPMI1640 培養(yǎng)液稀釋至各實(shí)驗(yàn)濃度(各實(shí)驗(yàn)組DMSO 終體積分?jǐn)?shù)≤0.1%),對(duì)照組中加入相同濃度的DMSO;RPMI1640 和小牛血清購(gòu)自Gibco 公司;人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司;重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2),異戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate,IPP)購(gòu)自廈門特寶生物工程股份有限公司;熒光抗體PerCPcy5.5-γδTCR、FITC-CD45RA 和PE-CD62L 和 流 式細(xì)胞儀均為美國(guó)Becton Dickson 公司產(chǎn)品;CCK-8試劑盒、BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒、Western 及IP 細(xì)胞裂解液和PVDF 膜均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;人AB 型血清購(gòu)自徐州市血站。

    1.2 方法

    1.2.1 γδT 細(xì)胞的培養(yǎng) 取健康獻(xiàn)血者外周抗凝血20 ml,加入淋巴細(xì)胞分離液,1 800 r/min 離心10 min,吸取人末梢血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)層,用生理鹽水洗滌,1 800 r/min 離心15 min。然后將PBMCs加入含10%小牛血清、5% AB 血清、1 μg/ml 的異戊烯焦磷酸和200 U/ml 的rhIL-2 的γδT 培養(yǎng)基中,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及時(shí)添加培養(yǎng)基。

    1.2.2 γδT 細(xì)胞鑒定 將培養(yǎng)10 d 的γδT 細(xì)胞在倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察,并用PerCP-cy5.5-γδTCR 抗體標(biāo)記細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表型檢測(cè),試驗(yàn)重復(fù)3 次。

    1.2.3 TWS119 活化Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中βcatenin 表達(dá)影響 取培養(yǎng)10 d 的γδT 細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1 ×105ml-1的細(xì)胞懸液,接種于6 孔板,每孔3 ml,然后加入終濃度分別為(0.0、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L)的TWS119,于37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞并用PBS 洗滌1 次后,用Western blot 及IP 細(xì)胞裂解液60 μl 充分裂解提取蛋白,BCA 法測(cè)樣品蛋白濃度后以10% SDS-PAGE分離,然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上,5%的脫脂奶粉封閉2 h,兔抗人β-catenin 和鼠抗人GAPDH 一抗(1∶500)4℃封閉過夜,堿性磷酸酶標(biāo)記抗鼠二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h。然后利用碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒,按照操作手冊(cè)進(jìn)行顯色。然后用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照記錄。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

    1.2.4 CCK-8 法檢測(cè)TWS119 對(duì)γδT 細(xì)胞增殖的影響 取培養(yǎng)10 d 的γδT 細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1.0 ×105ml,取180 μl 接種于96 孔板,加入終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L TWS119,每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h 后每孔加入20 μl 的CCK-8 液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后于570 nm 處測(cè)定光密度值。

    1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT 細(xì)胞上CD45RA 和CD62L 的表達(dá) 將培養(yǎng)成功的γδT 細(xì)胞配成濃度為1.0 ×105ml 的細(xì)胞懸液,接種于6 孔培養(yǎng)板,每孔3 ml,然后加入終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L 的TWS119。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞并用PBS 洗滌2 次,每管分 別 加 入10 μl 的PerCP-cy5.5-γδTCR、FITCCD45RA 和PE-CD62L,室溫避光孵育15 min,PBS洗滌后,重懸于0.5 ml 的PBS 溶液中,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD45RA 和CD62L 的表達(dá)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)以±s 表示,組間均值比較采用t 檢驗(yàn),P<0.05,P<0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 γδT 細(xì)胞鑒定 從健康獻(xiàn)血者外周血中分離獲得單個(gè)核細(xì)胞后用γδT 細(xì)胞的培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2 d 后γδT 細(xì)胞開始增殖,4 d 后呈集落式生長(zhǎng),到第8 天后出現(xiàn)許多大小不同的細(xì)胞集落,細(xì)胞成梭形(圖1A)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型,結(jié)果如圖1B 顯示,γδT 細(xì)胞比率達(dá)(76.85 ±4.85)%。以上結(jié)果提示γδT 細(xì)胞培養(yǎng)成功,可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

    圖1 γδT 細(xì)胞的鑒定Fig.1 Proportion of γδT cells

    2.2 TWS119 對(duì)γδT 細(xì)胞中β-catenin 蛋白表達(dá)影響 Wnt 信號(hào)通路在細(xì)胞分化過程中起關(guān)鍵作用,該通路可以被TWS119 通過抑制GSK-3β 活性使βcatenin 在細(xì)胞內(nèi)積聚而激活。將不同濃度TWS119培養(yǎng)的γδT 細(xì)胞經(jīng)Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著TWS119 濃度增加,γδT 細(xì)胞內(nèi)β-catenin 表達(dá)量逐漸增多,呈劑量依賴性,說明TWS119 可以激活γδT細(xì)胞中的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路(圖2)。

    2.3 TWS119 對(duì)培養(yǎng)γδT 細(xì)胞純度的影響 在γδT細(xì)胞培養(yǎng)過程中,分別于第1 天和第8 天時(shí),加入不同濃度的TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)到12 d 時(shí)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:第1 天加入TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)組中,濃度在0.5~2.0 μmol/L 時(shí)對(duì)γδT 細(xì)胞純度影響不明顯,與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P >0.05);濃度在4.0 和8.0 μmol/L 時(shí),與對(duì)照組相比能顯著抑制γδT 細(xì)胞純度(P<0.05,P<0.01)。而在第8 天加入TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)組中,在0.5~8.0 μmol/L 范圍內(nèi)能顯著提高γδT 細(xì)胞純度(P<0.05,P<0.01)。見圖3。

    2.4 TWS119 對(duì)γδT 細(xì)胞增殖影響 第1 天加入TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)組中,經(jīng)0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L 的TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d 后,CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果顯示,TWS119 濃度在2.0 μmol/L 時(shí)能促進(jìn)γδT細(xì)胞的增殖(P<0.05);當(dāng)濃度(>2.0 μmol/L)時(shí),顯著抑制γδT 細(xì)胞的增殖(P<0.05,P<0.01)。而在第8 天加入TWS119 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)到12 d 后,各濃度組增殖率分別為:(29.35 ±5.95)%、(40.53 ±4.12)%、(81.38 ± 6.33)%、(70.37 ± 5.85)%、(-11.29 ±3.86)%。與0 μmol/L TWS119 對(duì)照組相比,0.5~4.0 μmol/L 組增殖率顯著高于對(duì)照組(P<0.05,P<0.01),2.0 μmol/L TWS119 處理的γδT 細(xì)胞增殖率達(dá)到最高值(81.38±6.33)%;當(dāng)濃度增高到8.0 μmol/L 時(shí),增殖率低于對(duì)照組(圖4)。

    圖2 TWS119 對(duì)γδT 細(xì)胞中β-catenin 蛋白表達(dá)影響Fig.2 Western blot analysis of β-catenin expression in γδT cells

    圖3 TWS119 對(duì)培養(yǎng)γδT 細(xì)胞純度的影響Fig.3 Ratios of induced γδT cells under different concentrations of TWS119

    圖4 TWS119 對(duì)γδT 細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of treatment of TWS119 on γδT cell proliferative response

    表1 TWS119 對(duì)γδT 細(xì)胞CD45RA 和CD62L 表達(dá)的影響Tab.1 Effect of TWS119 on expression of CD45RA and CD62L in γδT cells

    圖5 TWS119 對(duì)γδT 細(xì)胞CD45RA 和CD62L 表達(dá)的影響Fig.5 Effect of TWS119 on expression of CD45RA and CD62L in γδT cells

    2.5 TWS119 對(duì)γδT 細(xì)胞表型的影響 經(jīng)不同時(shí)間加入不同TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)到12 d 后,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,不同加入時(shí)間和不同劑量對(duì)CD62L 和CD45RA 的表達(dá)有影響。如表1 和圖5 所示,濃度在0~8.0 μmol/L 范圍內(nèi)TWS119 能促進(jìn)γδT 細(xì)胞表面標(biāo)志CD62L 的表達(dá),且第1 天加入TWS119 誘導(dǎo)組CD62L 的表達(dá)要高于第8 天加入組。TWS119 對(duì)γδT 細(xì)胞表面標(biāo)志CD45RA 表達(dá)的影響結(jié)果中顯示,僅在第1 天加入TWS119 誘導(dǎo)組中4.0 μmol/L 和8.0 μmol/L 濃度組能顯著提高CD45RA 的表達(dá),而在第8 天時(shí)再加入TWS119 對(duì)CD45RA 的表達(dá)變化不明顯。

    3 討論

    Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是一條在生物進(jìn)化中極為保守的通路,在調(diào)控干細(xì)胞的自我更新、多潛能性和不同發(fā)育階段胸腺細(xì)胞的生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用[6,7]。最近研究人員為了在體外獲得最佳分化狀態(tài)的免疫細(xì)胞應(yīng)用以腫瘤過繼性免疫治療,發(fā)現(xiàn)用GSK-3β 抑制劑TWS119 活化T 淋巴細(xì)胞的Wnt/βcatenin 信號(hào)通路可以阻滯初始T 細(xì)胞向效應(yīng)T 細(xì)胞分化,獲得CD45RA+CD62L+早期分化的細(xì)胞和TSCM[2,8,9]。而且TSCM 細(xì)胞具備干細(xì)胞的特性,具有很強(qiáng)的增殖和分化能力,體內(nèi)腫瘤移植實(shí)驗(yàn)表明其體內(nèi)有很強(qiáng)的抑瘤活性,與其他效應(yīng)細(xì)胞相比在體內(nèi)生存期明顯延長(zhǎng)[10,11];用CD3/CD2/CD28 特異性抗體激活后與IL-7、IL-15 共培養(yǎng),TSCM 細(xì)胞也能有效的擴(kuò)增[12]。因此,我們?cè)谂囵B(yǎng)γδT 細(xì)胞時(shí)加入TWS119 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),首先觀察誘導(dǎo)前后γδT細(xì)胞的增殖和純度變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)γδT 細(xì)胞的第1 天加入TWS119 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)到12 d 時(shí),濃度在0.5~2.0 μmol/L 時(shí)對(duì)γδT 細(xì)胞的增殖和純度影響不明顯,當(dāng)濃度大于2 μmol/L 時(shí)能顯著抑制γδT 細(xì)胞的增殖和純度;而在第8 天加入TWS119誘導(dǎo)培養(yǎng)到12 d 時(shí),在0.5~4.0 μmol/L 范圍內(nèi)能顯著促進(jìn)γδT 細(xì)胞的增殖并能提高γδT 細(xì)胞的純度,當(dāng)濃度大于8.0 μmol/L 時(shí)γδT 細(xì)胞增殖率和純度降低。TWS119 加入誘導(dǎo)時(shí)間的不同對(duì)增殖和純度的影響可能跟細(xì)胞的分化狀態(tài)有關(guān)。

    根據(jù)T 細(xì)胞的表型和效應(yīng)功能可以分為初始T細(xì)胞、干細(xì)胞樣中樞記憶T 細(xì)胞、中樞記憶T 細(xì)胞、效應(yīng)記憶T 細(xì)胞和效應(yīng)T 細(xì)胞[13,14]。CD45RA 表達(dá)于初始細(xì)胞和記憶性干細(xì)胞,而L-選擇素(CD62L)屬于黏附分子超家族,廣泛分布于初始T細(xì)胞記憶性干細(xì)胞和中樞型記憶T 淋巴細(xì)胞表面,是淋巴細(xì)胞的特異性歸巢受體,在介導(dǎo)初始淋巴細(xì)胞歸巢到外周淋巴結(jié)和淋巴細(xì)胞在炎癥和腫瘤部位中起著至關(guān)重要的作用[15]。TWS119 對(duì)γδT 細(xì)胞表型影響研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)不同時(shí)間加入不同濃度的TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)γδT 細(xì)胞到12 d 后,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,濃度在0~8.0 μmol/L 范圍內(nèi),僅第1 天加入TWS119 誘導(dǎo)組中4.0 μmol/L 和8.0 μmol/L 濃度組能顯著提高CD45RA 的表達(dá)。而對(duì)CD62L 表達(dá)方面,TWS119 能促進(jìn)γδT 細(xì)胞表面標(biāo)志CD62L 的表達(dá),且第1 天加入TWS119 誘導(dǎo)組CD62L 的表達(dá)要高于第8 天加入組。提示用TWS119 誘導(dǎo)培養(yǎng)γδT 細(xì)胞可以阻滯或誘導(dǎo)CD45RA+和CD62L+的表達(dá),從而獲得CD45RA+CD62L+γδT 細(xì)胞和CD62L+γδT 細(xì)胞。

    本研究結(jié)論是TWS119 可以活化γδT 細(xì)胞Wnt/β-catenin 信號(hào)通路,在一定濃度范圍內(nèi)能促進(jìn)γδT 細(xì)胞增殖和提高γδT 細(xì)胞純度,同時(shí)能劑量依賴性調(diào)控CD45RA 和CD62L 的表達(dá)獲得CD45RA+CD62L+γδT 細(xì)胞和CD62L+γδT 細(xì)胞。我們研究結(jié)果為進(jìn)一步提高γδT 細(xì)胞治療腫瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但有關(guān)該群細(xì)胞具體的生物學(xué)特性、體內(nèi)抗腫瘤療效以及今后的于臨床腫瘤試治等有待進(jìn)一步研究。

    [1]Ding S,Wu TY,Brinker A,et al.Synthetic small molecules that control stem cell fate[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(13):7632-7637.

    [2]Gattinoni L,Lugli E,Ji Y,et al.A human memory T cell subset with stem cell-like properties[J].Nat Med,2011,17 (10):1290-1297.

    [3]Muralidharan S,Hanley PJ,Liu E,et al.Activation of Wnt signaling arrests effector differentiation in human peripheral and cord blood-derived T lymphocytes[J].J Immunol,2011,187(10):5221-5232.

    [4]Vantourout P,Hayday A.Six-of-the-best:unique contributions of γδ T cells to immunology[J].Nat Rev Immunol,2013,13(2):88-100.

    [5]Hannani D,Ma Y,Yamazaki T,et al.Harnessing γδ T cells in anticancer immunotherapy[J].Trends Immunol,2012,33 (5):199-206.

    [6]Serio RN.Wnt of the two horizons:putting stem cell self-renewal and cell fate determination into context[J].Stem Cells Dev,2014,23(17):1975-1990.

    [7]Kvell K,F(xiàn)ejes AV,Parnell SM,et al.Active Wnt/beta-catenin signaling is required for embryonic thymic epithelial development and functionality ex vivo[J].Immunobiology,2014,219(8):644-652.

    [8]Forget MA,Huon Y,Reuben A,et al.Stimulation of Wnt/β-catenin pathway in human CD8+T lymphocytes from blood and lung tumors leads to a shared young/memory phenotype[J].PLoS One,2012,7(7):e41074.

    [9]Muralidharan S,Hanley PJ,Liu E,et al.Activation of Wnt signaling arrests effector differentiation in human peripheral and cord blood-derived T lymphocytes[J].J Immunol,2011,187(10):5221-5232.

    [10]Gattinoni L,Klebanoff CA,Palmer DC,et al.Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+T cells[J].J Clin Invest,2005,115(6):1616-1626.

    [11]Hinrichs CS,Borman ZA,Cassard L,et al.Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+T cells mediate superior antitumor immunity[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(41):17469-17474.

    [12]Lugli E,Gattinoni L,Roberto A,et al.Identification,isolation and in vitro expansion of human and nonhuman primate T stem cell memory cells[J].Nat Protoc,2013,8(1):33-42.

    [13]Farber DL,Yudanin NA,Restifo NP.Human memory T cells:generation,compartmentalization and homeostasis[J].Nat Rev Immunol,2014,14(1):24-35.

    [14]Dieli F,Poccia F,Lipp M,et al.Differentiation of effector/memory Vdelta2 T cells and migratory routes in lymph nodes or inflammatory sites[J].J Exp Med,2003,198(3):391-397.

    [15]Brinkman CC,Peske JD,Engelhard VH.Peripheral tissue homing receptor control of naive,effector,and memory CD8 T cell localization in lymphoid and non-lymphoid tissues[J].Front Immunol,2013,4:241.

    猜你喜歡
    純度表型淋巴細(xì)胞
    遺傳性T淋巴細(xì)胞免疫缺陷在百草枯所致肺纖維化中的作用
    退火工藝對(duì)WTi10靶材組織及純度的影響
    建蘭、寒蘭花表型分析
    色彩的純度
    童話世界(2017年29期)2017-12-16 07:59:32
    間接滴定法測(cè)定氯化銅晶體的純度
    GABABR2基因遺傳變異與肥胖及代謝相關(guān)表型的關(guān)系
    慢性乙型肝炎患者HBV基因表型與血清學(xué)測(cè)定的臨床意義
    探討CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞在HCV早期感染的作用
    72例老年急性白血病免疫表型分析
    對(duì)氯水楊酸的純度測(cè)定
    丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美成人午夜免费资源| 精品一区二区三卡| 在线天堂最新版资源| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 草草在线视频免费看| 男女国产视频网站| 国产精品欧美亚洲77777| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久国内精品自在自线图片| 丝袜在线中文字幕| 国产精品久久久久久久久免| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲国产精品999| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲美女视频黄频| 精品少妇久久久久久888优播| 婷婷色综合www| a级毛色黄片| 久久狼人影院| 国产免费一级a男人的天堂| 少妇人妻 视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 成人无遮挡网站| 如何舔出高潮| 国产成人freesex在线| 国产成人精品久久久久久| 一区二区av电影网| 黑人欧美特级aaaaaa片| 青春草国产在线视频| 欧美97在线视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 婷婷色综合大香蕉| 黄色毛片三级朝国网站| 国产精品久久久久久久久免| 五月开心婷婷网| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲五月色婷婷综合| 夜夜爽夜夜爽视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 91成人精品电影| 黄色配什么色好看| 亚洲av成人精品一二三区| 久久影院123| 在线 av 中文字幕| 精品一区二区三卡| 母亲3免费完整高清在线观看 | 两个人免费观看高清视频| 九九在线视频观看精品| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 91精品国产国语对白视频| 热re99久久精品国产66热6| 午夜免费观看性视频| 人体艺术视频欧美日本| 69精品国产乱码久久久| 久久久久久伊人网av| 亚洲精品日韩av片在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 男女无遮挡免费网站观看| 伦理电影大哥的女人| 久久热精品热| 极品人妻少妇av视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 91精品国产国语对白视频| 国产 精品1| 免费黄网站久久成人精品| 人妻 亚洲 视频| 老司机影院毛片| 欧美最新免费一区二区三区| 久久热精品热| 色吧在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 在线观看www视频免费| av专区在线播放| 看十八女毛片水多多多| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产精品国产三级专区第一集| 中文欧美无线码| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 九色亚洲精品在线播放| 在线免费观看不下载黄p国产| 午夜精品国产一区二区电影| 国产成人精品一,二区| 97超碰精品成人国产| 岛国毛片在线播放| av.在线天堂| 街头女战士在线观看网站| 超色免费av| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 午夜精品国产一区二区电影| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产片特级美女逼逼视频| 国产成人精品一,二区| 日本黄大片高清| 777米奇影视久久| 春色校园在线视频观看| 国产av一区二区精品久久| 国产免费一级a男人的天堂| 日韩av免费高清视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 高清在线视频一区二区三区| 免费观看av网站的网址| 夫妻午夜视频| 亚洲人与动物交配视频| 十八禁网站网址无遮挡| 少妇人妻久久综合中文| 久久国内精品自在自线图片| 18+在线观看网站| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 99九九线精品视频在线观看视频| 99热这里只有精品一区| 成年美女黄网站色视频大全免费 | av视频免费观看在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看 | 国产永久视频网站| 在线观看国产h片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 伊人久久精品亚洲午夜| 精品国产一区二区久久| 99九九在线精品视频| 高清在线视频一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产成人精品一,二区| 满18在线观看网站| 91久久精品国产一区二区三区| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久av网站| 欧美日韩视频精品一区| 毛片一级片免费看久久久久| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 一级片'在线观看视频| 丝袜脚勾引网站| 久久久精品免费免费高清| 国产精品 国内视频| 国国产精品蜜臀av免费| 性色av一级| 国产在线视频一区二区| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品久久久久久av不卡| 极品少妇高潮喷水抽搐| 成人毛片60女人毛片免费| 国产亚洲欧美精品永久| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产成人一区二区在线| 国产一区二区在线观看av| 日本欧美国产在线视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 视频区图区小说| 国产免费一区二区三区四区乱码| 日韩电影二区| 免费观看a级毛片全部| 国产成人免费无遮挡视频| 91成人精品电影| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品免费大片| 999精品在线视频| 免费av不卡在线播放| 七月丁香在线播放| 国产成人aa在线观看| 欧美人与善性xxx| 精品国产一区二区久久| 美女国产高潮福利片在线看| 久久亚洲国产成人精品v| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 桃花免费在线播放| 少妇熟女欧美另类| 国产有黄有色有爽视频| 91久久精品国产一区二区三区| 成人二区视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 如何舔出高潮| 日本-黄色视频高清免费观看| 精品一区在线观看国产| av线在线观看网站| 美女大奶头黄色视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 在线观看www视频免费| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久久久久伊人网av| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美精品亚洲一区二区| 免费人成在线观看视频色| 黄色一级大片看看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 免费观看性生交大片5| 国产精品久久久久久精品电影小说| 中文字幕免费在线视频6| 日韩一区二区视频免费看| 欧美最新免费一区二区三区| 26uuu在线亚洲综合色| 国产视频首页在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 成人午夜精彩视频在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 老女人水多毛片| 日韩人妻高清精品专区| 性色avwww在线观看| 亚洲久久久国产精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 看免费成人av毛片| 搡老乐熟女国产| 欧美成人精品欧美一级黄| 人体艺术视频欧美日本| 色视频在线一区二区三区| 午夜福利视频在线观看免费| 一级,二级,三级黄色视频| 日日爽夜夜爽网站| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 国产一区二区在线观看日韩| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久久久国产网址| 激情五月婷婷亚洲| 国产成人精品一,二区| 午夜av观看不卡| 亚洲综合精品二区| 久久久久国产网址| 成人漫画全彩无遮挡| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品 国内视频| 精品少妇内射三级| 精品一品国产午夜福利视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品国产三级国产专区5o| 夫妻性生交免费视频一级片| 91久久精品国产一区二区三区| 高清毛片免费看| 亚洲精品视频女| 国产成人a∨麻豆精品| 精品一区二区三卡| 我的女老师完整版在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日本与韩国留学比较| 丰满少妇做爰视频| 黄色配什么色好看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 老女人水多毛片| 久久99蜜桃精品久久| 婷婷色综合www| 欧美人与善性xxx| 国产男人的电影天堂91| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品久久久久久久久亚洲| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品.久久久| 色哟哟·www| 亚洲不卡免费看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 中文字幕av电影在线播放| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲av.av天堂| 三级国产精品片| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产成人av激情在线播放 | av播播在线观看一区| 国产亚洲精品久久久com| 99国产精品免费福利视频| 成人国产av品久久久| 两个人的视频大全免费| 制服人妻中文乱码| 999精品在线视频| 大话2 男鬼变身卡| 一区二区三区免费毛片| 国产成人freesex在线| 亚洲av.av天堂| videossex国产| 午夜视频国产福利| av福利片在线| 一本大道久久a久久精品| a级片在线免费高清观看视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲精品456在线播放app| 欧美三级亚洲精品| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲av.av天堂| 丝袜在线中文字幕| 国产极品天堂在线| 国产精品久久久久久精品电影小说| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产片内射在线| videos熟女内射| 成人手机av| 下体分泌物呈黄色| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 午夜福利,免费看| 大码成人一级视频| 97在线人人人人妻| av免费观看日本| 最近的中文字幕免费完整| 在线天堂最新版资源| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久精品免费免费高清| 色婷婷av一区二区三区视频| 中文字幕免费在线视频6| 日本与韩国留学比较| 大香蕉97超碰在线| 国产精品久久久久久久电影| 丝袜美足系列| 亚洲成色77777| 黄片播放在线免费| 欧美老熟妇乱子伦牲交| √禁漫天堂资源中文www| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产亚洲一区二区精品| 最新的欧美精品一区二区| 女性被躁到高潮视频| videosex国产| 毛片一级片免费看久久久久| 岛国毛片在线播放| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国国产精品蜜臀av免费| 久久婷婷青草| 午夜久久久在线观看| 伊人久久国产一区二区| 少妇丰满av| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲美女黄色视频免费看| 在线 av 中文字幕| 国产成人精品无人区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲情色 制服丝袜| 久久这里有精品视频免费| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 99久久精品一区二区三区| 极品人妻少妇av视频| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品成人在线| 三级国产精品片| 22中文网久久字幕| 国产 精品1| 日本-黄色视频高清免费观看| 成人无遮挡网站| 亚洲中文av在线| 国产av国产精品国产| 国产成人午夜福利电影在线观看| 精品一区在线观看国产| av视频免费观看在线观看| 一级片'在线观看视频| 老女人水多毛片| 日日撸夜夜添| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 国产免费一区二区三区四区乱码| 色94色欧美一区二区| 午夜免费鲁丝| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美少妇被猛烈插入视频| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品人妻一区二区三区麻豆| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品免费大片| 午夜激情av网站| 91精品三级在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品人妻久久久影院| 一边摸一边做爽爽视频免费| 免费高清在线观看日韩| 国产高清国产精品国产三级| 国产精品蜜桃在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品少妇久久久久久888优播| 国产一区有黄有色的免费视频| 日本av免费视频播放| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产色婷婷99| 3wmmmm亚洲av在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 免费看光身美女| av天堂久久9| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 亚洲怡红院男人天堂| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲第一av免费看| 久久久久视频综合| 亚洲欧美色中文字幕在线| 大码成人一级视频| 国产淫语在线视频| 一级a做视频免费观看| 中文字幕久久专区| 亚洲欧洲日产国产| 热99久久久久精品小说推荐| 观看美女的网站| 国产成人freesex在线| 色视频在线一区二区三区| 一个人看视频在线观看www免费| 黄色怎么调成土黄色| 伦精品一区二区三区| 国产精品三级大全| av黄色大香蕉| 99热网站在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 欧美另类一区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美日本中文国产一区发布| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 丰满少妇做爰视频| 两个人的视频大全免费| 少妇 在线观看| 久久免费观看电影| 久久99热6这里只有精品| 亚洲熟女精品中文字幕| 99久久人妻综合| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 少妇的逼好多水| 国产精品人妻久久久久久| 99九九线精品视频在线观看视频| 大香蕉久久网| 一本大道久久a久久精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 一级毛片我不卡| 在线观看www视频免费| 午夜日本视频在线| 国产片特级美女逼逼视频| 精品熟女少妇av免费看| 99九九在线精品视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 观看美女的网站| 国产精品不卡视频一区二区| 久久人人爽人人爽人人片va| 韩国高清视频一区二区三区| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品熟女久久久久浪| 久久女婷五月综合色啪小说| 日本av手机在线免费观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 黑人高潮一二区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 最新中文字幕久久久久| 国产一级毛片在线| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲四区av| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产亚洲最大av| 午夜福利视频在线观看免费| 日韩大片免费观看网站| 丝瓜视频免费看黄片| 少妇人妻 视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 中文欧美无线码| 三级国产精品片| a级毛片在线看网站| 亚洲欧美清纯卡通| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 91精品三级在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 国产日韩欧美在线精品| 桃花免费在线播放| 99热这里只有精品一区| 成人手机av| 曰老女人黄片| 国产熟女欧美一区二区| 久久久久久久精品精品| 久久这里有精品视频免费| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 热re99久久国产66热| 成年人免费黄色播放视频| 制服人妻中文乱码| 久久毛片免费看一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 免费黄网站久久成人精品| 制服诱惑二区| 少妇熟女欧美另类| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 一本一本综合久久| 99国产综合亚洲精品| 精品国产国语对白av| 黄色一级大片看看| xxxhd国产人妻xxx| videosex国产| 熟女人妻精品中文字幕| av免费观看日本| 丝袜喷水一区| 久久午夜综合久久蜜桃| 九草在线视频观看| 国产精品久久久久成人av| 亚洲精品亚洲一区二区| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲国产精品专区欧美| 99久久精品一区二区三区| 91在线精品国自产拍蜜月| 最近中文字幕2019免费版| 曰老女人黄片| 日本午夜av视频| 亚洲av成人精品一区久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 精品一区在线观看国产| 国产在线视频一区二区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品偷伦视频观看了| av线在线观看网站| 黑人猛操日本美女一级片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 一区在线观看完整版| 亚洲少妇的诱惑av| a级毛片免费高清观看在线播放| 九草在线视频观看| 曰老女人黄片| 又大又黄又爽视频免费| 国产淫语在线视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲av综合色区一区| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲精品一二三| 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 99热这里只有精品一区| 一级毛片电影观看| 国产免费现黄频在线看| 免费黄色在线免费观看| 美女国产视频在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲精品视频女| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩强制内射视频| 久久国产精品大桥未久av| 人妻系列 视频| 草草在线视频免费看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 在线看a的网站| 18禁动态无遮挡网站| 午夜久久久在线观看| 国产成人精品福利久久| 最近的中文字幕免费完整| 日本vs欧美在线观看视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 一级,二级,三级黄色视频| 国产乱人偷精品视频| 91久久精品国产一区二区三区| 女性生殖器流出的白浆| 一级黄片播放器| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久99精品国语久久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 99九九线精品视频在线观看视频| 天堂中文最新版在线下载| 999精品在线视频| 有码 亚洲区| 国产免费现黄频在线看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产在线视频一区二区| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩制服骚丝袜av| 麻豆成人av视频| 久久久久网色| 精品久久久久久久久亚洲| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 午夜福利影视在线免费观看| 大香蕉久久成人网| 欧美97在线视频| 91久久精品国产一区二区成人| 最新的欧美精品一区二区| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产黄片视频在线免费观看| 美女大奶头黄色视频| 99久久人妻综合| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 天天操日日干夜夜撸| 老熟女久久久| 国产成人av激情在线播放 | 精品久久久精品久久久| 日本av免费视频播放| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久|