副溶血弧菌毒力因子及致病機(jī)理的研究進(jìn)展

張德福，付緒磊，張 明，楊文慧，楊慧盈， 湯軼偉，高 雪，徐永霞，勵(lì)建榮,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013；2.渤海大學(xué)新能源學(xué)院，遼寧 錦州 121013；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071）

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副溶血弧菌毒力因子及致病機(jī)理的研究進(jìn)展

張德福1，付緒磊1，張 明2，楊文慧3，楊慧盈3， 湯軼偉1，高 雪1，徐永霞1，勵(lì)建榮1,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013；2.渤海大學(xué)新能源學(xué)院，遼寧 錦州 121013；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071）

摘 要：副溶血弧菌為一種嗜鹽性革蘭氏陰性短桿菌，是引發(fā)人食源性疾病的主要致病菌之一，主要分布在海洋環(huán)境中。副溶血弧菌的毒力因子主要包括黏附因子、侵襲因子、溶血性毒素、尿素酶、脂 多糖、外膜蛋白、蛋白酶、Ⅲ型分泌系統(tǒng)和攝鐵系統(tǒng)等。本文就副溶 血弧菌的主要毒力因子及其致病機(jī)理的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，可為進(jìn)一步研究該菌的分子致病機(jī)理、制定快速精確的檢測(cè)方法等提供參考。

關(guān)鍵詞：副溶血弧菌；毒力因子；致病機(jī)理；溶血素；Ⅲ型分泌系統(tǒng)

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一種嗜鹽性革蘭氏陰性短桿菌，是世界范圍內(nèi)重要的食源性致病菌，主要分布在海洋環(huán)境中，尤其是沿海地區(qū)的海水、海底沉積物和海產(chǎn)品中[1-2]。人類食用被致病性Vp污染的或未煮熟的海產(chǎn)品會(huì)引起急性腸胃炎，通常發(fā)病的潛伏期為1～4 d不等，大多為10 h左右。患者會(huì)出現(xiàn)腹瀉、腹部痙攣、惡心、嘔吐和發(fā)熱等現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)甚至出現(xiàn)脫水、昏迷等癥狀[2-3]。Vp引起的食源性疾病已成為世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。近年來(lái)，在亞洲（尤其是東南亞地區(qū)）、歐洲和北美洲均多次爆發(fā)了Vp導(dǎo)致的食源性疾病[4-7]。據(jù)我國(guó)食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)1992—2001年統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)顯示，Vp引起的食源性疾病居微生物食源性疾病的首位[8]，因此Vp的毒力因子和致病機(jī)理的研究越來(lái)越受到人們的重視。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)對(duì)Vp毒力因子及致病機(jī)理的研究取得了很大進(jìn)展，為科學(xué)防治Vp所引發(fā)的疾病奠定了良好的基礎(chǔ)。本文擬對(duì)Vp的毒力因子，包括黏附因子、侵襲因子、溶血性毒素、尿素酶、脂多糖、外膜蛋白、蛋白酶、Ⅲ型分泌系統(tǒng)和攝鐵系統(tǒng)等對(duì)宿主的致病性和致病機(jī)理的最新研究進(jìn)展作綜合介紹。

1　黏附因子（adherence factors）

病原菌的黏附作用與其致病性密切相關(guān)，是病原菌接觸和感染宿主的第一步，也是導(dǎo)致感染的首要條件，其實(shí)質(zhì)就是病原菌表面的特殊結(jié)構(gòu)和蛋白與宿主靶細(xì)胞表面受體黏附并相互作用，但目前對(duì)Vp如何定殖于人的腸道還不十分明確[9]。

Gingras等[10]發(fā)現(xiàn)神奈川陽(yáng)性（Kanagawa phenomonon positive，KP＋）菌株和神奈川陰性（Kanagawa phenomonon negative，KP－）菌株對(duì)人腸道上皮細(xì)胞的黏附?jīng)]有顯著差異，表明Vp普遍具有對(duì)人腸道上皮細(xì)胞的黏附能力。Nakasone等[11]發(fā)現(xiàn)純化的Vp Ha 7 株菌毛能夠黏附兔腸道上皮細(xì)胞，用菌毛抗體的Fab片段處理Vp或用純化的菌毛處理兔腸道后，Vp都不能再繼續(xù)黏附腸道。這表明Vp的菌毛在其黏附和定殖于腸道的過(guò)程中具有重要作用。

Nagayama等[12]通過(guò)對(duì)Vp細(xì)胞相關(guān)血凝素（cellassociated hemagglutinin of Vibr io parahaemolyticus，cHA）與Vp對(duì)兔腸上皮細(xì)胞黏附能力關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，Vp細(xì)胞經(jīng)D-甘露糖和經(jīng)純化的血凝素免疫球蛋白G的Fab段處理后，能夠劑量依賴性地抑制其對(duì)兔腸上皮細(xì)胞的黏附能力；兔腸上皮細(xì)胞經(jīng)純化的血凝素預(yù)處理后能夠抑制Vp的黏附，而血凝素位于菌體細(xì)胞表面且與菌毛不相關(guān)。這些結(jié)果表明，cHA參與了Vp黏附到腸上皮細(xì)胞，血凝素的腸上皮細(xì)胞受體可能是含有D-甘露糖的復(fù)合物。

O’Boyle等[13]研究表明，甘露糖敏感血凝素（mannose-sensitive haemagglutinin，MSHA）菌毛是影響細(xì)菌-宿主細(xì)胞黏附及致病性的一個(gè)重要因素。MSHA突變株對(duì)Caco-2細(xì)胞黏附能力顯著下降的同時(shí)，誘導(dǎo)Caco-2裂解和IL-8分泌的能力等也明顯下降。MSHA對(duì)結(jié)構(gòu)相近的唾液酸GM1神經(jīng)節(jié)苷脂等多糖具有高度親和性，這些物質(zhì)可能是腸道中MSHA的受體，促進(jìn)其定殖于腸道上皮細(xì)胞。

σ因子rpoN是控制鞭毛合成的調(diào)控基因。Whitaker等[9]發(fā)現(xiàn)，敲除rpoN的Vp突變株對(duì)小鼠腸道的定殖能力提高了，表明RpoN可能顯著影響Vp對(duì)宿主的定殖。

Jiang Wei等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在Vp表面表達(dá)的烯醇酶具有人血纖維蛋白溶酶原結(jié)合活性，通過(guò)黏附和抑制實(shí)驗(yàn)表明，烯醇酶在上皮細(xì)胞黏附中具有重要作用，可以作為候選疫苗。

Krachler等[15-16]的研究表明，一種廣泛分布于革蘭氏陰性菌的MAM7通過(guò)與宿主細(xì)胞膜上的纖連蛋白和膜磷脂酸結(jié)合，在宿主細(xì)胞表面組裝成一個(gè)三分子聚合物，介導(dǎo)病原菌黏附宿主細(xì)胞的起始階段。在非致病性大腸桿菌中表達(dá)MAM7，可以使大腸桿菌與宿主細(xì)胞黏附；抑制MAM7的表達(dá)，則可以使Vp的黏附能力與毒力均下降。這一現(xiàn)象也存在于其他含MAM7的革蘭氏陰性菌中，MAM7的生物學(xué)特性為治療Vp和其他革蘭氏陰性致病菌的感染提供了理論基礎(chǔ)。

對(duì)黏附因子的深入研究將為解釋Vp如何定殖于腸道、導(dǎo)致感染的機(jī)理奠定基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步的藥物與疫苗開發(fā)、探索新的治療方法、尋找細(xì)菌的抑制劑或受體阻斷劑等提供理論依據(jù)。

2　侵襲因子（invasiveness）

侵襲力是Vp的一種細(xì)菌毒力，使其可以突破宿主的免疫屏障而進(jìn)行繁殖和擴(kuò)散。Boutin等[17]將具有不同溶血現(xiàn)象的Vp海產(chǎn)品和臨床分離株分別接種新西蘭大白兔結(jié)扎回腸絆中，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，所有的菌株都能進(jìn)入回腸固有層，而且在肝臟、心臟和胰臟組織中都能分離到感染的菌株。這表明Vp菌株不僅僅定殖于腸道的表面，還可能通過(guò)淋巴系統(tǒng)或者循環(huán)系統(tǒng)侵入更深的組織。Akeda等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Vp的侵襲能夠被細(xì)胞松弛素D、諾考達(dá)唑和染料木黃酮抑制?；谶@3 種物質(zhì)的生物學(xué)功能推測(cè)，酪氨酸蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肌動(dòng)蛋白微絲和細(xì)胞骨架可能在侵襲過(guò)程中具有重要作用。Akeda等[19]另一研究結(jié)果表明，表達(dá)Rho家族小GTP酶顯性失活的Caco-2細(xì)胞可以促進(jìn)Vp侵襲，這說(shuō)明Vp的侵襲機(jī)制可能與已報(bào)道的其他侵襲性細(xì)菌不同。Zhang Lingling等[20]研究表明，Ⅲ型分泌系統(tǒng)2（type Ⅲ secretion system 2，T3SS2）的效應(yīng)蛋白VopC在介導(dǎo)包括Vp在內(nèi)的弧菌侵襲宿主細(xì)胞的過(guò)程中具有重要作用。VopC通過(guò)61位谷氨酰胺的脫酰氨基作用活化Rac和CDC42、促進(jìn)Vp侵襲宿主細(xì)胞。鑒于其他海洋細(xì)菌也有編碼VopC同系物的基因，因此T3SS2的效應(yīng)蛋白VopC可能是弧菌侵襲性致病力的一個(gè)新的分子范例。

3　溶血素（hemolysins）

Vp溶血素屬于紅細(xì)胞毒素，可以在莪萋氏血瓊脂平板上產(chǎn)生β-溶血，這種現(xiàn)象稱為神奈川現(xiàn)象（KP）[21]，據(jù)此可以將Vp分為神奈川陽(yáng)性（KP＋）菌株和神奈川陰性（KP－）菌株[22-23]。Vp的溶血毒素主要有3 種：耐熱直接溶血素（thermostable direct hemolysin，TDH）、耐熱直接相關(guān)溶血素（TDH-related hemolysin，TRH）、不耐熱溶血素（thermolabile hemolysin，TLH），分別由tdh、trh、tlh基因編碼[23]。TDH和TRH與Vp所引起的腸胃炎密切相關(guān)，因此目前普遍認(rèn)為tdh、trh基因編碼產(chǎn)物是Vp的主要毒力因子[24-26]，對(duì)其進(jìn)行深入研究可以進(jìn)一步闡釋Vp的致病機(jī)理。Vp流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，環(huán)境分離株和水產(chǎn)品分離株極少攜帶tdh、trh，所以自然界中大多數(shù)的Vp為非致病的，只有極少部分具有致病性，而臨床分離株大多為KP＋株，環(huán)境分離株中大部分為KP－株[27-28]。

3.1耐熱直接溶血素

TDH是致病性Vp產(chǎn)生的一種不含糖或者脂質(zhì)的蛋白，由189 個(gè)氨基酸組成，對(duì)熱耐受，在70～100 ℃加熱10 min仍具有溶血活性[29]。編碼TDH的tdh基因是Vp最重要的毒力基因，位于染色體2上，編碼區(qū)長(zhǎng)約570 bp。TDH陽(yáng)性菌株有2 個(gè)tdh基因：tdh1和tdh2，它們所表達(dá)的蛋白具有相同的溶血活性，僅僅有7 個(gè)氨基酸不同，很難進(jìn)行區(qū)分，但是tdh2比tdh1更具有表達(dá)優(yōu)勢(shì)[27,30-32]。TDH可直接作用于紅細(xì)胞，具有溶血活性、腸毒素活性、心臟毒性和細(xì)胞毒性，但是添加卵磷脂不會(huì)增強(qiáng)其溶血活性[33]。研究表明TDH可使多種紅細(xì)胞發(fā)生溶血，對(duì)人、鼠、兔、狗、豚鼠等的紅細(xì)胞具有直接溶血活性，主要原因可能是GT1或GD1a神經(jīng)節(jié)苷脂介導(dǎo)破壞細(xì)胞膜和溶酶體[34]。

TDH的溶血過(guò)程首先是通過(guò)受體介導(dǎo)，在不依賴溫度的條件下使宿主紅細(xì)胞膜和溶血素結(jié)合，進(jìn)而在依賴溫度的條件下TDH破壞細(xì)胞膜和溶酶體并使細(xì)胞溶解。TDH的細(xì)胞毒性是由于TDH會(huì)形成同源四聚體的成孔毒素作用于腸道細(xì)胞，在細(xì)胞膜上形成通道，產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性遭到破壞，細(xì)胞質(zhì)因滲透作用而膨脹、裂解[35]。

Naim等[36]研究人員發(fā)現(xiàn)，葡聚糖和聚乙烯乙二醇能阻斷TDH的溶血活性，但是不會(huì)阻斷它的細(xì)胞毒性，單丹磺酰尸胺對(duì)TDH細(xì)胞毒性有拮抗作用，但是對(duì)溶血活性沒有拮抗作用，說(shuō)明TDH的溶血性和細(xì)胞毒性的作用機(jī)理不同。高濃度的TDH會(huì)破壞上皮細(xì)胞，增加Vp的侵襲力，使得膽汁酸增加，有利TDH的高效表達(dá)[37]，而TDH會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度暫時(shí)性的升高，其濃度變化與TDH自身的濃度成正比[38]。Ca2+的參與不僅使得TDH誘導(dǎo)腸液氯化物分泌增加從而產(chǎn)生了腸毒素[39]，而且Ca2+濃度的升高能引起Cl－通道的開放，導(dǎo)致結(jié)腸上皮細(xì)胞Cl－的分泌增加，從而引起腹瀉的發(fā)生[40-42]。TDH與Ca2+的關(guān)系也得到Karmakar[43]、Sarty[44]等的證實(shí)，TDH可以誘導(dǎo)Ca2+從細(xì)胞外環(huán)境中流入細(xì)胞，同時(shí)使蛋白激酶C磷酸化，激活的蛋白激酶C可以抑制表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶活性，下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，而這正是結(jié)直腸癌療法的靶點(diǎn)[43]，因此TDH在治療結(jié)直腸癌方面可能具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3.2耐熱直接相關(guān)溶血素

Nishibuchi等[45]從臨床病例中分離得到一株KP－Vp毒株，這些毒株不產(chǎn)生TDH，這表明還存在另一種致病因子。研究發(fā)現(xiàn)這種致病因子與TDH類似，但是溶血譜不同，且不耐熱，稱之為TRH。編碼TRH的基因有trh1和trh2，基因相似性為84%。Kishishita等[32]發(fā)現(xiàn)trh1基因的表達(dá)量高于trh2，亞洲分離株和美國(guó)西海岸分離株中95%攜帶trh2基因的分離株不含tdh和trh1基因，從而推斷trh2 與tdh和trh1是難以共存的。研 究證明TDH和TRH的氨基酸序列具有67%的相似性且都具有溶血活性和腸毒素作用[46]，但導(dǎo)致它們?nèi)苎拿舾袆?dòng)物紅細(xì)胞的種類不同。

3.3不耐熱溶血素

Yanagase等[47]發(fā)現(xiàn)TLH在卵磷脂存在條件下才具有溶血活性，生化實(shí)驗(yàn)表明它是一種非典型的磷脂酶，主要分泌于Vp的細(xì)胞外，但TLH的功能和致病性仍不太明確，還需要進(jìn)一步研究。臨床分離株和環(huán)境分離株中都有tlh基因，而且具有高度保守性，因此早期的研究認(rèn)為tlh基因在Vp的檢測(cè)中具有很強(qiáng)的實(shí)用性，但隨后研究發(fā)現(xiàn)Vp與溶藻弧菌中的tlh基因相似性很高，僅判定tlh基因不足以對(duì)Vp進(jìn)行鑒定[48]，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)提高Vp的檢測(cè)水平具有重要意義。

4　Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）

細(xì)菌通過(guò)注射器狀的分泌系統(tǒng)把細(xì)菌的蛋白（效應(yīng)蛋白）通過(guò)由3 個(gè)細(xì)菌蛋白組成的膜孔（轉(zhuǎn)位子）注入到宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，從而進(jìn)一步的調(diào)控宿主的生理代謝[49]。T3SS通常由30～40 kb大小的基因編碼，以毒力島（pathogenicity island，PAI）的形式存在于細(xì)菌的質(zhì)粒或染色體上。T3SS通常由20 種以上的蛋白質(zhì)組成，這些蛋白質(zhì)可以分為4 類：結(jié)構(gòu)蛋白或者稱為裝置蛋白、轉(zhuǎn)位蛋白、效應(yīng)蛋白（或稱分泌蛋白）和分子伴侶[50]。全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)Vp有兩套T3SS，一套位于染色體1上，稱為T3SS1，另一套位于染色體2的PAI上，稱為T3SS2。T3SS2對(duì)毒力具有重要作用，又分為T3SS2α和T3SS2β兩個(gè)完全不同的遺傳譜系[51]。一般認(rèn)為，Vp主要由T3SS1貢獻(xiàn)細(xì)胞毒性，T3SS2具有腸毒性，但也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)T3SS2對(duì)Caco-2和HCT-8細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性[52-54]。

4.1T3SS1

T3SS1有一系列結(jié)構(gòu)蛋白，如vscA1-vscY1、vcrD1、vcrG1、vcrR1、vcrV1等[55]。Park等[56]發(fā)現(xiàn)敲除編碼內(nèi)膜蛋白的VcrD1基因后，Vp對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性降低，而將VcrD1基因互補(bǔ)表達(dá)后Vp毒性恢復(fù)到親本菌株水平，其他T3SS1的結(jié)構(gòu)基因也具有類似的細(xì)胞毒性；對(duì)T3SS1和T3SS2系統(tǒng)中的不同結(jié)構(gòu)基因缺失菌株進(jìn)行兔回腸結(jié)扎實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T3SS2結(jié)構(gòu)基因缺失株的回腸液積聚量明顯低于親本株，而T3SS1結(jié)構(gòu)基因缺失株的回腸積液量與親本株差異不顯著。

目前發(fā)現(xiàn)T3SS1可以轉(zhuǎn)位4 個(gè)效應(yīng)蛋白：VopQ、VopR、VopS和VPA0450，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性，使細(xì)胞裂解，內(nèi)容物外流[57-60]。這4 個(gè)蛋白的作用各不相同，VopQ是介導(dǎo)T3SS1對(duì)真核細(xì)胞毒性的最主要蛋白，可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬[58-60]；VopR并不直接導(dǎo)致細(xì)胞毒性，但對(duì)酵母具有致死作用，而預(yù)測(cè)的活性中心殘基突變后會(huì)失去活性，目前其具體作用機(jī)理還不清楚[58,60]；VopS可以使Rho家族的鳥苷三磷酸酶一磷酸腺苷化，導(dǎo)致細(xì)胞骨架破壞、細(xì)胞變圓然后裂解[59]；VPA0450是一個(gè)磷脂酰肌醇磷酸酶，可以誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白從質(zhì)膜上離位，從而使質(zhì)膜起泡[57-58]。

許多效應(yīng)蛋白的正確分泌需要伴侶蛋白，它們的編碼區(qū)通常與同源的效應(yīng)蛋白的編碼區(qū)非常接近[57]。目前已知的T3SS1特異的伴侶蛋白有2 個(gè)：VecA和VPA0451，前者是VopQ的伴侶蛋白，編碼區(qū)位于VopQ的上游，可以與VopQ直接結(jié)合，對(duì)其分泌和細(xì)胞質(zhì)穩(wěn)定性是必需的；后者是VPA0450的伴侶蛋白，是VPA0450轉(zhuǎn)位到宿主細(xì)胞膜內(nèi)必需的，VPA0451可以與VPA0450直接結(jié)合，其活性由第25～100 個(gè)氨基酸決定的[57,61-62]。4.2 T3SS2

Noriea等[51]對(duì)142 株分離株的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，T3SS2α組成基因存在于所有tdh+/trh－株中，而109 株tdh+株中則沒有，其中一個(gè)T3SS2α基因vopB2存在于所有tdh+/trh－臨床株中，而環(huán)境分離株中則不存在；T3SS2β存在于所有tdh－/trh+分離株中，而tdh+/trh－分離株中則沒有。Gotoh等[63]研究表明，膽汁可以誘導(dǎo)T3SS2相關(guān)蛋白及毒力島基因的表達(dá)，但膽汁酸螯合劑消膽胺可以降低其活性，這對(duì)其他Vp和霍亂弧菌也有效果，這為腸道細(xì)菌感染提供了新的治療方法。

目前已知的T3SS2的轉(zhuǎn)位蛋白有3 個(gè)：VopB2 （VPA1362）、VopD2（VPA1361）和VopW[49]。VopW是一種親水的轉(zhuǎn)位蛋白，并不插入到宿主細(xì)胞膜上，但是其對(duì)于另外兩個(gè)疏水轉(zhuǎn)位蛋白——VopB2和VopD2的插入是必需的，這兩個(gè)蛋白組成了跨膜的孔道。VopW是T3SS2效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)位到宿主細(xì)胞質(zhì)中所必需的，缺失突變掉VopW后菌株的毒力有明顯的下降；與其他親水的轉(zhuǎn)位蛋白不同，VopW可能同時(shí)具有轉(zhuǎn)位蛋白和效應(yīng)蛋白兩個(gè)功能，因?yàn)樗梢宰赞D(zhuǎn)位到宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[49]。

T3SS2有6 個(gè)效應(yīng)蛋白：VopA（VopP）、VopV、VopL、VopT、VopC、 VopZ[57]。其中，VopV是T3SS2的一個(gè)關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，其具有多個(gè)纖維狀肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)，而且其腸毒性與纖維狀肌動(dòng)蛋白結(jié)合活性有關(guān)[64]；VopZ是T3SS2致病性必需的一個(gè)新的效應(yīng)蛋白，它既可以抑制蛋白激酶1的激活，也能誘導(dǎo)Vp定殖于腸道并導(dǎo)致患者腹瀉和腸道致病性[65]。

Akeda等[61]通過(guò)Pull-down技術(shù)篩選到了T3SS2特異效應(yīng)蛋白VopC的伴侶蛋白VocC，這是目前已知的唯一的T3SS2特異伴侶蛋白，VocC可能對(duì)效應(yīng)蛋白VopC、VopL和VopT的分泌和穩(wěn)定性具有重要作用[57]，結(jié)合目前已經(jīng)得到鑒定的T3SS1特異伴侶蛋白VecA，這些發(fā)現(xiàn)為闡釋Vp通過(guò)T3SS分泌的效應(yīng)蛋白具有特異性提供了依據(jù)[61]。

目前，T3SS或其他分泌系統(tǒng)不斷有新的蛋白或者以前功能未知的蛋白得到確定，這將為進(jìn)一步揭示Vp對(duì)宿主造成損傷的機(jī)制，為深入了解Vp的致病機(jī)理提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。

5　尿素酶（urease）

尿素酶由Ure基因簇編碼，其分子質(zhì)量為275 kD，等電點(diǎn)為5.2。Cai Yunlong等[66]通過(guò)對(duì)純化的尿素酶進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其可以引起乳鼠的腸液積聚現(xiàn)象，從而表明尿素酶是Vp的一個(gè)重要的毒力因子。Suthienkul等[67]通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，所有的尿素酶陽(yáng)性菌都含有trh基因，但是尿素酶陰性菌則沒有此基因。Iida等[46]通過(guò)基因組分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Ure和trh基因序列都位于染色體DNA相鄰的編碼區(qū)，Ure和trh在同一NOTⅠ片段上，并且集中在染色體DNA的一小部分內(nèi)，因此認(rèn)為Vp菌株中的Ure同trh基因在遺傳學(xué)方面上具有一定的聯(lián)系，但尿素酶并不會(huì)抑制tdh和trh基因的表達(dá)[68]。

6　蛋白酶（proteases）

細(xì)菌分泌到菌體細(xì)胞外的蛋白酶在形成弧菌毒力中發(fā)揮了重要作用，例如，在霍亂弧菌中血球凝集素蛋白酶不僅可以激活霍亂腸毒素的A亞基，而且可以使細(xì)菌從宿主細(xì)胞膜上分離并且侵染其他宿主[69]，而Vp菌株同樣能分泌血球凝集素蛋白酶，但其作用機(jī)制尚不清楚。Sudheesh等[70]在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一株特殊的Vp菌株，該菌的胞外產(chǎn)物對(duì)虎蝦具有明顯殺傷作用但很少產(chǎn)生溶血素，對(duì)分離純化的胞外蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析發(fā)現(xiàn)有兩種蛋白均對(duì)對(duì)蝦有毒性，可能與Vp的致病性相關(guān)。Lee等[71]從不含tdh和trh基因的Vp臨床分離株中得到一種分子質(zhì)量為43 kD的蛋白酶A，通過(guò)細(xì)胞毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)純化后的蛋白酶A對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞具有明顯的毒性作用且對(duì)紅細(xì)胞具有溶解活性，還可造成組織溶血，嚴(yán)重時(shí)可引起小鼠死亡，可知此蛋白酶A為Vp的一種毒力因子。Kim等[72]對(duì)Vp中的金屬蛋白酶基因進(jìn)行克隆與表達(dá)，發(fā)現(xiàn)此蛋白酶與溶藻弧菌的膠原蛋白酶具有高度同源性，而溶藻弧菌膠原蛋白酶在細(xì)菌對(duì)宿主的感染中起到重要的作用，因此認(rèn)為該金屬蛋白酶在Vp感染中可能具有相似作用。

7　脂多糖（lipopolysaeeharide，LPS）

LPS是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要物質(zhì)，為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，由核心多糖、類脂A和多糖O抗原三部分組成。Bandekar等[73]研究證明Vp的LPS對(duì)鼠類腹膜巨噬細(xì)胞致病活性有一定的影響，通過(guò)改變LPS的劑量，可顯著增加細(xì)胞的RNA含量及腹膜巨噬細(xì)胞的溶酶體酶活性，并且還能刺激巨噬細(xì)胞的活性。

8　外膜蛋白（ outer membrane proteins，OMPs）

外膜蛋白是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁特有的成分，其在菌體自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著重要作用。病原菌OMPs作為一種重要的保護(hù)性抗原，可以對(duì)不同血清型的菌株感染產(chǎn)生交叉保護(hù)[74]。弧菌OMPs是一種寬宿主的外膜蛋白，位于細(xì)胞外膜表面，與外界有廣泛的接觸機(jī)會(huì)[75]。董傳甫等[76]通過(guò)對(duì)多株Vp的OMPs進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)一分子質(zhì)量為36 kD的外膜蛋白能夠被Vp抗血清所識(shí)別，其所具有的強(qiáng)免疫原性表明該外膜蛋白具備作為疫苗的可能性。李研東等[77]從Vp中提取的全部DNA中獲得編碼OMPs的基因，并在大腸桿菌中成功表達(dá)；免疫印跡分析顯示抗血清和重組蛋白產(chǎn)生了一條特異性反應(yīng)帶，表明Vp的OMPs具有較好的免疫原性，為其成為弧菌屬細(xì)菌的檢測(cè)作用靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

9　攝鐵系統(tǒng)（ferric uptake system）

鐵是一些致病性細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖中必不可少的元素，宿主細(xì)胞體內(nèi)的鐵主要存在于紅細(xì)胞、乳鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白中，游離的鐵離子極少，無(wú)法滿足細(xì)菌在生長(zhǎng)和繁殖中對(duì)鐵的需求[78]。病原弧菌獲得鐵的途徑主要有兩種：一是產(chǎn)生外毒素破壞紅細(xì)胞，釋放血紅素；二是產(chǎn)生一種低分子質(zhì)量的螯合劑鐵載體，對(duì)血紅素中的鐵離子具有高度親和力，形成的載體螯合物可以通過(guò)受體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中從而進(jìn)行鐵的同化[78]。Vp的攝鐵系統(tǒng)由鐵離子抑制性外膜蛋白和Fe3+螯合物組成。Vp可以產(chǎn)生一種能夠螯合鐵離子的載體，稱為弧菌鐵素（vibrioferrin），形成的鐵-鐵載體復(fù)合物可以通過(guò)細(xì)菌外膜蛋白弧菌鐵素和血紅素受體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞進(jìn)行鐵的同化[79]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在不含鐵的培養(yǎng)基中適當(dāng)增加鐵離子可以增強(qiáng)Vp對(duì)小鼠的致死性，在鐵缺乏的培養(yǎng)基中Vp產(chǎn)TDH的能力增強(qiáng)[78]。

10　結(jié) 語(yǔ)

由于Vp發(fā)病率相對(duì)較高且毒性也較強(qiáng)，因此其毒力因子及其致病機(jī)理受到了國(guó)內(nèi)外許多研究人員的關(guān)注，并且進(jìn)行了廣泛和深入的研究。目前研究人員在各種毒力因子致病性及致病機(jī)理方面取得了一些成果，但是距離完全解釋各種因子的致病性和致病機(jī)理及其之間的關(guān)系還有一定差距。另外，Vp的致病性是多種因子共同作用的結(jié)果，所以需要對(duì)各種毒力因子進(jìn)行綜合分析，但到目前為止，各毒力因子之間的相互作用與關(guān)系還不是十分清楚，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)與研究方能確定。隨著Vp的全基因組序列測(cè)定結(jié)果的完成，必將為Vp毒力因子致病性的研究、Vp導(dǎo)致機(jī)體損傷的機(jī)制等提供新的思路和科學(xué)依據(jù)，對(duì)提高Vp的檢測(cè)水平、開發(fā)免疫保護(hù)效果的疫苗、療效更好的藥物或細(xì)菌特異性的抑制劑與受體阻斷劑的、探索新的防治方法等提供很大的幫助。

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Recent Progress in Research on Vibrio parahaemolyticus Virulence Factors and Pathogenic Mechanism

ZHANG Defu1, FU Xulei1, ZHANG Ming2, YANG Wenhui3, YANG Huiying3, TANG Yiwei1, GAO Xue1, XU Yongxia1, LI Jianrong1,*
(1. Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province, College of Food Science and Engineering, Bohai University, Jinzhou 121013, China; 2. College of New Energy, Bohai University, Jinzhou 121013, China; 3. State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China)

Abstract:Vibrio parahaemolyticus is one of the key foodborne pathogens and its virulence factors include adherence factors, invasiveness factors, hemolysins, urease, lipopolysaccharide, outer membrane proteins, type Ⅲ secretion system and ferric uptake system. In this article, V. parahaemolyticus virulence factors and its pathogenic mechanism are summarized, which will hopefully provide references for further research of the molecular pathogenesis, and rapid and accurate detection of V. parahaemolyticus.

Key words:Vibrio parahaemolyticus; virulence factors; pathogenesis; hemolysin; type Ⅲ secretion system

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507040

中圖分類號(hào)：TS201.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2015）07-0216-07

*通信作者：勵(lì)建榮（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品和果蔬貯藏加工，食品安全。E-mail：lijr6491@163.com

作者簡(jiǎn)介：張德福（1983—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭吃葱圆≡⑸锏臋z測(cè)、控制及致病機(jī)理。E-mail：zhangdf@bhu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471639）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD29B06）；遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（LNSAKF2013018；LNSAKF2011040）；渤海大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（BSQD022）

收稿日期：2014-05-02