外源添加物對食藥用菌液體發(fā)酵影響的研究進(jìn)展

韋朝陽，賀 亮，邵雙雙，馮依力，李衛(wèi)旗,*，程俊文

（1.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院，浙江 杭州 310016）

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外源添加物對食藥用菌液體發(fā)酵影響的研究進(jìn)展

韋朝陽1，賀 亮2，邵雙雙1，馮依力3，李衛(wèi)旗1,*，程俊文2

（1.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院，浙江 杭州 310016）

摘 要：食藥用菌發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同的添加物和合適的劑量，可顯著促進(jìn)菌絲生物量的提高和次生代謝產(chǎn)物的合成，文中綜述外源添加物中藥、生長因子、油脂類物質(zhì)、信號分子對食藥用菌液體發(fā)酵的影響以及添加物對食藥用菌液體發(fā)酵代謝調(diào)控的機(jī)理，為食藥用菌今后的研究與開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：外源添加物；食藥用菌；液體發(fā)酵；代謝調(diào)控

我國真菌資源豐富，至少有10萬余種，已經(jīng)報(bào)道的食藥用菌約為1 000 種，實(shí)驗(yàn)已探明具有藥效的真菌多達(dá)300余種，目前我國大量入藥應(yīng)用的食藥用菌僅數(shù)十種[1]。真菌中含有豐富的生物活性物質(zhì)，如真菌多糖、多肽、氨基酸、蛋白質(zhì)、生物堿、萜類化合物、色素類化合物、甾醇，還有核苷類物質(zhì)、酚、酯類、微量元素和維生素等[2-3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，冬蟲夏草、靈芝、茯苓、香菇等食藥用菌具有抗腫瘤活性、免疫調(diào)節(jié)、健胃保肝等功效，除此之外還具有活血止痛、抗氧化、抗病毒、抗疲勞、祛痰鎮(zhèn)咳等諸多活性作用[4-5]。

近年來，液體發(fā)酵技術(shù)關(guān)于提高食藥用菌發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量工藝的研究已經(jīng)有了長足的進(jìn)展，為食藥用菌的生產(chǎn)帶來了巨大的利潤和便利，具有廣闊的應(yīng)用前景，目前主要集中在培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化上，如碳源、氮源、無機(jī)鹽、溫度、pH值、轉(zhuǎn)速等[6-7]。傳統(tǒng)的發(fā)酵優(yōu)化策略對于提高食藥用菌的生物量和代謝物的產(chǎn)量是行之有效的，但除了此方法外，是否還可以另辟蹊徑呢？如何進(jìn)一步提高食藥用菌關(guān)鍵活性產(chǎn)物的產(chǎn)量仍是國內(nèi)外相關(guān)研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。近幾年，研究發(fā)現(xiàn)一些外源添加物如中藥薏苡仁、玉米油[8-9]等的添加，能較大幅度地提高食藥用菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，或是產(chǎn)生新的代謝物[10]，采用外源添加物對代謝產(chǎn)物的生物合成進(jìn)行調(diào)控成為食藥用菌發(fā)酵調(diào)控的新策略和新手段。文中綜述外源添加物中藥、生長因子、油脂類物質(zhì)、信號分子對食藥用菌液體發(fā)酵的影響及其代謝調(diào)控的機(jī)理，為食藥用菌今后的研究與開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　中 藥

食藥用菌可以分泌龐雜的酶系對中藥中的纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、脂類等豐富的營養(yǎng)成分加以利用，促進(jìn)真菌生長和產(chǎn)物合成，從而得到豐富的代謝產(chǎn)物。中藥發(fā)酵技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，真菌在代謝過程中還有可能對中藥中的萜類、黃酮類、生物堿、皂苷類 等某些活性物質(zhì)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，消除中藥毒副作用，甚至形成新的成分或是活性更高的物質(zhì)[11-13]，明顯增強(qiáng)發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性和藥理功能。目前，研究中所選用的中藥主要是草本植物和藥用昆蟲[14]（如蜣螂等），研究過程中探討了單味中藥和復(fù)合（2 味及2 味以上）中藥粉末、水提物、醇提物及不同劑量對食藥用菌液體發(fā)酵的影響，篩選出對食藥用菌生長和代謝產(chǎn)物合成具有促進(jìn)作用的中藥成分及最佳劑量，為食藥用菌的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

李羿等[15]將1 g/100 mL的薏苡仁、甘草、淡竹葉、桑葉、靈芝和枸杞子6 味中藥粉末分別加入茯苓發(fā)酵培養(yǎng)基中，對其進(jìn)行搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6 味中藥粉末對茯苓菌絲體的生長和胞外多糖的合成均有促進(jìn)作用，其中薏苡仁粉末最有利于菌體生長，枸杞粉末對胞外多糖的作用最為顯著；進(jìn)一步研究將6 味中藥粉末分別按質(zhì)量比1∶1的比例組成復(fù)合中藥加入茯苓發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出最優(yōu)培養(yǎng)基為添加薏苡仁和枸杞子粉末復(fù)合中藥的培養(yǎng)基，當(dāng)添加量為0.75%時(shí)，其菌絲體生物量最高達(dá)14.29 g/L，添加量為2.0%時(shí)胞外多糖產(chǎn)量最高達(dá)9.81 g/L，但該實(shí)驗(yàn)沒有排除中藥本身所含蛋白質(zhì)和多糖可能對真菌生物量和胞外多糖產(chǎn)量造成的干擾。采用中藥醇提物可基本排除中藥中多糖和蛋白質(zhì)的直接作用，更能反映中藥對真菌發(fā)酵影響的真實(shí)規(guī)律，侯曉梅等[16]報(bào)道187.5 g/L生藥量的薏苡仁水提物能促進(jìn)灰樹花菌絲體的生長，其生物量為對照組的1.24 倍，對灰樹花胞外多糖的影響最為顯著，其產(chǎn)量為對照組的2.78 倍。為了排除中藥本身所含多糖和蛋白質(zhì)的干擾，進(jìn)一步研究了薏苡仁的醇提物對灰樹花液體發(fā)酵的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)薏苡仁醇提物能有效促進(jìn)灰樹花菌絲體的生長和胞外多糖的分泌，當(dāng)其添加量為2.0 g/L時(shí)生物量是對照組的2.60 倍，當(dāng)其添加量為0.2 g/L時(shí)胞外多糖產(chǎn)量是對照組的1.33 倍，表明中藥薏苡仁對灰樹花活性產(chǎn)物合成的促進(jìn)作用并不是作為有效氮源或碳源而直接起作用的。其機(jī)理可能是中藥的添加改變了食藥用菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使真菌細(xì)胞壁透性增加，從而有利于營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌，或是中藥能影響胞外產(chǎn)物的生物合成途徑，使胞外產(chǎn)物大量合成[17]。

不同中藥對食藥用菌生長和代謝產(chǎn)物形成的影響是不同的，不同添加量的中藥對食藥用菌發(fā)酵的影響也各有差異。黃芪粉、茶葉粉、穿心蓮粉對茯苓菌體生長和胞外多糖的合成均有顯著促進(jìn)作用；麥芽粉、三七粉和葛根粉能刺激茯苓分泌胞外多糖，但抑制菌體細(xì)胞的生長，而鹿銜草粉正好相反，可有效促進(jìn)茯苓菌絲體的生長，但卻抑制了茯苓胞外多糖的合成或分泌；枸杞粉、山楂粉、丹參粉、茜草粉、連翹粉則不利于茯苓真菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)[18]。趙艷等[19]研究發(fā)現(xiàn)不同添加量的枸杞子醇提物對靈芝生物量和胞內(nèi)三萜產(chǎn)量的影響表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢，表明枸杞醇提物中可能同時(shí)存在促進(jìn)和抑制靈芝菌絲體生長和胞內(nèi)三萜合成的功能因子，當(dāng)枸杞醇提物的添加量＞200 mg/L時(shí)，隨著抑制因子的積累，其抑制作用強(qiáng)于促進(jìn)作用，因而菌絲體的生長和胞內(nèi)三萜合成均受到抑制，中藥對食藥用菌代謝產(chǎn)物合成的影響不是某些成分的直接作用，而是各種成分促進(jìn)與抑制綜合作用的結(jié)果。

食藥用菌發(fā)酵過程中，中藥也可能會(huì)對發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性和藥理功能產(chǎn)生影響。研究表明，添加陳皮水提物有助于提高冬蟲夏草胞外多糖的抗補(bǔ)體活性及抗氧化活性，抗補(bǔ)體活性由48.2%～68.7%提高到了58.0%～80.8%，抗壞血酸當(dāng)量抗氧化活性（ascorbic acid equivalent antioxidant capacity，AEAC）由142.8～219.5 mg/100 g提高到284.3～384.6 mg/100 g[20]。在靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中添加藥用昆蟲蜣螂水提物可以較大幅度地提高靈芝發(fā)酵物抗小鼠肝癌的活性，使靈芝發(fā)酵物的抑癌率比對照組發(fā)酵物提高了37.49%[21]。Lin Fangyi 等[22]也 有類似的報(bào)道，枸杞水提物對云芝的液體深層發(fā)酵具有顯著的促進(jìn)作用，其胞外糖肽產(chǎn)量和生物量分別是對照組的2.72 倍和1.56 倍，同時(shí)其胞外糖肽的免疫調(diào)節(jié)活性也得到明顯的提高。代謝產(chǎn)物活性的改變可能是培養(yǎng)基中添加中藥后，刺激或抑制了蟬擬青霉活性物質(zhì)的代謝量，或是蟬擬青霉在生長代謝過程中對某些中藥成分進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了新的次生代謝產(chǎn)物，從而改變代謝產(chǎn)物的活性。

2　生長因子

生長因子是微生物生長所必需且需求量很少的有機(jī)化合物，主要為維生素、氨基酸和代謝產(chǎn)物的前體等，作為酶的輔基或輔酶參與新陳代謝或是作為代謝產(chǎn)物的中間樞紐，對真菌菌絲生長、代謝產(chǎn)物的合成與分泌具有促進(jìn)作用。菌絲體生長過程中需要某些維生素類物質(zhì)參與代謝，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，VB1和VB2對桑黃菌絲生長均有不同程度的促進(jìn)作用，而且兩者合用具有協(xié)同作用，在PD培養(yǎng)基中添加0.3 g/L VB1和0.3 g/L VB2進(jìn)行發(fā)酵，有利于桑黃菌體增殖，提高多糖產(chǎn)量[23]。

添加前體物質(zhì)后，食藥用菌可以不需要自身合成而直接利用前體合成次生代謝產(chǎn)物，產(chǎn)物的產(chǎn)量因前體的加入而有較大的提高。王蕾等[24]篩選出CM001號與10號作為高產(chǎn)蟲草素的優(yōu)良菌株，在液體培養(yǎng)基中加入不同的前體物及營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果表明腺苷、腺嘌呤、丙氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸5 種物質(zhì)能大幅度提高兩種菌株的蟲草素產(chǎn)量，尤其腺嘌呤的效果最明顯，蟲草素總產(chǎn)量分別是空白對照組的5.57 倍和7.09 倍，而肌苷、鳥苷、半胱氨酸3 種物質(zhì)抑制了蟲草素的合成。腺苷是蟲草菌素的直接前體，腺嘌呤又是腺苷的前體，兩者均能有效地提高蟲草菌素產(chǎn)量，但腺嘌呤比腺苷更能迅速有效地被蛹蟲草細(xì)胞吸收與利用，腺嘌呤更有利于蟲草素的合成，因而對蟲草素產(chǎn)量的提高更顯著；丙氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸能提高蟲草素產(chǎn)量的原因可能是氨基酸營養(yǎng)物能與前體腺嘌呤和腺苷通過產(chǎn)生有效的協(xié)同互補(bǔ)作用使蟲草菌素產(chǎn)量得到大大的提高[25]。

4-乙酰基安卓奎諾爾B（4-acetylantroquinonol B）是牛樟芝的關(guān)鍵生物活性成分，Chiang等[26]認(rèn)為牛樟芝的某些揮發(fā)性化合物可能是它的前體，并從牛樟芝的揮發(fā)性化合物中篩選2,4,5-三甲氧基苯甲醛（2,4,5-trimethoxybenzaldehyde，TMBA）和橙花叔醇（nerolidol）作為發(fā)酵過程中的添加物，結(jié)果表明這兩種化合物均能顯著提高4-乙?；沧靠Z爾B的產(chǎn)量，但橙花叔醇在高質(zhì)量濃度（1 g/100 mL）時(shí)會(huì)產(chǎn)生反饋抑制作用，抑制4-乙?；沧靠Z爾B的合成；對于HepG2癌細(xì)胞的抗癌活性而言，兩種化合物均有利于增強(qiáng)4-乙酰基安卓奎諾爾B的抗癌活性，而且TMBA的作用較橙花叔醇更為顯著，因而TMBA是4-乙?；沧靠Z爾B的最佳前體。文獻(xiàn)報(bào)道，甾醇也可作為誘導(dǎo)因子增加豬苓甾體的積累，膽固醇、β-谷甾醇和豆甾醇3 種甾醇中，膽固醇最有利于豬苓甾體的積累，因其結(jié)構(gòu)更接近于甾體合成過程中的中間產(chǎn)物，且水溶解性較β-谷甾醇和豆甾 醇高，因而誘導(dǎo)效果最好，當(dāng)其添加質(zhì)量濃度為0.02 g/100 mL時(shí)，豬苓總甾體的凈增量最高，達(dá)到53.224 mg[27]。

3　油脂類物質(zhì)

研究發(fā)現(xiàn)一些油脂類物質(zhì)和表面活性劑在食藥用菌液體發(fā)酵生產(chǎn)中除了作為消泡劑[28]外，還能對真菌的生長代謝產(chǎn)生影響，人們便開始嘗試用它們作為誘導(dǎo)因子來促進(jìn)食藥用菌特定活性成分的合成[29-31]。近些年來人們主要關(guān)注脂肪酸、植物油等油脂類物質(zhì)對食藥用菌液體發(fā)酵影響的研究，油脂物質(zhì)能促進(jìn)真菌生長代謝與油或脂肪酸改變真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和通透性或直接影響代謝途徑中某些重要的酶活性有關(guān)。高興喜等[32]報(bào)道，油酸能顯著促進(jìn)靈芝菌絲體的生長、胞內(nèi)多糖的合成及胞內(nèi)外三萜的積累，硬脂酸有利于靈芝胞外多糖和胞內(nèi)多糖的產(chǎn)生，此外，亞油酸對靈芝胞內(nèi)三萜具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)效果。植物油能促進(jìn)食藥用菌的生長代謝，是一種有效的調(diào)控方式，Ya ng Hailong等[33]報(bào)道薏苡仁油對靈芝液體發(fā)酵具有顯著的促進(jìn)作用，添加量為2%（體積分?jǐn)?shù)）的薏苡仁油使靈芝生物量達(dá)10.71 g/L，三萜含量達(dá)92.94 mg/L，胞外多糖產(chǎn)量為0.33 g/L，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為0.389 g/L，分別是對照組的3.34、2.76、2.2 倍和2.23 倍。Zhou Huabin 等[34]研究發(fā)現(xiàn)0.2%（體積分?jǐn)?shù)）的薏苡仁脂有助于靈芝菌絲生長和胞內(nèi)多糖及胞外多糖的合成，在發(fā)酵過程中葡萄糖快速消耗，而薏苡仁脂的含量卻變化不大，并且發(fā)酵液的pH值基本不變，表明薏苡仁脂并非作為碳源直接影響靈芝的生長代謝，而是作為一個(gè)促進(jìn)因子起作用，而其對生物量和多糖產(chǎn)量的促進(jìn)作用也不是通過改變發(fā)酵液的pH值，而且靈芝多糖生物合成途徑中的一些重要酶的活性也受到薏苡仁脂的影響。

研究表明，表面活性劑如吐溫-80能有效促進(jìn)食藥用菌中活性代謝產(chǎn)物的合成，在牛樟芝液體發(fā)酵的第72小時(shí)添加0.1 g/100 mL的吐溫-80，Antrodin C的產(chǎn)量明顯高于對照組，由（52.37±1.02） mg/L提高到（103.76±0.92） mg/L，在吐溫-80和大豆油的耦合發(fā)酵體系中，Antrodin C的最大產(chǎn)量是對照組的3.6 倍[35]。Zhang Bobo等[36]報(bào)道在虎奶菇發(fā)酵的第5天向培養(yǎng)基中添加3.0 g/L吐溫-80，使虎奶菇的生物量和胞外多糖產(chǎn)量相比對照組 分別提高了51.3%和41.8%，有趣的是，吐溫-80雖然未改變虎奶菇胞外多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成，但其多糖的分子質(zhì)量卻明顯低于對 照組，由（4.30±0.12）×106D變?yōu)椋?.18±0.09）×106D。吐溫-80影響食藥用菌新陳代謝的機(jī)制可能與菌絲體細(xì)胞膜的完整結(jié)構(gòu)和跨膜運(yùn)輸活性有關(guān)[37]。表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)具有兩親性，而真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)也由一層兩親性的磷脂組成，因而表面活性劑可能局部嵌合到細(xì)胞膜中，從而加快了細(xì)胞從培養(yǎng)基中攝取營養(yǎng)的速率[38]。

4　信號分子

信號分子如激素、真菌激發(fā)子、短肽、氣體分子（NO、CO）以及Ca2+、Cu2+等可以通過激活特定代謝途徑來提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，在調(diào)控食藥用菌的生長代謝中發(fā)揮著重要作用。

通過激素傳遞信息是最廣泛的一種信號傳導(dǎo)方式，陳安徽等[39]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素6-芐氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）具有一定的提高蟬擬青霉最大生物量的作用，其中，中劑量6-BA顯著縮短了蟬擬青霉的發(fā)酵周期，而且最大生物量也提高了28.96%。同時(shí)也改變了蟬擬青霉菌絲體中活性物質(zhì)的代謝節(jié)奏，和對照組相比，低劑量6-BA使胞內(nèi)多糖產(chǎn)量比對照組提高了47.37%，相應(yīng)發(fā)酵時(shí)間的蟲草素產(chǎn)量提高了139.50%。魏原芝等[40]報(bào)道不同的植物激素及同一植物激素的不同濃度對杏鮑菇生長代謝的影響程度各不相同，這可能由于其激活了杏鮑菇菌絲伸長生長有關(guān)的氨基酸、輔酶、蛋白質(zhì)等代謝酶的合成，提高菌絲胞外酶活性，增強(qiáng)菌絲對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用，從而影響細(xì)胞內(nèi)的新陳代謝。Ren Ang等[41]在靈芝發(fā)酵過程中通過添加茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）誘導(dǎo)靈芝酸的合成，于發(fā)酵第6天時(shí)加入254 μmol/L的MeJA，得到菌絲體中靈芝酸的產(chǎn)量為4.52 mg/100 mg，比對照組提高了45.3%，靈芝酸產(chǎn)量的顯著提高與MeJA對其生物合成關(guān)鍵性酶基因表達(dá)均有不同程度的誘導(dǎo)作用有關(guān)。

真菌激發(fā)子（fungal elicitors）是來源于真菌的一種特定化學(xué)物質(zhì)或信號，它們可以是真菌的多糖、多肽、發(fā)酵液、真菌分泌產(chǎn)物等，能激活特定次生代謝途徑，刺激真菌細(xì)胞產(chǎn)生并且積累特定的生物活性成分。馬曉寧等[42]選取7 種食藥用菌多糖作為激發(fā)子，其中來自蛹蟲草菌株CM-JS菌絲體的多糖激發(fā)子CM-JS對蛹蟲草多糖的生物合成有顯著誘導(dǎo)作用，通過工藝優(yōu)化得到CM-JS的最佳添加量為70.328 μg/mL，在蛹蟲草發(fā)酵第2天加入激發(fā)子并激發(fā)3 d時(shí)間，能使蛹蟲草干菌絲中的多糖含量提高54.16%，達(dá)到342.5 mg/g。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，源自梗孢菌（Mo nilinia fructicola）菌絲體中的一種多肽可誘導(dǎo)菜豆內(nèi)果皮中菜豆素的形成和積累，進(jìn)而董玉潔等[43]從中華真地鱉中分離得到一種多肽，并研究其對北蟲草蟲草菌素產(chǎn)量的影響，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)添加地鱉多肽可顯著提高北蟲草蟲草菌素的產(chǎn)量，在北蟲草發(fā)酵的第3天添加4 mg地鱉多肽發(fā)酵至第7天，其蟲草菌素產(chǎn)量最高達(dá)55.43 μg/mL，約為對照組蟲草菌素產(chǎn)量的2 倍。

一氧化氮（NO）是一種重要的活性氮，對誘導(dǎo)真菌次生代謝產(chǎn)物的合成與積累具有一定的作用[44]。王松華等[45]采用硝普鈉（sodium nitroprusride，SNP）作為外源一氧化氮的供體，加入靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)0.5 mmol/L的SNP能顯著促進(jìn)靈芝菌體生長和胞外多糖及胞內(nèi)多糖的合成，其產(chǎn)量分別為對照組的1.19、2.58 倍和1.55 倍，當(dāng)SNP濃度＞4 mmol/L時(shí)，靈芝菌絲體生物量胞外多糖和胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量均呈現(xiàn)下降趨勢，說明過高濃度的SNP抑制菌體的生長和靈芝多糖的產(chǎn)生。

金屬元素在真菌的生長發(fā)育以及代謝中是不可或缺的，它們對真菌的細(xì)胞組成、酶的激活和新陳代謝具有重要作用，其中Ca2＋、Fe2＋等金屬元素作為真菌代謝途徑中重要的信號分子，可通過調(diào)控信號途徑來提高食藥用菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。徐軼寧[46]發(fā)現(xiàn)添加Ca2＋、Na＋和Mn2＋能夠有效地提高靈芝酸產(chǎn)量，其中10 mmol/ L Ca2＋的影響最顯著，總靈芝酸的產(chǎn)量達(dá)（1.58±0.03） g/L，它們調(diào)控靈芝代謝的分子機(jī)制是Ca2＋、Na＋和Mn2＋能夠上調(diào)靈芝胞內(nèi)Ca2＋水平，從而促發(fā)鈣調(diào)磷脂酶信號，通過上調(diào)鈣調(diào)磷脂酶信號基因和靈芝酸生物合成 基因的轉(zhuǎn)錄水平來促進(jìn)靈芝酸的合成。Fan Dandan等[47]發(fā)現(xiàn)FeSO4可作為蛹蟲草中蟲草素的有效誘導(dǎo)劑，其最佳添加條件為在發(fā)酵的第1天向蛹蟲草培養(yǎng)基中加入1 g/L FeSO4進(jìn)行發(fā)酵，蟲草素最高產(chǎn)量達(dá)（596.59±85.50） mg/L，較對照組提高了70%，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2＋對蟲草素合成的促進(jìn)作用主要是通過對嘌呤核苷類物質(zhì)代謝途徑中編碼由IMP合成AMP關(guān) 鍵酶的purA基因進(jìn)行正調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。

5　添加物對食藥用菌液體發(fā)酵代謝調(diào)控的機(jī) 理

上述研究表明外源添加物能夠有效調(diào)控食藥真菌代謝物的生物合成，通過添加中藥成分、重要前體物質(zhì)、油脂類物質(zhì)及信號分子，對食藥用菌代謝產(chǎn)物生物合成途徑中關(guān)鍵酶的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)次級代謝途徑中特定酶的基因表達(dá)進(jìn)而激活特定次生代謝途徑，或是改變細(xì)胞通透性，從而最大限度地積累目的產(chǎn)物。

食藥用菌的代謝調(diào)控主要是通過控制酶的作用來實(shí)現(xiàn)的，其調(diào)節(jié)類型主要有兩種[48]，一種是酶活性調(diào)節(jié)，提高代謝產(chǎn)物合成途徑中重要酶的酶活力，或抑制一些與代謝產(chǎn)物生物合成無關(guān)的旁路代謝途徑中關(guān)鍵酶的酶活力，將細(xì)胞的物質(zhì)和能量導(dǎo)向目的產(chǎn)物生物合成途徑，促進(jìn)代謝產(chǎn)物的合成，是在酶化學(xué)水平發(fā)生的。賀宗毅等[49]報(bào)道中藥天麻的添加有助于灰樹花胞外多糖產(chǎn)量的提高，同時(shí)對灰樹花多糖合成代謝途徑中的兩個(gè)重要酶葡萄糖磷酸異構(gòu)酶（glucose phosphate isomerase，PGI）和α-葡萄糖磷酸變位酶（α-phosphoglucomutase，α-PGM）的酶活力進(jìn)行測定，其中PGI是糖酵解途徑中的重要酶，α-PGM是與胞外多糖合成相關(guān)的重要酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組與天麻組的α-PGM變位酶酶活力并無顯著差異，而天麻組的PGI異構(gòu)酶活力明顯低于對照組，表明中藥天麻中的天麻素或其復(fù)合成分對灰樹花多糖合成代謝途徑中PGI異構(gòu)酶具有顯著的抑制作用，即抑制了灰樹花多糖的糖酵解途徑，從而有利于葡萄糖-6-磷酸向灰樹花多糖合成的途徑遷移。Zhou Huabin等[34]也有類似發(fā)現(xiàn)，薏苡仁脂能較大幅度地提高靈芝多糖的產(chǎn)量，進(jìn)而研究了薏苡仁脂對靈芝多糖EMP途徑中關(guān)鍵酶α-PGM和PGI活性的影響，結(jié)果顯示，在發(fā)酵的第4、6、8天，對照組PGI異構(gòu)酶的活力分別為7.46、3.11、2.15 nmol/（min·mg pro），而添加薏苡仁脂后的PGI異構(gòu)酶的活力分別為5.46、1.14、0.52 nmol/（min·mg pro），PGI異構(gòu)酶的活性明顯低于對照組；α-PGM變位酶酶活性明顯高于對照組，在發(fā)酵第8天，添加薏苡仁脂的α-PGM變位酶活力最高達(dá)到121.32 nmol/（min·mg pro）（對照組為1.47 nmol/（min·mg pro）），表明薏苡仁脂促進(jìn)靈芝多糖合成的機(jī)制是通過直接調(diào)節(jié)PGI異構(gòu)酶和α-PGM變位酶的活性來實(shí)現(xiàn)的。

酶調(diào)節(jié)的另一種類型是酶合成的調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)食藥用菌代謝產(chǎn)物途徑中特定酶的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)酶分子的合成量，進(jìn)而激活特定次生代謝途徑，引起反應(yīng)速率和次級代謝途徑通量的改變，從而積累特定目的代謝產(chǎn)物，是在遺傳學(xué)水平上發(fā)生的。Xu Yining等[50]發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)磷脂酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對靈芝酸產(chǎn)量影響顯著，添加10 mmol/L Ca2＋進(jìn)行靈芝液體發(fā)酵，總靈芝酸（ganodenic acid，GA）的產(chǎn)量（干質(zhì)量）在發(fā)酵第4天時(shí)達(dá)到了（62.55±2.05） mg/g，是對照組的3.7 倍。添加Ca2＋時(shí)，促發(fā)了鈣調(diào)磷脂酶信號，該信號通過上調(diào)鈣調(diào)磷脂酶信號途徑基因cam、cna和crz1及靈芝酸生物合成基因hmgr、sqs和ls的轉(zhuǎn)錄水平來大幅度提高靈芝酸產(chǎn)量。Ren Ang等[41]在靈芝發(fā)酵過程中通過添加茉莉酸甲酯MeJA誘導(dǎo)了靈芝酸的合成，并對其生物合成途徑中關(guān)鍵性酶基因（hmgr、hmgs、mvd、fps、sqs、osc）的表達(dá)進(jìn)行了研究，經(jīng)條件優(yōu)化得到在發(fā)酵第6天時(shí)加入最佳濃度為254 μmol/L的MeJA，靈芝酸的產(chǎn)量（以干質(zhì)量計(jì)）達(dá)到最大值4.52 mg/100 mg，較對照組提高了45.3%，而且上述6 個(gè)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的提高。Fan Dandan等[47]對嘌呤核苷酸生物合成途徑中3 個(gè)重要基因purA（編碼腺苷酸琥珀酸合成酶）、purH（編碼IMP環(huán)化水解酶）、guaB（編碼IMP脫氫酶）轉(zhuǎn)錄水平的研究表明，添加FeSO4后purA的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而purH和guaB的轉(zhuǎn)錄水平略有下調(diào)，表明purA是調(diào)控嘌呤核苷酸生物合成的基因，蟲草素產(chǎn)量的提高可能歸因于purA的轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)。因而Fe2＋對蟲草素合成的促進(jìn)作用主要是通過對嘌呤核苷類物質(zhì)代謝途徑中編碼由IMP合成AMP關(guān)鍵酶的purA基因進(jìn)行正調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。

代謝產(chǎn)物在胞內(nèi)合成并向胞外分泌，而代謝產(chǎn)物在胞內(nèi)積累會(huì)對其自身合成有一定的反饋抑制作用，因而細(xì)胞壁、質(zhì)膜對代謝產(chǎn)物的通透性，也是影響代謝產(chǎn)物分泌以及其胞外產(chǎn)量的重要因素之一。Zhang Bobo等[51]提出了一個(gè)模型用以闡述刺激劑如表面活性 劑吐溫-80通過增大細(xì)胞膜的通透性來提胞外代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的機(jī)制，即首先是吐溫-80添加后，上調(diào)了脂肪酸合成酶的α亞基FasA的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)長鏈脂肪酸的合成，增加脂肪酸含量，并摻入菌絲細(xì)胞膜中增加細(xì)胞膜活性；然后，不同表達(dá)量的通信蛋白如磷脂酶D1（下調(diào)）和假定蛋白PGUG_02954（上調(diào)）可能介導(dǎo)了菌絲細(xì)胞和細(xì)胞外刺激物（吐溫-80）之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；最后，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白下調(diào)作為泵將胞外多糖擠壓出細(xì)胞，導(dǎo)致胞外多糖產(chǎn)量顯著提高。

6　結(jié) 語

食藥用菌中含有豐富而獨(dú)特的營養(yǎng)物質(zhì)，不僅口味鮮美而且兼具多種藥理功能，因而備受人們喜愛。隨著食藥用菌的藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值逐漸被認(rèn)識，人們對它們的需求也逐年增加。為了滿足不斷擴(kuò)大的市場需求，食藥用菌液體發(fā)酵技術(shù)備受國內(nèi)外研究人員的關(guān)注。充分地應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，不斷提高食藥用菌液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)，深入研究食藥用菌液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物的生物合成途徑，探討添加物對食藥用菌液體發(fā)酵代謝物生物合成的影響及其調(diào)控機(jī)制，篩選合適的添加物加入到發(fā)酵基質(zhì)中，大力促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物及新化合物的生物合成，提高食藥用菌有效活性成分的產(chǎn)量和藥理活性，實(shí)現(xiàn)食藥用菌資源高值化的利用，無論在理論上還是實(shí)踐上指導(dǎo)真菌發(fā)酵生產(chǎn)都具有重要的研究意義。隨著食藥用菌代謝產(chǎn)物生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制研究的不斷突破，通過一些關(guān)鍵合成酶基因的表達(dá)和相關(guān)代謝途徑中重要酶活性的調(diào)控，將是今后食藥用菌液體發(fā)酵代謝調(diào)控研究的熱點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃年來. 中國最有開發(fā)前景的主要藥用真菌[J]. 食用菌, 2005, 27(1): 3-4.

[2]賀亮, 馬素云, 程俊文, 等. 藥用真菌蟬擬青霉生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2012, 31(1): 8-16.

[3]WEI Zhenhua, DUAN Yingyi, QIAN Yongqing, et al. Screening of Ganoderma strains with high polysaccharides and ganoderic acid contents and optimization of the fermentation medium by statistical methods[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2014, 37(9): 1789-1797.

[4]孔怡, 武曉亮, 蘭玉菲, 等. 藥用真菌云芝的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 4(2): 82-84.

[5]牛爽, 郝利民, 趙樹欣, 等. 茯苓多糖的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(13): 348-353.

[6]WU Zhongwei, LU Junwen, WANG Xiaoqing, et al. Optimization for production of exopolysaccharides with antitumor activity in vitro from Paecilomyces hepiali[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 99: 226-234.

[7]TANG Jiapeng, LIU Yiting, ZHU Li. Optimization of fermentation conditions and purification of cordycepin from Cordyceps militaris[J]. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2014, 44(1): 90-106.

[8]李羿, 李晨, 游元元, 等. 以薏苡仁為基質(zhì)的茯苓發(fā)酵罐補(bǔ)料液體發(fā)酵[J]. 藥物生物技術(shù), 2011, 18(5): 407-410.

[9]HUANG H C, CHEN C I, HUNG C N, et al. Experimental analysis of the oil addition effect on mycelia and polysaccharide productions in Ganoderma lucidum submerged culture[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2009, 32(2): 217-224.

[10]王玉紅, 丁重陽, 徐鵬, 等. 中藥黃芪對發(fā)酵生產(chǎn)靈芝多糖的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2005, 24(2): 38-45.

[11]李國紅, 沈月毛, 王啟方, 等. 發(fā)酵三七中的皂苷成分研究[J]. 中草藥, 2005, 36(4): 499-50 0.

[12]王身艷, 陳建偉, 張蔚學(xué), 等. 雙向發(fā)酵對白芍HPLC指紋圖譜及芍藥苷含量的影響[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐, 2009, 23(2): 6-9.

[13]崔月花, 楊艷彬, 章克昌. 幾種中藥對靈芝發(fā)酵影響的研究[J]. 食用菌學(xué)報(bào), 2008, 15(1): 55-61.

[14]LIU Gaoqiang, XIAO Huaxi, WANG Xiaoling, et al. Stimulated production of triterpenoids of Ganoderma lucidum by an ether extract from the medicinal insect, Catharsius molossus, and identification of the key stimulating active components[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2011, 165(1): 87-97.

[15]李羿, 楊勝, 李晨, 等. 茯苓搖瓶液體發(fā)酵復(fù)合藥性培養(yǎng)基及其化學(xué)成分研究[J]. 中草藥, 2012, 43(8): 1519-1522.

[16]侯曉梅, 陳敏青, 張慧蕾, 等. 中藥提取物對灰樹花深層發(fā)酵的影響[J].食品科技, 2013, 38(9): 185-188.

[17]劉高強(qiáng), 趙艷, 王曉玲, 等. 靈芝多糖的生物合成和發(fā)酵調(diào)控[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2011, 30(2): 198-205.

[18]崔培梧, 吳紅娟, 譚朝陽, 等. 植物藥-茯苓菌雙向發(fā)酵代謝特征初探[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 33( 7): 37-40.

[19]趙艷, 劉高強(qiáng), 朱朝陽, 等. 不同植物藥提取物對靈芝細(xì)胞生長和胞內(nèi)三萜產(chǎn)物形成的影響[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2011, 30(2): 249-254.

[20]CHOI J W, RA K S, KIM S Y, et al. Enhancement of anticomplementary and radical scavenging activities in the submerged culture of Cordyceps sinensis by addition of citrus peel[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(15): 6028-6034.

[21]劉高強(qiáng), 丁重陽, 章克昌, 等. 藥用昆蟲蜣螂對靈芝發(fā)酵和抗小鼠肝癌活性的影響[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 26(6): 880-886.

[22]LIN Fangyi, LAI Y K, YU Haochen, et al. Effects of Lycium barbarum extract on production and immunomodulatory activity of the extracellular polysaccharopeptides from submerged fermentation culture of Coriolus versicolor[J]. Food Chemistry, 2008, 110(2): 446-453.

[23]丁興紅, 溫成平, 丁志山, 等. 桑黃液體發(fā)酵生產(chǎn)多糖工藝研究[J].中草藥, 2012, 43(5): 906-909.

[24]王蕾, 羅巍, 胡瑕, 等. 蟲草素高產(chǎn)菌株的篩選及不同添加物對蟲草素產(chǎn)量的影響研究[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2012, 31(3): 382-388.

[25]文庭池, 康冀川, 雷幫星, 等. 前體及營養(yǎng)物提高蛹蟲草蟲草菌素產(chǎn)量的研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(5): 175-179.

[26]CHIANG C C, HUANG T N, LIN Yuwei, et al. Enhancement of 4-acetylantroquinonol B production by supplementation of its precursor during submerged fermentation of Antrodia cinnamomea[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(38): 9160-9165.

[27]鐘慧敏, 王俊儒, 李同臣. 3種誘導(dǎo)因子對發(fā)酵法生產(chǎn)豬苓甾體的影響[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 26(3): 132-135.

[28]PARK J P, KIM S W, HWANG H J, et al. Stimulatory effect of plant oils and fatty acids on the exo-biopolymer production in Cordyceps militaris[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2002, 31(3): 250-255.

[29]HSIEH C, WANG H L, CHEN C C, et al. Effect of plant oil and surfactant on the production of mycelial biomass and polysaccharides in submerged culture of Grifola frondosa[J]. Biochemical Engineering Journal, 2008, 38(2): 198-205.

[30]CUI Jiandong, ZHANG Yanan. Evaluation of metal ions and surfactants effect on cell growth and exopolysaccharide production in two-stage submerged culture of Cordyceps militaris[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 168(6): 1394-1404.

[31]畢澎洋, 楊海龍, 閔偉紅. 薏苡仁油和薏苡仁酯促進(jìn)靈芝深層發(fā)酵的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2011, 32(12): 226-228.

[32]高興喜, 姚強(qiáng), 宮志遠(yuǎn), 等. 不同脂肪酸對桑黃液體發(fā)酵的影響[J].食品科學(xué), 2011, 32(7): 198-201.

[33]YANG Hailong, MIN Weihong, BI Pengyang, et al. Stimulatory effects of Coix lacryma-jobi oil on the mycelial growth and metabolites biosynthesis by the submerged culture of Ganoderma lucidum[J]. Biochemical Engineering Journal, 2013, 76: 77-82.

[34]ZHOU Huabin, BI Pengyang, WU Xiangting, et al. Improved polysaccharide production in submerged culture of Ganoderma lucidumn by the addition of coixenolide[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 172(3): 1497-1505.

[35]ZHANG Huan, XIA Yongjun, WANG Yuanlong, et al. Coupling use of surfactant and in situ extractant for enhanced production of Antrodin C by submerged fermentation of Antrodia camphorata[J]. Biochemical Engineering Journal, 2013, 79: 194-199.

[36]ZHANG Bobo, CHEUNG P C K. Use of stimulatory agents to enhance the production of bioactive exopolysaccharide from Pleurotus tuber-regium by submerged fermentation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(4): 1210-1216.

[37]ZHANG Bobo, CHEUNG P C K. A mec hanistic study of the enhancing effect of Tween 80 on the mycelial growth and exopolysaccharide production by Pleurotus tuber-regium[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(17): 8323-8326.

[38]CHEN Huabing, HUANG H C, CHEN C I, et al. The use of additives as the stimulator on my celial biomass and exopolysaccharide productions in submerged culture of Grifola umbellate[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2010, 33(3): 401-406.

[39]陳安徽, 王衛(wèi)東, 陳宏偉, 等. 激素對蟬擬青霉深層液體發(fā)酵生長代謝的調(diào)控作用[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(23): 317-321.

[40]魏原芝, 陳書進(jìn), 趙盼, 等. 植物激素對杏鮑菇菌絲生長及酶活性的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(29): 14179-14180.

[41]REN Ang, QIN Lei, SHI Liang, et al. Methyl jasmonate induces ganoderic acid biosynthesis in the bas idiomycetous fungus Ganoderma lucidum[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(17): 6785-6790.

[42]馬曉寧, 賈俊強(qiáng), 滕國琴, 等. 真菌多糖激發(fā)子的篩選及對蛹蟲草多糖激發(fā)條件的優(yōu)化[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2012, 38(4): 734-739.

[43]董玉潔, 樸美子. 地鱉多肽對北蟲草蟲草菌素產(chǎn)量的影響[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2013, 13(6): 129-133.

[44]ZHENG Weifa, LIU Yubing, PAN Shenyuan, et al. Involvements of S-nitrosylation and denitrosylation in the production of polyphenols by Inonotus obliquus[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 90(5): 1763-1772.

[45]王松華, 張強(qiáng), 李正鵬, 等. 一氧化氮對靈芝多糖產(chǎn)量的影響[J]. 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 27(3): 25-28.

[46]徐軼寧. 鈣調(diào)磷脂酶信號對靈芝菌絲體液體發(fā)酵生產(chǎn)抗癌次級代謝物靈芝酸的影響[D]. 上海: 上海交通大學(xué), 2013.

[47]FAN Dandan, WANG Wei, ZHONG JianJiang. Enhancement of cordycepin production in submerged cultures of Cordyceps militaris by addition of ferrous sulfate[J]. Biochemical Engineering Journal, 2012, 60(15): 30-35.

[48]沈萍, 陳向東. 微生物學(xué)[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 2006: 126.

[49]賀宗毅, 吳天祥, 徐曉寶. 中藥天麻成分對灰樹花胞外多糖合成及相關(guān)關(guān)鍵酶的影響[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(11): 199-202. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201311043.

[50]XU Yining, ZHONG Jianjiang. Impacts of calcium signal transduction on the fermentation production of antitumor ganoderic acids by medicinal mushroom Ganoderma lucidum[J]. Biotechnology Advances, 2012, 30(6): 1301-1308.

[51]ZHANG Bobo, CHEN Lei, CHEUNG P C K. Two-dimensional gel electrophoresis analysis of mycelial cells treated with Tween 80: differentially expressed protein related to enhanced metabolite production[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(42): 10585-10591.

A Review on the Effects of Exogenous Additives on Submerged Fermentation of Edible and Medicinal Fungi

WEI Chaoyang1, HE Liang2, SHAO Shuangshuang1, FENG Yili3, LI Weiqi1,*, CHENG Junwen2

(1. College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biological and Chemical Utilization of Forest Resources, Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China; 3. Sir Run Run Shaw Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310016, China)

Abstract:The biomass production of edible and medicinal fungi and the synthesis of secondary metabolites may be significantly promoted by adding the suitable concentration of additives to the fermentation substrate. This paper reviews the effects of some exogenous additives such as traditional Chinese medicines, growth factors, grease-like materials and signaling molecules on submerged fermentation of edible and medicinal fungi as well as the underlying mechanism of metabolism regulation, which will hope fully provide a theoretic foundation for further research and development of edible and medicinal fungi.

Key words:exogenous additives; edible and medicinal fungi; submerged fermentation; metabolism regulation

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507045

中圖分類號：TS202.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0245-06

*通信作者：李衛(wèi)旗（1964—），男，副教授，博士，主要從事微生物發(fā)酵研究。E-mail：liweiqi2007@zju.edu.cn

作者簡介：韋朝陽（1989—），男，碩士研究生，主要從事食藥用菌發(fā)酵及其多糖研究。E-mail：weichaoyang2012@163.com

基金項(xiàng)目：國家林業(yè)局“948”項(xiàng)目（2008-4-64）；浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)（2012C12004-4）；中央補(bǔ)助地方科技基礎(chǔ)條件專項(xiàng)資金項(xiàng)目（20130611A）；浙江省科技廳院所專項(xiàng)（2012F30037）；杭州市農(nóng)業(yè)科研攻關(guān)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（20120232B48）

收稿日期：2014-04-22