骨髓基質(zhì)干細胞移植治療骨不連進展

趙振營,安榮澤

(遵義醫(yī)學(xué)院 第五附屬(珠海)醫(yī)院,廣東 珠海 519100)

骨髓基質(zhì)干細胞移植治療骨不連進展

趙振營,安榮澤

(遵義醫(yī)學(xué)院 第五附屬(珠海)醫(yī)院,廣東 珠海 519100)

摘要：骨髓基質(zhì)干細胞移植(BMSCs)治療骨不連是現(xiàn)研究的熱點之一，隨著對BMSCs功能及調(diào)控因子的深入研究，同時結(jié)合組織工程和基因工程技術(shù)，開創(chuàng)了骨不連治療的新方向,并在臨床及動物實驗中取得了一定成果。我們就BMSCs移植治療骨不連的現(xiàn)有研究做簡要綜述。

關(guān)鍵詞：骨不連;骨髓基質(zhì)干細胞;支架;轉(zhuǎn)染

中圖分類號：R683

文獻標識碼：識碼： A

文章編號：編號： 1672-7606(2015)01-0073-04

收稿日期：2014-09-12

作者簡介：趙振營(1971-)，男，河南開封人，碩士，副主任醫(yī)師，從事骨與關(guān)節(jié)損失的診治和研究工作。

Abstract:Bone marrow stromal cell transplantation is one of the research hotspots of treatment of nounion. With the far study of the function and regulatory factors of BMSCs, and the helping of tissue engineering and gene engineering technology, stromal cell transplantation create a new era for the treatment of nonunion and has achieved some results in pre-clinical and clinical experiments. In this paper,we make a brief review on it.

The research on the function of bone marrow stormal cell transplantation to nonunion

ZHAO Zhenying, AN Rongze

(ZunyiMedicalCollege,theFifthAffiliatedHospital,Zhuhai,Guangzhou519100,China)

Key words: nonunion; bone marrow stromal cells; cell scaffold; transfection

骨不連是一個復(fù)雜的病理現(xiàn)象，是骨科醫(yī)師面臨的難題之一，縱然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對其病因、病理研究不斷深入，但本質(zhì)上還停留在試驗與推測的階段。目前治療最有效的方法仍以手術(shù)為主，包括病變切除、內(nèi)固定、外固定、骨移植及各方法的聯(lián)合運用。當(dāng)下，以骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)為基礎(chǔ)的治療策略引起人們越來越多的興趣，并取得了一定的臨床試驗結(jié)果。

1骨不連的診斷

骨不連是指骨的正常愈合過程終止。目前為止無統(tǒng)一定義， 美國食品和藥品臨督管理局(FDA)定義骨不連：骨折后至少9 mon，且連續(xù)3 mon無任何愈合跡象[1]。曾炳芳[2]總結(jié)認為：骨不連有兩個基本要素即：①骨折后6~9 mon骨折仍未愈合；②已經(jīng)連續(xù)觀察3 mon骨折沒有愈合的跡象。其發(fā)生受全身因素如年齡、激素、藥物、營養(yǎng)等及局部因素如生物活性因子、血供等影響。可以說在骨折愈合的復(fù)雜過程中一個或多個階段受阻，如骨缺損大、BMSCs數(shù)量不足、誘導(dǎo)物含量低等都必然導(dǎo)致骨不連[3]。目前,骨不連診斷主要依據(jù)影像學(xué)檢查，X線檢查提示骨折間隙明顯、骨折端硬化、骨折面光滑及假關(guān)節(jié)形成即可診斷。CT掃描能更好顯示內(nèi)固定物因X線不透視而遮擋的部分。MRI增強掃描可以發(fā)現(xiàn)骨折端新生血管及成骨情況，同時了解周圍韌帶或軟組織病變，具備一定優(yōu)勢。在臨床上，早期診斷骨不連具有重要意義。骨髓腔造影技術(shù)能顯示斷端骨痂內(nèi)靜脈通過情況，超過10周仍無血管通過或無造影劑通過血管，即提示骨折延遲愈合或有延遲愈合可能。但此檢查為有創(chuàng)檢查，不能普及。超聲檢查可以早期預(yù)測骨折愈合傾向，有研究認為超聲檢查診斷早期骨不連陽性預(yù)測值達97%，但此技術(shù)過度依賴超聲醫(yī)師的技術(shù)和經(jīng)驗。核素掃描可以反映骨折端血流及骨代謝情況，可以評價骨不連處的骨血運、感染和滑膜假關(guān)節(jié)形成。雖然此檢查敏感性強，但特異性差，難以準確定位，因而只能作為功能性檢查。目前能被認可的骨不連早期診斷手段仍然只有高分辨率CT。隨著混合型影像裝置和顯像技術(shù)發(fā)展，SPECT/CT圖像融合技術(shù)為骨不連早期診斷提供更有力工具， 可能為早期診療骨不連帶來一場變革[3]。我們期待更多的研究報道。

2骨不連的病理及分型

骨不連在病理上表現(xiàn)為：①髓腔骨性的閉塞；②髓腔內(nèi)纖維化；③接觸骨的纖維組織和骨折間隙內(nèi)可以看到類軟骨性骨化和纖維性骨化[4]。微觀結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為骨折斷端存在被膠原纖維小板間隔成空腔樣的骨小梁結(jié)構(gòu)，小梁和纖維板的膠原只被羥基磷灰石輕微鈣化。根據(jù)不同組織學(xué)特點，可將其分為萎縮性、肥大性、滑膜假關(guān)節(jié)及感染性骨不連[5]。臨床上還可見骨缺損性及營養(yǎng)不良性骨不連。各種類型在其血供、骨活性方面均有不同，診療中應(yīng)予以區(qū)別治療。

3BMSCs治療骨不連的應(yīng)用

骨折愈合是一個非常復(fù)雜的過程，從細胞水平來看，包括細胞募集、誘導(dǎo)、調(diào)控、骨傳導(dǎo)。骨折發(fā)生后,臨近及全身的成骨性干細胞募集于骨折處,骨折局部的骨生長因子分泌增多,誘導(dǎo)干細胞向成骨細胞分化,出現(xiàn)骨再生,進而依據(jù)Wolff定律進行骨改造與塑形。相關(guān)研究已證實在骨折的愈合過程中BMSCs起著重要的作用，具有較強的增殖能力和向多種間充質(zhì)細胞分化的潛能 ,可向成骨系細胞方向分化。但BMSCs如何被精確誘導(dǎo)分化成骨前體細胞，目前仍不清楚，已知的是微循環(huán)狀態(tài)、缺氧等物理因素可能是其誘導(dǎo)分化的重要因素[6-7],而局部微環(huán)境是主要影響因素[8]。BMSCs的定向誘導(dǎo)成骨已知的具有誘導(dǎo)作用生長因子有骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)。在正常的骨折愈合過程中，BMSCs在調(diào)控因子的幫助下增殖、分化為成骨細胞，最終形成骨而修復(fù)骨損傷。因在體內(nèi)存在廣泛，對機體損傷小、體外培養(yǎng)增值力強、易于向成骨細胞分化且成骨性能穩(wěn)定等特點，是骨折修復(fù)和再生修復(fù)骨不連與骨缺損的研究熱點。

3.1　經(jīng)皮自體BMSCs移植

骨髓血中含有骨髓基質(zhì)細胞，通過髂骨取髓，注入骨不連斷端，能促進成骨，效果肯定，但骨髓內(nèi)干細胞含量低，數(shù)量不足。相關(guān)研究[9]認為移植的BMSCs濃度應(yīng)>1 000/mL，總數(shù)應(yīng)>30 000。若非使用富集方法，難以移植所需BMSCs量，此可能影響干細胞移植療效，導(dǎo)致治療失敗。

取少量骨髓后經(jīng)體外純化、擴增BMSCs，達到一定量級后注入骨不連部位，可以解決數(shù)量不足問題。童培建[10]等經(jīng)皮注射BMSCs治療四肢骨不連48例，隨訪3~8 mon，成功治愈42例。張傳開[11]等治療四肢骨折骨不連患者41例，術(shù)后隨訪9～24 mon，骨折愈合39 例。Johner-Wruhs 功能分級法評定患肢恢復(fù)情況，療效為優(yōu)25例、良9例、可5例、差2例。王玉龍[12]等通過自體骨髓干細胞移植治療開放性損傷、局部皮膚軟組織條件差的脛骨骨折骨不連患者11例，隨訪時間為4～27 mon，X線片顯示骨折愈合良好，未見不良事件的發(fā)生。觀察到體外培養(yǎng)擴增3周并未影響 MSCs 成骨能力。根據(jù)干細胞特性，相關(guān)臨床證實BMSCs移植聯(lián)合高壓氧、沖擊波、電刺激等治療骨不連也取得良好效果。其前提是要解決導(dǎo)致骨不連的技術(shù)性、生物性因素，如感染、固定不牢及成骨障礙、復(fù)位不佳等。

因BMSCs沒有免疫原性或免疫原性低，僅表達低水平的組織相容性復(fù)合體(MHC)-1。動物實驗已證實: 全身或局部注入人胚胎 MSCs 和 MSCs 很少發(fā)生移植排斥反應(yīng)。且異體BMSCs移植治療骨缺損在兔試驗中取得一定成果，在未來可能為BMSCs提供更多來源。

3.2　自體BMSCs復(fù)合生物材料支架植入

BMSCs為液性物質(zhì)，在缺損性骨不連、斷端間隙大于5 mm或堅韌疤痕組織、硬化骨痂封閉斷端時，很難保證BMSCs在局部聚集而發(fā)揮作用。自體骨或異體骨移植可以為之提供支撐及修補缺損作用，臨床研究證實此方法療效良好。從理論出發(fā)，添加各種生長因子的生物材料支架復(fù)合自體骨髓基質(zhì)干細胞植入應(yīng)更有效的促進骨不連愈合。在這個組織工程系統(tǒng)里，細胞在一個多孔的三維支架系統(tǒng)中保持活性狀態(tài)。目前已研發(fā)的支架類型包括天然物合成支架，如殼聚糖、膠原、透明質(zhì)酸等; 人工合成高分子支架，如碳纖維支架; 覆蓋生物分子的支架，如具生長因子支架等。在BMSCs復(fù)合不同支架材料修復(fù)骨缺損的大量研究中發(fā)現(xiàn)，其修復(fù)骨缺損的具體機制可能為[13]:①局部提供高濃度MSCs促進成骨;②促進植入缺損處局部微血管形成，便于新骨生長;③通過釋放成骨因子促進原始骨祖細胞分化，提高生物支架材料的骨誘導(dǎo)能力。動物實驗已經(jīng)證明磷酸鈣、羥基磷灰石及復(fù)合材料、藻酸鈣、珊瑚等分別與BMSCs復(fù)合治療骨缺損或骨不連，與空白組對照顯示復(fù)合組有明顯的促進修復(fù)骨缺損的作用。扈延齡[14]等將復(fù)合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (rhBMP-2)殼聚糖微球的可注射磷酸鈣骨水泥在體外與青山羊骨髓干細胞共同培養(yǎng)，與單純磷酸鈣骨水泥和單純殼聚糖微球磷酸鈣骨水泥材料組對比，發(fā)現(xiàn)負載rhBMP-2殼聚糖微球磷酸鈣骨水泥復(fù)合材料的新骨形成優(yōu)于其他組。Borden 等[15]在新西蘭白兔尺骨骨不連模型中通過對比單獨多聚微球基質(zhì)組、 多聚微球基質(zhì)+自體骨髓組、多聚微球基質(zhì)+20 ug BMP-7組、多聚微球基質(zhì)+20 ug BMP-7+自體骨髓組，發(fā)現(xiàn)BMP-7能誘導(dǎo)新骨長入多聚微球基質(zhì)，使骨髓基質(zhì)干細胞的成骨活性增強，即BMP-7結(jié)合干細胞成骨能力更強。Quarto 等[16]對3例不同部位骨缺損患者，包含一個脛骨骨折、一個肱骨和兩個尺骨骨折。將擴增的BMSCs復(fù)合含有羥基磷灰石空的陶瓷支架植入骨缺損處，隨訪后發(fā)現(xiàn)骨缺損處有大量的骨痂生成，新生骨質(zhì)與原有的骨質(zhì)很好地融合。姚旺祥[17]等使用濃縮自體骨髓復(fù)合纖維蛋白膠修復(fù)骨缺損及骨不連16 例，通過電鏡下觀察認為纖維蛋白膠與骨髓有核細胞生物相容性良好，長期培養(yǎng)無致瘤性。隨訪的15例患者13 例患者骨折治愈。2 例因初始損傷為開放性骨折，骨折端軟組織覆蓋欠佳，且多次手術(shù)使局部血運破壞較大而不愈合。

3.3　運用基因工程改造BMSCs

為保證局部BMSCs持續(xù)向成骨細胞轉(zhuǎn)化，需要多次在不愈合端注射骨髓或BMSCs。而通過基因工程則可避免細胞正常衰老、反復(fù)給藥及外源生長因子所致過敏反應(yīng)，同時能持續(xù)誘導(dǎo)BMSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化。其方法是：①將含有誘導(dǎo)成骨的目的基因?qū)敫杉毎?，使之表達并合成有骨誘導(dǎo)作用的生長因子;②將外源性人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因?qū)隑MSCs，消除衰老，使之維持增殖。

郝偉等[18]將攜帶 rhBMP-2及bFGF 基因片段的雙基因表達載體 prh-BMP-2-IRES-bFGF 并轉(zhuǎn)染兔 BMSCs，與rhBMP-2及bFGF單獨轉(zhuǎn)染組、未干預(yù) BMSCs 組設(shè)為對照，4周后發(fā)現(xiàn)在 rh-BMP-2-bFGF/BMSCs 組有骨小梁樣結(jié)構(gòu)的編織骨組織形成，可以觀察到骨細胞、成骨細胞、破骨細胞等分化結(jié)構(gòu)。陳劍等[19]將BMP-2和BMP-7基因通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染入兔骨髓間充質(zhì)干細胞，與空白組、單獨BMP-2、BMP-7轉(zhuǎn)染組對比，第7 d，聯(lián)合轉(zhuǎn)染組Runx-2、Osx、Ⅰ型膠原和堿性磷酸酶mRNA表達，均較其他各組明顯增高。4個檢測指標基因mRNA表達第14天均高于第7天。提示轉(zhuǎn)染后更能促進成骨相關(guān)基因和蛋白表達。 滕勇等[20]采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因?qū)雴慰寺∨囵B(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細胞，篩選陽性克隆體，體外擴增培養(yǎng)，取第100代細胞進行誘導(dǎo)分化,結(jié)果顯示其能向成骨、軟骨及心肌細胞分化。

4前景與面臨的問題

BMSCs移植與再次手術(shù)結(jié)合植骨治療骨不連相比有一定優(yōu)勢:來源廣泛，取材方便，治療時創(chuàng)傷輕，患者痛苦小，操作簡單安全。但在干細胞提取、擴增、培養(yǎng)過程中存在諸如技術(shù)、安全風(fēng)險、倫理學(xué)問題，預(yù)防移植部位的異位骨化問題，同時明確適應(yīng)證、最佳施行時間、治療劑量有待解決。支架材料植入及基因轉(zhuǎn)染現(xiàn)仍以體外及動物實驗為主，如何提高其效率和安全性， 降低免疫源性、 提高轉(zhuǎn)染效率和可操作性等使之運用于臨床言之尚早。BMSCs在誘導(dǎo)分化時與各種細胞因子或化學(xué)物質(zhì)之間的作用還不完全清楚，尚不足以完全闡述分化的真正機制，如何控制增殖分化的速度，又避免形成腫瘤，保證MSCs的同質(zhì)性仍需進一步研究。干細胞研究領(lǐng)域在治療骨不連和骨折愈合治療策略方面具有巨大的潛力，隨著組織工程發(fā)現(xiàn)及成骨誘導(dǎo)機制進一步發(fā)展，相信在未來干細胞移植治療骨不連、骨缺損具有非常光明的前景。

參考文獻：

[1] Rodriguez-Merchan E C, Forriol F. Nonunion:general principles and experimental data[J]. Clin Orthop Relat Res. 2004,419:4-12.

[2] 曾炳芳，康慶林. 四肢骨不連外科學(xué)[M]. 北京：人民軍醫(yī)出版社,2010.

[3] 常玉立，劉智，孫天勝.骨不連及其干細胞移植療法的研究進展-感染.炎癥.修復(fù).2007,8(3):182-185.

[4] 劉儻，曹軼. 骨不連的病理學(xué)研究進展.中國矯形外科雜志[J].2010,18(12):1 006-1 007.

[5] Sanchez M, Anitua E, Cugat R, et al. Nonunions treated with autologous preparation rich in growth factors[J]. J Orthop Trauma, 2009,23(1):52-59.

[6] Holzwarth C,Vaegler M,Gieseke F,et al.Low physiologic oxygen tensions reduce proliferation and differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells[J]. BMC Biol, 2010,11(1):11.

[7] Araldi E,Schipani E. Hypoxia， HIFs and bone development[J]. Bone, 2010,47(2):190-196.

[8] Khosla S, Westendorf J J, Modder UI. Concise review:Insights from normal bone remodeling and srem cell-based therapies for bone repair[J]. Stem Cells, 2010,28(12):2 124-2 128.

[9] Hernigou P，Piognard A，Beaujean F. Percutaneous autolo gousbone marrow grafting for nonunions [J]. J Bone Joint Surg(Am)， 2005，87：1 431-1 437.

[10] 童培建，厲駒，瞿杭波．經(jīng)皮自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療四肢骨折骨不連[J].中華創(chuàng)傷雜志，2007，23(7):499-501．

[11] 張傳開，史 躍，劉 英，等.經(jīng)皮自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植術(shù)治療四肢骨折骨不連 41 例[J].山東醫(yī)藥, 2012,52 (2):95-96.

[12] 王玉龍, 王明貴, 賀小兵，等.自體骨髓干細胞移植治療脛骨骨折骨不連[J].局解手術(shù)學(xué)雜志,2014,23(2):131-134.

[13] 俞猛，夏仁云.骨髓間充質(zhì)干細胞在骨組織工程中的應(yīng)用進展閉[J].中國骨腫瘤骨病，2006，5(6):367一371.

[14 ] 扈延齡,李紅,李樹娟,等. 復(fù)合rhBMP-2殼聚糖微球可注射磷酸鈣骨水泥制備及成骨性能研究[J].中國矯形外科雜志，2010,18(20):1 723-1 726.

[15] Borden M , Attawia M , Khan Y, et al. Tissue-engineeredbone formation in vivo using a novel sintered polymeric microsphere matrix[J]. Bone Joint Surg Br, 2004,86 (8):1 200-1 208.

[16] Quarto R, Mastrogiacomo M, Cancedda R, et al. Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells. N Engl J Med, 2001,344(5):385-386.

[17] 姚旺祥，朱六龍，徐建生. 濃縮骨髓復(fù)合纖維蛋白膠對骨不連的修復(fù)[J].中華全科醫(yī)學(xué),2014,12(3):350-352.

[18] 郝偉, 姜明,等. rhBMP-2、bFGF 雙基因共轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合 nHA/RHLC/PLA 支架及其體內(nèi)外成骨分化研究[J].中國矯形外科雜志, 2011，19(13):1 130-1 134.

[19] 陳劍，袁文,等.骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和7共轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[J].中國組織工程研究,2012,16(49):9 139-9 145.

[20] 滕勇,胡蘊玉,等.端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因介導(dǎo)的人骨髓基質(zhì)干細胞永生化研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010,35(10):1 230-1 234.

[責(zé)任編輯李麥產(chǎn)]