環(huán)孢子蟲(chóng)食源性感染及其檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

李俊強(qiáng)，孫芳芳，王榮軍，張龍現(xiàn)*

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南省人獸共患病國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

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環(huán)孢子蟲(chóng)食源性感染及其檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

李俊強(qiáng)，孫芳芳，王榮軍，張龍現(xiàn)*

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南省人獸共患病國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

摘 要：環(huán)孢子蟲(chóng)（Cyclospora）是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)寄生的腸道寄生性原蟲(chóng)，食入被環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊污染的蔬菜或水果會(huì)引起感染發(fā)病，環(huán)孢子蟲(chóng)主要寄生于人類和嚙齒類、爬行類、哺乳類、非人靈長(zhǎng)類等動(dòng)物體內(nèi)。環(huán)孢子蟲(chóng)病在世界范圍內(nèi)散在感染或暴發(fā)流行，主要引起人和動(dòng)物的胃腸炎和腹瀉等癥狀，甚至導(dǎo)致死亡，造成嚴(yán)重的健康威脅和經(jīng)濟(jì)損失。本文概述近幾年來(lái)環(huán)孢子蟲(chóng)的分類情況、遺傳特性研究、流行病學(xué)現(xiàn)狀以及常用檢測(cè)技術(shù)等方面的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：環(huán)孢子蟲(chóng)；食源性感染；流行性；檢測(cè)技術(shù)

環(huán)孢子蟲(chóng)（Cyclospora）是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)寄生的腸道寄生性原蟲(chóng)，引起人和動(dòng)物的胃腸炎和腹瀉，同時(shí)還伴隨有食欲減退、乏力、腹脹、腹痛、惡心、嘔吐、體質(zhì)量減輕等癥狀，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡[1]。光學(xué)顯微鏡下，環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊是一個(gè)近球形的折射體，中間是桑葚胚，卵囊直徑為8.6 μm（7.7～9.9 μm）[2]，經(jīng)改良抗酸染色多呈深紅色或不著色[3]。紫外激發(fā)光照射下，其卵囊壁在330～380 nm波長(zhǎng)范圍光譜下發(fā)藍(lán)色熒光，在450～490 nm波長(zhǎng)范圍光譜下發(fā)綠色熒光[4]。環(huán)孢子蟲(chóng)的生活史是單宿主型，可以分為無(wú)性生殖和有性生殖階段[2,5]。具有感染性的孢子化卵囊含有兩個(gè)孢子囊，且每個(gè)孢子囊含有兩個(gè)子孢子[2,6]。

自Ashford[7]于1979年在巴布亞新幾內(nèi)亞的腹瀉患者糞便中首次檢測(cè)到環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊，到目前包括非洲在內(nèi)[8]的世界各地陸續(xù)有環(huán)孢子蟲(chóng)感染的報(bào)道。最初，環(huán)孢子蟲(chóng)被認(rèn)為是球蟲(chóng)樣或藍(lán)藻樣小體，隨后到1994年才確定其分類地位[6]。1990年之前環(huán)孢子蟲(chóng)感染僅為散在的報(bào)道[1]，自1996—1997年期間美國(guó)和加拿大有大規(guī)模環(huán)孢子蟲(chóng)病的暴發(fā)，對(duì)其傳播來(lái)源追蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，此次暴發(fā)主要是由于誤食從危地馬拉進(jìn)口的木莓而引起[1-2]；2000年德國(guó)環(huán)孢子蟲(chóng)病暴發(fā)與法國(guó)和意大利南部農(nóng)場(chǎng)出產(chǎn)的萵苣有關(guān)[9]，這是歐洲首次對(duì)于環(huán)孢子蟲(chóng)病暴發(fā)的報(bào)道；再到2013年環(huán)孢子蟲(chóng)病在美國(guó)25 個(gè)州的暴發(fā)，造成了嚴(yán)重的危害[10]，因此環(huán)孢子蟲(chóng)病越來(lái)越受到重視和研究。

1　環(huán)孢子蟲(chóng)的分類及遺傳特性

1.1分類

在分類上，環(huán)孢子蟲(chóng)屬于頂復(fù)門孢子蟲(chóng)綱球蟲(chóng)亞綱艾美耳科環(huán)孢子蟲(chóng)屬[2,6]。到目前為止，環(huán)孢子蟲(chóng)已報(bào)道的有19 個(gè)種[11]（Cyclospora glomericola、C. caryolytica、C. viperae、C. babaulti、C. scinci、C. tropidonoti、C. zamenis、Cyclospra sp.、C. niniae、C. talpae、C. megacephali、C. ashtabulensis、C. parascalopi、C. angimurinensis、C. cayetanensis、C. cercopitheci、C. colobi、C. papionis、C. schneideri n. sp），宿主包括嚙齒類、爬行類、非人靈長(zhǎng)類和人類等，還發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的一些未定種[12-13]。

1.2遺傳特性研究

微生物基因組中的保守區(qū)和高變區(qū)域的特征已經(jīng)被廣泛研究，進(jìn)行相關(guān)的遺傳特性研究。利用分子生物學(xué)工具研究的環(huán)孢子蟲(chóng)種只有從哺乳動(dòng)物中獲得的5 種，包括寄生于人體的C. cayetanensis[2]、寄生于非人靈長(zhǎng)類的C. cercopitheci、C. colobi、C. papionis[14-16]和寄生于奶牛的環(huán)孢子蟲(chóng)[12]。

應(yīng)當(dāng)注意的是18S rRNA基因具有高度保守性，因此，18S rRNA基因?qū)^(qū)分人環(huán)孢子蟲(chóng)（C. cayetanensis）或其他環(huán)孢子蟲(chóng)種的不同分離株之間的親緣關(guān)系十分有用。已經(jīng)有研究者利用環(huán)孢子蟲(chóng)18S rRNA基因區(qū)分環(huán)孢子蟲(chóng)和其他的頂復(fù)門寄生蟲(chóng)[17]。另外，分析來(lái)源于人和狒狒的環(huán)孢子蟲(chóng)分離株的18S rRNA基因顯示有1.6%～1.7%的差異，然而人和狒狒環(huán)孢子蟲(chóng)的分離株之間的差異分別有0.78%和0.73%[18]。在另一項(xiàng)研究中顯示，C. papionis、C. colobi和C. cercopitheci的18S rRNA基因與人分離株有0.3%～0.6%的序列差異[14]。針對(duì)其他哺乳動(dòng)物的環(huán)孢子蟲(chóng)的18S rRNA基因的研究也在進(jìn)行，主要集中在非人靈長(zhǎng)類和奶牛。高振永等[19]根據(jù)猴源環(huán)孢子蟲(chóng)18S rRNA基因序列，設(shè)計(jì)保守引物，并進(jìn)行了特異性和敏感性實(shí)驗(yàn)。隨后，Li Wei等[20]對(duì)從肯尼亞捕獲的狒狒樣品中，擴(kuò)增了18S rRNA基因的部分序列，并對(duì)其進(jìn)行了分子種系發(fā)育分析。

由于18S rRNA基因的高度保守性，限制了其區(qū)分親緣關(guān)系較近物種的能力，因此要進(jìn)行環(huán)孢子蟲(chóng)屬內(nèi)的鑒定，需要相對(duì)多態(tài)的序列作為靶基因。已經(jīng)有運(yùn)用高變異的ITS-1 基因區(qū)分了人環(huán)孢子蟲(chóng)（C. cayetanensis）和狒狒環(huán)孢子蟲(chóng)（C. papionis）。Olivier等[21]運(yùn)用高變異的ITS-1區(qū)域序列區(qū)分人環(huán)孢子蟲(chóng)（C. cayetanensis）和狒狒環(huán)孢子蟲(chóng)（C. papionis），發(fā)現(xiàn)ITS-1序列為高度變異的區(qū)域，人環(huán)孢子蟲(chóng)和狒狒環(huán)孢子蟲(chóng)的ITS-1基因序列存在差異?？紤]到C. cayetanensis分離株的ITS-1序列的變異性（0%～6.5%），內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）美國(guó)分離株（8.3%）比危地馬拉分離株（3.8%）序列變異大，但是序列和地理差異沒(méi)有相關(guān)性。從沒(méi)有國(guó)外旅游歷史的美國(guó)人獲得的樣品觀察到序列有高變異性顯示，環(huán)孢子蟲(chóng)主要呈地方流行性。5 份1996年在美國(guó)暴發(fā)時(shí)獲得的分離株ITS-1序列相同，然而與在危地馬拉和秘魯分離株的ITS-1序列有差異。在所有的ITS-1基因序列中，共感染或多拷貝也許能解釋ITS-1區(qū)域的變異性較大的原因。人環(huán)孢子蟲(chóng)（C. cayetanensis）和狒狒環(huán)孢子蟲(chóng)（C. papionis）的5.8S rRNA基因已經(jīng)測(cè)序完成，經(jīng)過(guò)校正以后的序列顯示其高度的保守性。2013年，Sulaiman等[22]建立了一種基于HSP 70蛋白基因的快速檢測(cè)人環(huán)孢子蟲(chóng)（C. cayetanensis）的方法，結(jié)果顯示HSP 70蛋白基因在不同分離株之間未發(fā)現(xiàn)存在多態(tài)性。

環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊需要在外界適當(dāng)?shù)臈l件下分化一段時(shí)間，才能發(fā)育為含有兩個(gè)子孢子的具有感染性的孢子化卵囊。在食物或是水中的環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊是否具有感染性，對(duì)于環(huán)孢子蟲(chóng)的傳播感染是十分重要的。雖然聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）能有效地在不同樣品中檢測(cè)環(huán)孢子蟲(chóng)，但是不能區(qū)分孢子化和未孢子化卵囊。

2　環(huán)孢子蟲(chóng)的流行性

2.1流行地區(qū)

表1　旅游者感染環(huán)孢子蟲(chóng)的報(bào)道[[22]]Table 1 Case reports of Cyclossppoorraa infection in returning travelers[[22]]

環(huán)孢子蟲(chóng)的感染主要集中在旅游者（表1）、艾滋病人和呈地方流行（無(wú)旅游史）地區(qū)的居民（表2）。1995年之前僅有散在環(huán)孢子蟲(chóng)感染的報(bào)道。1996—1997年間，美國(guó)和加拿大有大規(guī)模的環(huán)孢子蟲(chóng)病暴發(fā)，共有2 944 個(gè)環(huán)孢子蟲(chóng)感染病例[1]。自2000年以來(lái)，在美國(guó)、加拿大、英國(guó)、土耳其、哥倫比亞、南非等國(guó)家和地區(qū)相繼暴發(fā)，總共超過(guò)550 例確診環(huán)孢子蟲(chóng)病病例[2,23]。2014年墨西哥又報(bào)道了一例從秘魯飛行回來(lái)的航空飛行員感染環(huán)孢子蟲(chóng)的病例[24]，環(huán)孢子蟲(chóng)病越來(lái)越受到人們的重視。特別是2013年6月以來(lái)，截止9月20日，在美國(guó)包括紐約州在內(nèi)的愛(ài)荷華州、內(nèi)布拉斯加州和德克薩斯州等25 個(gè)州的643 例感染環(huán)孢子蟲(chóng)的確診病例，有近8%的病例（49 例）由于嚴(yán)重腹瀉而住院，目前還沒(méi)有死亡的報(bào)道[10]。我國(guó)于1995年首次報(bào)道環(huán)孢子蟲(chóng)感染病例，隨后浙江、安徽、云南等地均有環(huán)孢子蟲(chóng)感染病例報(bào)告[23,25]。2011年，Zhou Yang等[3]報(bào)道了河南省住院病人的環(huán)孢子蟲(chóng)感染情況。環(huán)孢子蟲(chóng)的流行性越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視?？梢?jiàn)，環(huán)孢子蟲(chóng)病在世界范圍內(nèi)流行，在無(wú)論是像我國(guó)一樣的發(fā)展中國(guó)家還是歐美發(fā)達(dá)國(guó)家都造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，甚至危及人們的生命健康。

表2　無(wú)旅游史的環(huán)孢子蟲(chóng)感染情況[[22]]Table 2 Case reports of individuals with Cyclossppoorraa infection and without traveling history[[22]]

2.2流行季節(jié)

環(huán)孢子蟲(chóng)病的暴發(fā)具有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生于溫暖多雨的夏秋季節(jié)，這可能與感染性的孢子化卵囊需要一定的溫度才能孢子化有關(guān)，又由于夏秋季節(jié)與水接觸頻繁而且有生食蔬菜和水果的習(xí)慣，同樣為環(huán)孢子蟲(chóng)的傳播創(chuàng)造了條件。經(jīng)過(guò)5 年在秘魯?shù)恼{(diào)查結(jié)果表明，環(huán)孢子蟲(chóng)病多發(fā)于1—7月，而發(fā)病高峰集中在4—6月。同樣有學(xué)者統(tǒng)計(jì)1995—1999年間美國(guó)和加拿大環(huán)孢子蟲(chóng)病的暴發(fā)，其中97.8%的感染集中在晚春和初夏季節(jié)，而4—7月為發(fā)病高峰期[1]。Hoge等[26]調(diào)查發(fā)現(xiàn)尼泊爾的環(huán)孢子蟲(chóng)感染主要發(fā)生在雨季，在危地馬拉Bern等[27]通過(guò)對(duì)糞便樣品的監(jiān)測(cè)證實(shí)環(huán) 孢子蟲(chóng)病流行高峰期在7月份。2006—2009年期間，Ozdamar等[28]在土耳其伊斯坦布爾進(jìn)行了人環(huán)孢子蟲(chóng)（C. cayetanensis）病流行病學(xué)調(diào)查，使用光學(xué)、熒光顯微鏡和改良抗酸染色的方法來(lái)檢查環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊，陽(yáng)性樣品擴(kuò)增基因組的ITS-1區(qū)域進(jìn)行確認(rèn)，調(diào)查發(fā)現(xiàn)環(huán)孢子蟲(chóng)病集中發(fā)病于7月份的15 d內(nèi)。2009—2010年，Zhou Yang等[3]對(duì)河南鄭州和開(kāi)封地區(qū)的臨床住院病人進(jìn)行了為期一年的腸道寄生蟲(chóng)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)環(huán)孢子蟲(chóng)感染率為0.70%（81/11 554），并且感染具有明顯的季節(jié)性，主要集中于夏秋季節(jié)（7—11月）。同樣，2013年美國(guó)環(huán)孢子蟲(chóng)病的暴發(fā)，其感染者主要集中于6月中旬和7月中旬[10]。

2.3傳播途徑

目前盡管對(duì)環(huán)孢子蟲(chóng)的傳播途徑仍不是很清楚，但有不少研究報(bào)告認(rèn)為環(huán)孢子蟲(chóng)主要通過(guò)食源性蔬菜或水果進(jìn)行傳播。1996—1997年之間，美國(guó)和加拿大的環(huán)孢子蟲(chóng)病暴發(fā)是由于食用從危地馬拉進(jìn)口的木莓引起[1]。1999年夏天，美國(guó)密蘇里州環(huán)孢子蟲(chóng)病暴發(fā)是通過(guò)食用受環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊污染的蔬菜沙拉而傳播[1]。2000年歐洲首次環(huán)孢子蟲(chóng)病的暴發(fā)與從法國(guó)和意大利南部農(nóng)場(chǎng)進(jìn)口的萵苣有關(guān)[9]。2013年美國(guó)25 個(gè)州的環(huán)孢子蟲(chóng)病暴發(fā)，到目前為止還沒(méi)有確定其感染來(lái)源，但存在以下可能，1）從墨西哥進(jìn)口的農(nóng)產(chǎn)品受到環(huán)孢子卵囊蟲(chóng)污染，從德克薩斯州貨運(yùn)到北部的愛(ài)荷華州、內(nèi)布拉斯加州造成傳播；2）由泰勒農(nóng)場(chǎng)的農(nóng)作物受到環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊污染造成；3）大范圍的水源污染也可能導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品的污染[10]。其中，2003年，Dowd等[29]在危地馬拉市周圍的鄉(xiāng)村居民水源地檢測(cè)到人環(huán)孢子蟲(chóng)的存在，這是首次在飲用水中發(fā)現(xiàn)環(huán)孢子蟲(chóng)，表明環(huán)孢子蟲(chóng)可能通過(guò)水源傳播。之后，無(wú)論是用于灌溉或是蔬菜加工的水中都檢測(cè)到了環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊[30]。

環(huán)孢子蟲(chóng)感染者的糞便中含有大量卵囊，因而糞便為該病的傳染源[31]。然而大量的證據(jù)表明，環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊可能是直接污染蔬菜類草本植物或是通過(guò)含有環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊的水體被誤食而引起人體的感染。環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊在23～30 ℃的條件下貯藏7～15 d分化為含有兩個(gè)孢子囊的具有感染性的孢子化卵囊才具有傳染性，所以人與人之間是否能直接傳播還有待進(jìn)一步研究。表3列出了1990年至今環(huán)孢子蟲(chóng)食源性和水源性暴發(fā)流行的國(guó)家及地區(qū)、發(fā)病人數(shù)、發(fā)病傳播媒介及可能來(lái)源，顯示美國(guó)和加拿大的多個(gè)地區(qū)環(huán)孢子蟲(chóng)病的暴發(fā)與蔬菜、水果、食物或水源有直接關(guān)系。

表3　食源性和水源性暴發(fā)的環(huán)孢子蟲(chóng)感染情況[[22]]Table 3 Reported food- and water-borne Cyclossppoorraa outbreaks[[22]]

2.4易感年齡

2006年，Sancak等[32]報(bào)道了土耳其5 例年齡在27～67 歲之間，免疫功能正常的住院病人糞便中檢測(cè)到環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊；而王克霞等[33]對(duì)安徽省不同地區(qū)的環(huán)孢子蟲(chóng)感染情況進(jìn)行的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有腹瀉癥狀兒童的感染率為5.62%；2013年，Tandukar等[34]對(duì)尼泊爾的在校兒童的腸道寄生蟲(chóng)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢子蟲(chóng)的感染率為1.6%，高于其他年齡段的環(huán)孢子蟲(chóng)感染情況。2011年進(jìn)行的在對(duì)河南省鄭州和開(kāi)封兩地為期兩年的住院病人的腸道寄生蟲(chóng)的感染情況調(diào)查顯示，環(huán)孢子蟲(chóng)的感染率為0.70%，其中7～17 歲年齡組的環(huán)孢子蟲(chóng)的檢出率最高為1.47%[3]。2013年美國(guó)環(huán)孢子蟲(chóng)病大暴發(fā)，其感染年齡從不到1 歲至94 歲，平均年齡為52 歲[10]?？梢?jiàn)環(huán)孢子蟲(chóng)的感染主要集中在免疫力低下的小孩和老人，但是環(huán)孢子蟲(chóng)在不同地區(qū)具有不同的流行傳播特點(diǎn)，其易感人群也有所不同。

3　檢 測(cè)技術(shù)

目前，研究者普遍懷疑環(huán)孢子蟲(chóng)的感染是由于患者食入被環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊污染的羅勒、香菜、生菜、馬郁蘭和薄荷等草本植物類食物，或飲用被環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊污染的水源，但隨糞便排出的卵囊需在適宜的環(huán)境中數(shù)天至數(shù)周孢子化后才具有感染性。環(huán)孢子蟲(chóng)的檢測(cè)對(duì)于環(huán)孢子蟲(chóng)病的流行病學(xué)研究有著特殊而重要的意義，是環(huán)孢子蟲(chóng)病防控的主要依據(jù)。

3.1常規(guī)檢測(cè)技術(shù)

環(huán)孢子蟲(chóng)的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)包括顯微鏡檢測(cè)、改良抗酸染色和孢子化實(shí)驗(yàn)等方法。環(huán)孢子蟲(chóng)在光學(xué)顯微鏡下卵囊是一個(gè)近似球形的折射體，中間是桑葚胚，卵囊直徑為8～10 μm，經(jīng)改良抗酸染色多呈深紅色，孢子化卵囊含有兩個(gè)孢子囊，且每個(gè)孢子囊含有兩個(gè)子孢子（圖1）[3]。由于環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊通常在草本植物和飲水中的含有量較少，在使用常規(guī)顯微鏡檢測(cè)和改良抗酸染色檢測(cè)時(shí)，需要將植物或是水體中的環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊濃集，另外，傳統(tǒng)的卵囊檢測(cè)方法敏感性低、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、易造成檢測(cè)人員眼疲勞、受到檢測(cè)人員知識(shí)水平限制，以及糞便中的雜質(zhì)會(huì)造成假陽(yáng)性或假陰性等影響檢測(cè)結(jié)果。

圖1　環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊形態(tài)結(jié)構(gòu)（1 000×）[[33]]Fig.1 Cyclospora cayetanensis oocysts examined by microscope (1 000 ×)[3]

3.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)

近年來(lái)出現(xiàn)了一種新的檢測(cè)環(huán)境中和臨床樣品中環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊的方法，即流式細(xì)胞術(shù)。在熒光顯微鏡下使用330～380 nm波長(zhǎng)范圍的濾光器，環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊發(fā)藍(lán)光熒光[3]，利用這個(gè)特性可以用于環(huán)孢子蟲(chóng)的檢測(cè)和流行病學(xué)的調(diào)查。Dixon等[35]利用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)人糞便中的環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊，李俊強(qiáng)等[36]建立了卡耶坦環(huán)孢子蟲(chóng)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法，結(jié)果顯示該方法的敏感性比顯微鏡檢查法高。由于糞便樣品的時(shí)間和貯藏條件會(huì)影響卵囊熒光的強(qiáng)度，可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。血清學(xué)篩選實(shí)驗(yàn)同樣也可以用于環(huán)孢子蟲(chóng)的檢測(cè)，有利于大范圍的環(huán)孢子蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查，但是由于目前還沒(méi)有針對(duì)環(huán)孢子蟲(chóng)的特異性抗體，限制了其廣泛應(yīng)用。

3.3分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，微生物的基因組中的多變區(qū)域的特征已經(jīng)被廣泛的研究，以了解它們?cè)诹餍胁W(xué)中的地位，環(huán)孢子蟲(chóng)不同分離株之間的基因組學(xué)可以追蹤其傳染來(lái)源，在環(huán)孢子蟲(chóng)病的分子流行病學(xué)調(diào)查和檢測(cè)研究中有重要的意義。

3.3.1 巢式PCR（nest-PCR）

2006年，Helmy等[37]對(duì)顯微鏡鏡檢和nest-PCR檢測(cè)環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊這兩種方法比較，結(jié)果顯示nest-PCR方法具有更高的特異性和敏感性。Orlandi等[38]基于18S rRNA基因部分序列成功擴(kuò)增了木莓樣品中的環(huán)孢子蟲(chóng)，靈敏度可達(dá)30 個(gè)卵囊/100 g；同樣利用PCR方法檢測(cè)木莓、羅勒、萵苣中的環(huán)孢子蟲(chóng)（C. cayetsanensis）卵囊，靈敏度可分別達(dá)到40～100 個(gè)/100 g。針對(duì)其他哺乳動(dòng)物的環(huán)孢子蟲(chóng)的18S rRNA基因的研究也在進(jìn)行，主要為奶牛環(huán)孢子蟲(chóng)[12]和非人靈長(zhǎng)類環(huán)孢子蟲(chóng)[14-16]的感染報(bào)道和分子鑒定等方面。

由 于ITS基因轉(zhuǎn)錄但不編碼蛋白，因此它不具有結(jié)構(gòu)功能的限制。長(zhǎng)期以來(lái)，ITS基因已經(jīng)用于植物基因組和進(jìn)化的研究，同樣ITS基因也可以作為環(huán)孢子蟲(chóng)分子鑒定的靶基因。針對(duì)ITS-1靶基因，許多學(xué)者擴(kuò)增了多種環(huán)孢子蟲(chóng)的ITS-1基因序列。2000年，Adam等[39]研究了與木霉進(jìn)口有關(guān)的環(huán)孢子蟲(chóng)暴發(fā)的病例分離株、危地馬拉和秘魯環(huán)孢子蟲(chóng)病的分離株進(jìn)行ITS-1基因序列比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單克隆基因組的ITS-1區(qū)域存在多樣性。Ozdamar 等[28]在土耳其伊斯坦布爾進(jìn)行了人環(huán)孢子蟲(chóng)陽(yáng)性樣品的ITS-1基因進(jìn)行了擴(kuò)增。ITS-1基因具有高的拷貝數(shù)，序列多變和長(zhǎng)度適中等優(yōu)點(diǎn)，致使這個(gè)基因成為基因分型的理想靶基因。

3.3.2 PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）

近年來(lái)，PCR-RFLP方法已被廣泛用于各類寄生蟲(chóng)的分類與鑒定，該方法可有效地區(qū)分種間和種內(nèi)差異，是研究親緣關(guān)系較近 物種之間和物種內(nèi)遺傳結(jié)構(gòu)的重要工具。2003年，Shields等[40]以18S rRNA基因?yàn)榘谢?，并使用限制性?nèi)切酶AluⅠ，建立了一種檢測(cè)環(huán)境水中環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊的巢式PCR-RFLP方法，可以將環(huán)孢子蟲(chóng)的目的基因序列與可能發(fā)生交叉反應(yīng)的其他序列區(qū)別。2006年，肖淑敏等[12]以進(jìn)化速度相對(duì)較慢的18S rRNA基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)了兩對(duì)相對(duì)保守的引物利用巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并以KpnⅠ酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行RFLP分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增的18S rRNA基因片段為501 bp，不具有KpnⅠ酶切位點(diǎn)，與反芻獸的艾美耳球蟲(chóng)的酶切圖譜具有明顯的差別，進(jìn)而將環(huán)孢子蟲(chóng)與艾美耳球蟲(chóng)區(qū)分。

3.3.3 PCR-寡核苷酸連接分析（PCR-oligonucleotide ligation assay，PCR-OLA）

Xiao Shumin等[41]建立了一種檢測(cè)臨床樣品中環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊的PCR-OLA，對(duì)牛源環(huán)孢子蟲(chóng)進(jìn)行了檢測(cè)，并且將PCR-OLA與常規(guī)PCR進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示該方法比常規(guī)的PCR方法敏感度高，并且能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)單個(gè)核苷酸的不同，而且PCR-OLA在對(duì)臨床上牛源環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊的檢測(cè)上，具有快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

3.3.4 多重PCR（multiplex PCR）

Orlandi等[42]于2003年利用多重PCR，根據(jù)18S rRNA基因的單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphisms）設(shè)計(jì)了一系列種屬特異性引物，對(duì)環(huán)孢子蟲(chóng)與艾美耳球蟲(chóng)進(jìn)行了區(qū)分。2006年，Hussein[43]利用多重PCR對(duì)人環(huán)孢子蟲(chóng)（C. cayetanensis）、長(zhǎng)尾猴環(huán)孢子蟲(chóng)（C. cercopitheci）、疣猴環(huán)孢子蟲(chóng)（C. colobi）和狒狒環(huán)孢子蟲(chóng)（C. papionis）進(jìn)行了分子鑒定，與常規(guī)檢測(cè)方法和Nest-PCR進(jìn)行比較，并對(duì)來(lái)自35 個(gè)患者體內(nèi)環(huán)孢子蟲(chóng)的18S rRNA基因的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示多重PCR具有較高的特異性和靈敏性。2010年，Lee等[44]建立了一種簡(jiǎn)單、快速、高效的多重PCR方法用于環(huán)孢子蟲(chóng)的檢測(cè)，檢測(cè)限為101～102 個(gè)卵囊。隨后，Taniuchi等[45]檢測(cè)了多重PCR的特異性，表明其對(duì)于環(huán)孢子蟲(chóng)暴發(fā)是有效的快速檢測(cè)方法。

3.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）

2003年，Varma等[46]首次報(bào)道了qPCR技術(shù)在環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊檢測(cè)上的應(yīng)用，其根據(jù)環(huán)孢子蟲(chóng)18S rRNA基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和兩個(gè)熒光標(biāo)記的雜交探針，結(jié)果顯示qPCR最少可檢測(cè)到5 μL反應(yīng)體系中相當(dāng)于單個(gè)環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊的DNA。此外，針對(duì)環(huán)孢子蟲(chóng)的卵囊壁難于溶解和樣品中存在較多影響PCR結(jié)果的制約因素，新的改進(jìn)方法不斷出現(xiàn)。2008年，Lalonde等[47]建立了一種敏感性高和特異性強(qiáng)的檢測(cè)環(huán)孢子蟲(chóng)卵囊的PCR方法，該方法對(duì)水和羅勒洗滌液中不同數(shù)量級(jí)（分別為1 000、100、10、1）的卵囊進(jìn)行DNA的反復(fù)提取，結(jié)果顯示水和羅勒洗滌液中的卵囊數(shù)量級(jí)越高，用于環(huán)孢子蟲(chóng)PCR成功擴(kuò)增所要提取的DNA次數(shù)就越少。

4　結(jié) 語(yǔ)

環(huán)孢子蟲(chóng)病例經(jīng)常在世界各地散發(fā)感染，但是1996年美國(guó)和加拿大的大規(guī)模暴發(fā)、2000年歐洲的首次暴發(fā)、以及2013年美國(guó)環(huán)孢子蟲(chóng)的暴發(fā)，引起越來(lái)越多研究者的重視。我國(guó)有關(guān)環(huán)孢子蟲(chóng)感染的報(bào)道也時(shí)有發(fā)生，但其來(lái)源還未完全清楚，其流行病學(xué)和檢測(cè)研究有待更進(jìn)一步。因此，通過(guò)嚴(yán)格控制水源和食物源，避免環(huán)孢子蟲(chóng)的污染；加強(qiáng)檢疫，建立方便可靠的檢測(cè)方法，避免 隨食品進(jìn)口或長(zhǎng)途運(yùn)輸而傳播環(huán)孢子蟲(chóng)，成為防治的重點(diǎn)。另一方面，根據(jù)環(huán)孢子蟲(chóng)的流行病學(xué)特點(diǎn)和分子生物學(xué)手段追溯其來(lái)源也成為研究的熱點(diǎn)和防治的基礎(chǔ)。

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Advances in Research on Food-Borne Infection and Detection Methods of Cyclospora

LI Junqiang, SUN Fangfang, WANG Rongjun, ZHANG Longxian*

(International Joint Research Laboratory for Zoonotic Diseases of Henan, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Abstract:Cyclospora is a newly discovered protozoan parasite that can infect intestinal epithelial cells. The pathogen can be transmitted by consumption of vegetables or fruits contaminated with oocysts. It mainly parasitizes humans and rodents, reptiles, mammals including non-human primates, and other animals. Cyclosporiasis as a sporadic infection or outb reak can cause human and animal gastroenteritis and diarrhea, and even lead to death along with serious economic loss. This article summarizes Cyclospora classification, genetic characteristics, epidemiological status and commonly used detection techniques in recent years.

Key words:Cyclospora; food-borne infection; epidemiology; detection techniques

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507048

中圖分類號(hào)：R382.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2015）07-0261-07

*通信作者：張龍現(xiàn)（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿双F共患原蟲(chóng)生物學(xué)。E-mail：zhanglx8999@gmail.com

作者簡(jiǎn)介：李俊強(qiáng)（1987—），男，博士研究生，研究方向?yàn)槭吃葱圆≡飳W(xué)。E-mail：lijunqiangcool@126.com

基金項(xiàng)目：河南省高校人獸共患病病原生物學(xué)科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（012IRTSTHN005）；“十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2012ZX10004-220；2008ZX10004-011）

收稿日期：2014-07-02