鴨肉蛋白源抗氧化肽的酶法制備工藝

王璐莎，張首玉，黃 明,*，周光宏

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部畜產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2.河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院烹飪食品系，河南 鄭州 450046）

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鴨肉蛋白源抗氧化肽的酶法制備工藝

王璐莎1，張首玉2，黃 明1,*，周光宏1

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部畜產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2.河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院烹飪食品系，河南 鄭州 450046）

摘 要：以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法（response surface methodology，RSM）優(yōu)化胃蛋白酶制備鴨肉抗氧化肽的最佳酶解工藝條件。結(jié)果表明：以底物質(zhì)量濃度、酶與底物質(zhì)量比和酶解時(shí)間為自變量，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，得到的回歸方程擬合度高（R2=0.995 7，R2Adj=0.992 7）。其中酶與底物質(zhì)量比對(duì)DPPH自由基清除率的影響最大，其次是酶解時(shí)間，底物質(zhì)量濃度的影響最小。胃蛋白酶的最優(yōu)酶解工藝條件為底物質(zhì)量濃度10.89 g/100 mL、酶與底物質(zhì)量比0.013%、酶解時(shí)間3.54 h，此時(shí)DPPH自由基清除率的理論值可達(dá)84.23%，通過(guò)優(yōu)化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得，在最優(yōu)酶解條件下，DPPH自由基清除率的實(shí)際值為（83.57±0.20）%。

關(guān)鍵詞：鴨肉；胃蛋白酶；抗氧化肽；DPPH自由基清除率；響應(yīng)曲面

研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)過(guò)多的自由基會(huì)破壞核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，使機(jī)體細(xì)胞和組織產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化損傷，從而誘發(fā)一些疾病的發(fā)生，如動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、老年癡呆癥和癌癥等[1-3]。自由基也是導(dǎo)致油脂氧化的重要原因之一，而油脂的氧化會(huì)改變食品的風(fēng)味、色澤和質(zhì)地等感官品質(zhì)，甚至?xí)a(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，最終導(dǎo)致食品變質(zhì)而無(wú)法食用。因此抗氧化劑的研究具有重要的意義。目前一些人工合成的抗氧化劑如二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）、特丁基對(duì)苯二酚（tertbutylhydroquinone，TBHQ）等已在食品中廣泛使用，但這些物質(zhì)具有一定的副作用，會(huì)威脅人體健康；一些天然抗氧化劑因成本過(guò)高或?qū)κ称犯泄儆杏绊?，在使用上存在著局限性[4-5]。因此急需尋找一種安全健康高效的抗氧化劑。

目前，用動(dòng)植物蛋白制備抗氧化肽已成為了研究熱點(diǎn)，這種抗氧化肽被認(rèn)為是安全的。此外它還具有低成本、低分子質(zhì)量、高活性、穩(wěn)定性高和易吸收等特點(diǎn)[3]?？寡趸目赏ㄟ^(guò)動(dòng)植物蛋白酸解、酶解或微生物發(fā)酵獲得。酶解法因具有快捷、可控、便于重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)成為了制備抗氧化肽的主要方法[6]。已有研究者通過(guò)酶解大豆[7]、玉米[8]、花生[9]、酪蛋白[10]、豬皮[11]、藍(lán)園鲹[12]、草魚(yú)[13]、沙丁魚(yú)[14]、魷魚(yú)[15]、鱈魚(yú)[5]、雞肉[16]等動(dòng)植物蛋白而獲得了抗氧化肽，并證實(shí)它們具有較強(qiáng)的抗氧化性。

我國(guó)是世界上最大的鴨肉生產(chǎn)國(guó)，根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2012年我國(guó)鴨肉產(chǎn)量約為300 萬(wàn)t，約占全世界的69%，位居世界第一位。鴨肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，可食用部分蛋白質(zhì)含量約為16%～25%[17]。目前用來(lái)制備動(dòng)物蛋白源抗氧化肽的蛋白主要為各種魚(yú)類蛋白，以鴨肉為蛋白源的抗氧化肽研究在國(guó)內(nèi)還很少，因此酶解鴨肉蛋白來(lái)制備抗氧化肽具有一定的研究和應(yīng)用價(jià)值。

該研究的主要目的是探討鴨肉蛋白源抗氧化肽的酶法制備工藝條件，以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選用胃蛋白酶為工具酶，經(jīng)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法（response surface methodology，RSM）優(yōu)化抗氧化肽的制備條件，以期為深入研究酶法制備抗氧化肽及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

櫻桃谷鴨 江蘇省南京市蘇果超市。

胃蛋白酶1∶3 000（Amresco 0685，3 000～3 500 NFU/mg） 美國(guó)Amresco公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基 梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

C-MAG HS7數(shù)顯加熱磁力攪拌器、勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；HH-W恒溫水浴箱 恒豐儀器制造有限公司；GRINDOMIX GM200刀式混合研磨儀 德國(guó)Retsch公司；pH計(jì) 瑞士Mettle Toledo公司；M2e酶標(biāo)儀美國(guó)MD公司；Avanti J-E高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；KjeltecTM2300全自動(dòng)凱氏定氮儀 瑞典FOSS公司；Hitachi L-8900A氨基酸自動(dòng)分析儀 日本Hitachi公司。

1.3方法

1.3.1 酶解產(chǎn)物制備工藝流程

宰殺鴨子→取胸肉與腿肉→去除脂肪與筋腱→絞碎（2 000 r/min，10 s）→煮制使蛋白適度變性（90 ℃，10 min）→加甘氨酸-HCl緩沖液（pH 2.0）勻漿→加胃蛋白酶→恒溫酶解→滅酶（調(diào)pH 7.0，再沸水浴10 min）→離心取上清液（7 000 r/min，15 min）→測(cè)DPPH自由基清除率與三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）可溶性蛋白（短肽）含量

1.3.2 常規(guī)理化指標(biāo)測(cè)定

總蛋白質(zhì)含量：參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法測(cè)定；水分含量：參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》中常壓干燥法測(cè)定；灰分含量：參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》中的干法灰化法測(cè)定；脂肪含量：參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》中索氏抽提法測(cè)定。1.3.3 氨基酸分析

參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》的方法將鴨肉用6 mol/L鹽酸，在110 ℃真空條件下水解24 h，酸解后的樣品采用氨基酸自動(dòng)分析儀Hitachi L-8900A進(jìn)行氨基酸含量測(cè)定。

1.3.4 酶解條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 不同底物質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基清除率以及TCA可溶性蛋白（短肽）含量的影響

底物質(zhì)量濃度設(shè)為3、5、8、10、13、15、18、20 g/100 mL，酶與底物（鴨肉）質(zhì)量比0.01%，pH 2.0，37 ℃恒溫反應(yīng)3 h，離心取上清液測(cè)TCA可溶性蛋白（短肽）含量和DPPH自由基清除率。

1.3.4.2 不同的酶與底物質(zhì)量比對(duì)DPPH自由基清除率以及TCA可溶性蛋白（短肽）含量的影響

酶與底物（鴨肉）質(zhì)量比設(shè)為0、0.003%、0.005%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%，底物質(zhì)量濃度10 g/100 mL，pH 2.0，37 ℃恒溫反應(yīng)3 h，離心取上清液測(cè)TCA可溶性蛋白（短肽）含量和DPPH自由基清除率。

1.3.4.3 不同酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率以及TCA可溶性蛋白（短肽）含量的影響

酶解時(shí)間設(shè)為0.5、1、2、3、4、5、6、7 h，底物質(zhì)量濃度10 g/100 mL，酶與底物（鴨肉）質(zhì)量比0.01%，pH 2.0，37 ℃恒溫反應(yīng)，離心取上清液測(cè)TCA可溶性蛋白（短肽）含量和DPPH自由基清除率。

1.3.5 酶解條件的響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇底物質(zhì)量濃度（X1）、酶與底物質(zhì)量比（X2）、酶解時(shí)間（X3）為試驗(yàn)因子，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，利用三元二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)進(jìn)行酶解條件的優(yōu)化。

1.3.6 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照Cumby等[18]的方法并稍做修改。具體方法為將DPPH自由基溶解于甲醇中，配制成質(zhì)量濃度為0.101 5 g/L的溶液。其中樣品組為500 μL酶解產(chǎn)物（3 mg/mL）與500 μL DPPH自由基溶液在室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，記為A1；對(duì)照組1為500 μL酶解產(chǎn)物（3 mg/mL）與500 μL甲醇在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度，記為A2；對(duì)照組2為500 μL蒸餾水與500 μL DPPH自由基溶液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度，記為A3；調(diào)零組為500 μL甲醇與500 μL蒸餾水在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.7 TCA可溶性蛋白（短肽）含量的測(cè)定

一般功能性肽含有2～20 個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量小于6 000 D[3]，因此可認(rèn)為功能性肽可溶解于TCA中。TCA可溶性蛋白（短肽）含量的測(cè)定方法參照J(rèn)ang等[19]的方法并稍做修改。將10 mL酶解液與等量的20% TCA混合后離心（3 000×g，5 min），取上清液與雙縮脲試劑在室溫下反應(yīng)30 min，然后在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，根據(jù)該吸光度對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的值即為10% TCA可溶性蛋白質(zhì)量濃度。樣品中總蛋白含量用凱氏定氮法測(cè)定。

1.4數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用SAS 8.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用One-Way ANOVA方法進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s multiple range test進(jìn)行多重比較，顯著水平設(shè)為P＜0.05，應(yīng)用Design-Expert 7.0.0進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2　結(jié)果與分析

2.1常規(guī)理化指標(biāo)和氨基酸分析

鴨肉肉糜（濕樣）經(jīng)測(cè)定各組分含量為：總蛋白質(zhì)含量（22.00±0.49）%、水分含量（74.60±0.59）%、灰分含量（1.43±0.08）%、脂肪含量（1.35±0.05）%。結(jié)果表明鴨肉的蛋白含量較高，適合用來(lái)蛋白質(zhì)酶解。

表1　鴨肉氨基酸組成Table 1 Amino acids composition of duck meat

如表1所示，鴨肉的氨基酸組成合理，必需氨基酸的總量所占比例為43.82%，其中Lys和Leu含量最高，分別占總蛋白質(zhì)的9.42%和8.46%，對(duì)嬰兒來(lái)說(shuō)也是必需氨基酸的His含量占總蛋白質(zhì)的3.05%。鴨肉富含Glu、Gln、Asp、Asn、Lys、Leu、Arg和Ala。研究發(fā)現(xiàn)一些特定氨基酸的存在（如Glu、Asp、 Lys、Leu和Ala）能夠增強(qiáng)肽的抗氧化性。Lys、Asp和Glu因其側(cè)鏈有氨基或羧基而具有螯合金屬離子或清除自由基的作用[20]。Leu的側(cè)鏈具有很強(qiáng)的疏水性，提高抗氧化肽的油溶性，并使肽能夠很好的通過(guò)磷脂雙分子層，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用[21]。因此鴨肉蛋白是一種用來(lái)制備抗氧化肽的優(yōu)質(zhì)原料。

選用胃蛋白酶作為工具酶來(lái)水解鴨肉蛋白制備抗氧化肽。胃蛋白酶在對(duì)蛋白或多肽進(jìn)行水解時(shí)，具有一定的氨基酸特異性，其酶切位點(diǎn)主要為氨基端或羧基端為Phe、Trp和Tyr的肽鍵[22]。研究發(fā)現(xiàn)Phe、Trp和Tyr對(duì)肽的抗氧化性做出了貢獻(xiàn)，因?yàn)門rp、Tyr分別含有吲哚基、酚羥基，能夠作為電子供體而起到清除自由基的作用[3]，Guo Hang等[23]研究發(fā)現(xiàn)肽鏈中含有Trp、Tyr的寡肽表現(xiàn)出很強(qiáng)的自由基清除能力。用胃蛋白酶水解得到的一些肽在其氨基端或羧基端含有Phe、Trp或Tyr，因此這些肽很可能具有很強(qiáng)的抗氧化性。

2.2酶解條件的單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同底物質(zhì)量濃度的影響

圖1　不同底物質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基清除率以及TCA可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on DPPH radical scavenging rate and TCA-soluble peptide yield

由圖1可知，不同底物質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白（短肽）含量都有顯著的影響（P＜0.01）。底物質(zhì)量濃度為3～10 g/100 mL時(shí)，DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白（短肽）含量都顯著增加，之后兩者都有下降的趨勢(shì)。原因可能為底物質(zhì)量濃度的增加有利于其有效占據(jù)酶的活性中心，增加敏感肽鍵的數(shù)量，加快酶反應(yīng)速率，有利于增加抗氧化肽的數(shù)量[24]。但當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，過(guò)多的底物聚集在酶分子表面，形成了一種酶活性的中間產(chǎn)物，抑制了酶解作用[25]，同時(shí)過(guò)高的底物質(zhì)量濃度會(huì)降低有效水分濃度，從而降低了酶和底物的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，最終降低了酶解作用[26]。通過(guò)綜合考慮，選擇底物質(zhì)量濃度為10 g/100 mL。

2.2.2 不同酶與底物質(zhì)量比的影響

由圖2可知，酶與底物質(zhì)量比對(duì)DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白（短肽）含量都有顯著影響。隨著酶與底物質(zhì)量比的增加（0～0.01%），TCA可溶性蛋白（短肽）含量和DPPH自由基清除率都顯著增加（P＜0.01），但繼續(xù)增加酶與底物的質(zhì)量比，TCA可溶性蛋白（短肽）含量和DPPH自由基清除率都有下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵诘孜锓肿映渥愕臈l件下，增加酶用量可提高底物與酶的結(jié)合，從而加快反應(yīng)速率，此時(shí)酶與底物質(zhì)量比越高，TCA可溶性蛋白（短肽）含量就越大，得到的抗氧化肽就越多。但當(dāng)酶與底物質(zhì)量比超過(guò)0.01%時(shí)，底物已被完全飽和，酶過(guò)量，具有抗氧化活性的肽鏈被降解為無(wú)活性的氨基酸或二肽，所以表現(xiàn)出了TCA可溶性蛋白（短肽）含量和DPPH自由基清除率下降的跡象。通過(guò)綜合考慮，確定最佳酶與底物質(zhì)量比為0.01%。

圖2　不同酶與底物質(zhì)量比對(duì)DPPH自由基清除率以及TCA可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of enzyme-to-substrate ratio on DPPH radical scavenging rate and TCA-soluble peptide yield

2.2.3 不同酶解時(shí)間的影響

圖3　不同酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率以及TCA可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on DPPH radical scavenging rate and TCA-soluble peptide yield

由圖3可知，不同酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白（短肽）含量都有顯著影響（P＜0.01），并且DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白（短肽）含量?jī)烧叩淖兓收嚓P(guān)（R2=0.910 7）。在0～3 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白（短肽）含量都增加。酶解時(shí)間為3 h時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到最大值（73.01±2.53）%；3 h過(guò)后，DPPH自由基清除率和TCA可溶性蛋白（短肽）含量都下降。這可能是因?yàn)榉磻?yīng)初期，底物質(zhì)量濃度較高，水解較快，產(chǎn)生的活性肽增加，從而使DPPH自由基的清除活性迅速增強(qiáng)；但隨著反應(yīng)的進(jìn)行，具有抗氧化活性的長(zhǎng)鏈肽被再一次降解，從而使抗氧化活性下降[27]。通過(guò)綜合考慮，確定最佳反應(yīng)時(shí)間為3 h。

2.3酶解條件的響應(yīng)曲面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

表2　響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Taabblle 2 Design program and experimental results of RSM

響應(yīng)曲面試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。用Design-Expert 7.0.0軟件進(jìn)行分析，得到方差分析結(jié)果（表3）和DPPH自由基清除率（Y）對(duì)底物質(zhì)量濃度（X1）、酶與底物質(zhì)量比（X2）、酶解時(shí)間（X3）的二次多項(xiàng)回歸模擬方程：Y=－122.84＋17.97X1＋8 021.46X2＋33.35X＋207.50XX＋0.66XX－512.50XX－1.05X2－

312132313.38×105X2－4.83X2。

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方差分析表明，該回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬度不顯著（P失擬=0.507 1＞0.05）。模型的決定系數(shù)R2=0.995 7，校正擬合度R2Adj=0.992 7，展望擬合度R2=0.984 2，展望擬合度和校正擬合度相差不大，且模

pred型的信噪比較大，為64.03，說(shuō)明模型擬合度與可信度都很高，試驗(yàn)誤差小，可用該回歸模型代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

表3　DPPH自由基清除率試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 ANOVA for DPPH radical scavenging rate

由表3可知，一次項(xiàng)底物質(zhì)量濃度（X1）（P＜0.000 1）、酶與底物質(zhì)量比（X2）（P＜0.000 1）、酶解時(shí)間（X3）（P＜0.000 1）對(duì)DPPH自由基清除率具有極顯著的影響。由回歸方程的各系數(shù)可知，酶與底物質(zhì)量比（X2）對(duì)DPPH自由基清除率貢獻(xiàn)最大，其次是酶解時(shí)間（X3）、底物質(zhì)量濃度（X1）的貢獻(xiàn)最小，但X1、X2、X3對(duì)酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基都產(chǎn)生了正效應(yīng)影響。交互項(xiàng)X1X2（P=0.004 7＜0.01）、X2X3（P=0.000 2＜0.01）和二次項(xiàng)X12（P＜0.000 1）、X22（P＜0.000 1）和X32（P＜0.000 1）對(duì)DPPH自由基清除 率也具有極顯著的影響，這表明各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是呈二次關(guān)系，且3 個(gè)因素之間存在著交互作用。

對(duì)TCA可溶性蛋白（短肽）含量與DPPH自由基清除率之間進(jìn)行線性相關(guān)性分析，結(jié)果為R2=0.980 7，R2=0.979 8，說(shuō)明TCA可溶性蛋白（短肽）含量與DPPH自

Adj由基清除率之間呈顯著正相關(guān)。這與Wang Qiukuan等[28]得到的結(jié)論相似，對(duì)牡蠣蛋白水解產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化測(cè)定，發(fā)現(xiàn)羥自由基（·OH）清除率隨著TCA可溶性蛋白（短肽）含量的增加而增加。這其中的原因可能是隨著蛋白質(zhì)被水解成小肽，一些能與氧化物質(zhì)反應(yīng)的氨基酸殘基暴露出來(lái)[29]，而這些小肽在TCA溶液中有較好的溶解性，所以表現(xiàn)出了蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性隨著TCA可溶性蛋白（短肽）含量增加而增強(qiáng)的現(xiàn)象。雖然DPPH自由基清除率與TCA可溶性蛋白（短肽）含量之間存在著一定的相關(guān)性，但本研究目標(biāo)產(chǎn)物為DPPH自由基清除能力最強(qiáng)的鴨肉蛋白酶抗氧化肽，因此以DPPH自由基清除率為第一指標(biāo)，TCA可溶性蛋白（短肽）含量為輔助指標(biāo)。

2.3.2 各因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響

圖4　底物質(zhì)量濃度、酶與底物質(zhì)量比對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of substrate concentration and enzyme to substrate ratio on DPPH radical scavenging rate

由圖4可知，固定時(shí)間為中心點(diǎn)水平，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著酶與底物質(zhì)量比的升高，DPPH自由基清除率先增加后減小，在0.013%左右達(dá)到最大值，DPPH自由基清除率下降的原因可能是抗氧化肽被再一次水解；當(dāng)酶與底物質(zhì)量比一定時(shí)，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率先增加后減小，在11.00 g/100 mL左右達(dá)到最大值。

由圖5可知，固定酶與底物質(zhì)量比為中心點(diǎn)水平，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，DPPH自由基清除率先增加后減小，在3.5 h左右達(dá)到最大值；當(dāng)酶解時(shí)間一定時(shí)，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率先增加后減小，在11.00 g/100 mL左右到達(dá)最大值。

圖5　底物質(zhì)量濃度、酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration and hydrolysis time on DPPH radical scavenging rate

圖6　酶與底物質(zhì)量比、酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of enzyme-to-substrate ratio and hydrolysis time on DPPH radical scavenging rate

由圖6可知，固定底物質(zhì)量濃度為中心點(diǎn)水平，當(dāng)酶解時(shí)間較短時(shí)，隨著酶與底物質(zhì)量比的增加，DPPH自由基清除率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)酶解時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，隨著酶與底物質(zhì)量比的增加DPPH自由基清除率先增加后減小，這是因?yàn)樵谒獬跗冢罅康孜锏鞍踪|(zhì)被迅速水解為肽，抗氧化基團(tuán)暴露出來(lái)并得到積累；隨著底物蛋白質(zhì)的減少，肽含量上升，由于肽鏈比底物蛋白分子短，靈活性高，更易與蛋白酶接觸而進(jìn)一步被水解，所以有可能使抗氧化肽被進(jìn)一步水解而使抗氧化能力下降。當(dāng)酶與底物質(zhì)量比較小時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，DPPH自由基清除率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)酶與底物質(zhì)量比較大時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，DPPH自由基清除率先增加后減小。這同樣是因?yàn)榧用噶枯^多時(shí)，酶量相對(duì)于底物蛋白質(zhì)過(guò)量，肽分子與底物競(jìng)爭(zhēng)而被再次水解所致。

2.3.3 優(yōu)化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果用軟件進(jìn)行最優(yōu)化分析，在酶解pH 2.0，酶解溫度37 ℃條件下，以DPPH自由基清除率最大值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定胃蛋白酶的最優(yōu)酶解條件為底物質(zhì)量濃度10.89 g/100 mL、酶與底物質(zhì)量比0.013%、酶解時(shí)間3.54 h，此時(shí)DPPH自由基清除率的理論值可達(dá)84.23%。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得，在最優(yōu)酶解條件下，DPPH自由基清除率的實(shí)際值為（83.57±0.20）%，理論值與實(shí)際值的相對(duì)誤差為0.78%，兩者無(wú)顯著性差異，表明模型可行。

3　結(jié) 論

采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面試驗(yàn)，建立了胃蛋白酶水解鴨肉制備抗氧化肽所需的工藝條件的二次模型，模型擬合度較高。其中酶與底物質(zhì)量比對(duì)DPPH自由基清除率影響最大，其次是酶解時(shí)間，底物質(zhì)量濃度的影響最小，這3 個(gè)因素之間的交互作用對(duì)DPPH自由基清除率的影響極顯著。用胃蛋白酶制備鴨肉蛋白源抗氧化肽的最優(yōu)酶解工藝條件為底物質(zhì)量濃度10.89 g/100 mL、酶與底物質(zhì)量比0.013%、酶解時(shí)間3.54 h。

對(duì)TCA可溶性蛋白（短肽）含量與DPPH自由基清除率之間進(jìn)行線性相關(guān)性分析，決定系數(shù)R2=0.980 7，校正決定系數(shù)R2Adj=0.979 8，酶解液的DPPH自由基清除率與TCA可溶性蛋白（短肽）含量呈正相關(guān)，即隨著TCA可溶性蛋白（短肽）含量的增加，DPPH自由基清除率增加。

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Preparation of Antioxidant Peptides Derived from Duck Meat by Enzymatic Hydrolysis

WANG Lusha1, ZHANG Shouyu2, HUANG Ming1,*, ZHOU Guanghong1
(1. Key Laboratory of Animal Product Processing, Ministry of Agriculture, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Department of Cooking Food, Henan Polytechnic, Zhengzhou 450046, China)

Abstract:Response surface methodology (RSM) was used to develop an optimal pepsin hydrolysis procedure of duck meat for the production of antioxidant peptides with high DPPH radical scavenging activity. The results showed that the response surface model indicating the effect of substrate concentration, enzyme-to-substrate ratio and hydrolysis time on DPPH radical scavenging activity of duck meat hydrolysates was well fitted (R2=0.995 7, R2Adj=0.992 7). Among three independent variables, enzyme-to-subs trate ratio exerted the greatest effect on DPPH r adical scavenging activity, while substrate concentration had the least impact. Maximum DPPH radical scavenging activity (83.57 ± 0.20)% was observed for the hydrolysate obtained after 3.54 h of hydrolysis at a substrate concentration of 10.89 g/100 mL and an enzyme to substrate ratio of 0.013%, which was close to the and value (84.23%) obtained from RSM at a 95% confidence interval.

Key words:duck meat; pepsin; antioxidant peptides; DPPH radical scavenging activity; response surface methodology (RSM)

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507017

中圖分類號(hào)：TS251.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2015）07-0090-07

*通信作者：黃明（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿馄焚|(zhì)量與安全控制。E-mail：mhuang@njau.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：王璐莎（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿馄焚|(zhì)量與安全控制。E-mail：2012108029@njau.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171706）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303083-2）

收稿日期：2014-03-25