兔股骨骨不連模型的建立

張鳳鳴

摘要：目的 為治療骨不連的動物實驗研究建立一種客觀的實驗模型。方法 測量兔股骨中段的直徑和矢狀徑，用于指導模型的制備。制備股骨骨折不連模型，骨折斷端用骨蠟封閉髓腔。術后12w經(jīng)過大體標本觀察、影像學及病理組織學檢查確定骨不連情況。結(jié)果 經(jīng)過大體觀察、組織學及影像學檢查均表明骨缺損區(qū)為纖維瘢痕組織填充，無骨性連接，斷端硬化，髓腔封閉。結(jié)論 本實驗所建立的兔股骨骨折不連模型，具有骨不連的影像學及病理組織學改變，符合骨不連的要求，是一種實用且可靠的骨不連動物模型。

關鍵詞：骨不連；股骨；缺損長度；動物模型；外固定架

Abstract： Objective To establish an objective animal model for experimental study of treating bone nonunion. Methods The diameter and sagittal diameter of middle rabbit femur were obtained through measurement in order guide the operation. To establish rabbit models of femoral bone nonunion.The bone marrow cavity was sealed by bone-wax.The model of femoral bone nonunion was observed by gross， histological examination and X-ray 12 weeks after the procedure. Results The bone defect was filled by fiber scar tissue，without any bone tissue，and bone end sclerosis was demonstrated by gross，histological and X-ray examination.Conclusion The X-ray and pathological changes of the animal model meet the demands of bone nonunion.The rabbit model of femoral bone nonunion can serve as a reliable experimental model for the study of bone nonunion.

Key words：Bone nonunion；Femoral shaft；Length；Model；External fixation

近年來，骨折治療水平已經(jīng)顯著提高，但術后仍出現(xiàn)大量的骨折不愈合現(xiàn)象。其發(fā)生率為5%～10%[1]。

目前在應用動物實驗制作骨折不連模型中絕大部分采用脛骨以及橈骨模型。選用兔的股骨制備骨不連模型的相關研究非常少。 Schmize等根據(jù)其所作實驗得出結(jié)論，造成骨不連的缺損范圍為長骨干直徑的1.5～2.5倍以上或其長度的1/10以上。張元平等[2] 制備兔股骨中段長15mm缺損的模型，3個月后骨折斷端不能愈合，表明此模型具有可行性。參考以上造模過程并以外固定架（Orthofix M103微型外固定架）為固定裝置。對實驗兔股骨進行解剖后測量其相關數(shù)據(jù)，并進行統(tǒng)計學分析。最終可以確定制造骨不連模型的骨缺損長度。

1資料與方法

1.1骨不愈合模型的制作：

1.1.1兔股骨指標測量 選取3～6月齡健康新西蘭大白兔5只，稱重后解剖股骨。應用空氣栓塞法將兔處死，用去毛器剃除手術區(qū)域兔毛并分離周圍軟組織，離斷髖、膝兩關節(jié)，獲得完整的股骨標本，對股骨長度、橫徑、矢狀徑等指標進行測量并記錄。

1.1.2選取3～6月齡健康新西蘭大白兔20只（由實驗動物中心提供），體重為2.75～4kg，雌雄不限。造模前常規(guī)飼養(yǎng)7d，待生命體征平穩(wěn)后進行手術。將3%戊巴比妥鈉按照1.0/kg的劑量注入耳緣靜脈。實驗中視情況可追加麻醉藥物。麻醉起效后實驗兔取側(cè)臥位于兔臺上，保持其呼吸道通暢。應用0.5%碘伏消毒手術區(qū)，常規(guī)鋪無菌手術單。取實驗兔大腿中部外側(cè)縱形切口，逐層切開皮膚、皮下組織及深筋膜，于股二頭肌與股外側(cè)肌肌間隙鈍性分離，充分顯露股骨干并保護軟組織條件。用尺子在股骨中段測量后并標記，用電鉆在股骨干中段標記的兩側(cè)骨段鉆孔，孔徑為1.5mm，間距為5mm，將4枚螺紋針分別固定在缺損兩側(cè)骨段，平衡并穩(wěn)定外固定架。用線鋸在股骨中段標記部位垂直截斷制成合適長度的骨缺損，手術部位徹底止血后用 0.9%氯化鈉注射液沖洗傷口。縫合線依次縫合切口。術后肌注青霉素40萬單位，連續(xù)1w，1次/d，并用碘伏2次/d消毒傷口預防感染。

1.2大體標本觀察 觀察股骨干截骨斷端骨痂生長情況及骨缺損連接情況。

1.3放射學檢查 本研究的影像檢查工作均由承德醫(yī)學院放射科協(xié)助完成。術后12w實驗兔患肢股骨拍側(cè)位X線片。拍攝條件：距離 80cm、電壓50KV、電流強度110mA、曝光時間0.1s。

1.4病理組織學檢查 術后12w用空氣栓塞的方法處死20只實驗兔，取出實驗股骨的骨折斷端、骨缺損區(qū)組織及雙側(cè)正常骨組織0.5cm為標本。將標本放入EDTA液脫鈣，更換1次/2d脫鈣液，15d后停止脫鈣。標本取出后用生理鹽水清洗表面脫鈣液，以 75﹪、80﹪和 90﹪乙醇，無水乙醇Ⅰ和Ⅱ梯度依次脫水15min。后二甲苯溶液透明處理10min。石蠟包埋后用切片機切取厚度為5微米薄片后置于載玻片上，放入 60℃烤箱中30min。脫蠟后將每塊切片進行HE染色，經(jīng)脫水、透明后以中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察骨缺損的愈合情況后記錄。

2結(jié)果

2.1兔股骨干解剖數(shù)據(jù)測量結(jié)果 （平均值） 股骨干長度：94.88mm；直徑：6.36mm；矢狀徑： 5.35mm。（見表1）

2.2一般大體觀察 術后第1d生命體征基本平穩(wěn)，精神狀況差伴跛行。1w后生命體征正常，傷口未見化膿等現(xiàn)象。12w后股骨干缺損區(qū)未見骨痂包繞，骨端可見大量纖維瘢痕組織覆蓋。

2.3放射學檢查 骨缺損區(qū)無連續(xù)性骨痂生長，斷端硬化，髓腔封閉，兩端有少量骨樣組織。

2.4病理組織學檢查 光鏡下有軟骨細胞及骨細胞，細胞呈無序排列，，缺損區(qū)為纖維結(jié)締組織。

3討論

目前對骨不連發(fā)生機制的問題尚存在很多爭議，治療起來非常棘手。而建立科學的骨不連模型則是篩選新的治療方法的基礎。國內(nèi)外學者設計了很多骨不連動物模型，其中有不少研究者將骨缺損模型作為骨不連模型進行實驗研究.。

3.1造模動物的選擇 選擇實驗動物需遵循的基本原則為該實驗動物與人類的解剖和生理特點較為接近。通過對該種動物的實驗研究基本上能重現(xiàn)人類相關疾病的客觀規(guī)律。并且具有良好的可重復性。近些年，有些學者選用較大的動物如豬、馬、牛、羊、猴等動物。但購買這些實驗動物的成本高、飼養(yǎng)條件要求高、實驗設計難度大而限制了其應用的廣泛性。體型較小的動物，雖然具有骨骼小、愈合快、適于細胞學研究的優(yōu)點，但同樣具有不便于骨折固定的缺點[3]。實驗研究表明兔的肢體骨與人類較為接近，并具有體形小、易馴服、組織修復較快、繁殖周期較短、飼養(yǎng)管理方便、操作簡單、價格低廉、對大樣本有利等諸多優(yōu)點[4]。故本實驗研究選擇了新西蘭大白兔。

3.2兔骨造模部位的選擇 此前不連模型主要選擇橈骨或脛骨[3]，其原因為尺骨或腓骨有支撐的功能，無需內(nèi)固定。也因此在制作模型時要去除部分輔助骨及其骨膜[5]。但雙骨結(jié)構(gòu)相互代償對愈合造成干擾。而股骨為單一承重、長度及粗細適合并可避免相鄰骨及骨膜干擾，對局部成骨效應也沒干擾。兔性成熟后會隨個體的增大，骨骼長度及強度進一步增長，故選擇3～6個月的兔齡，不會因兔齡過小或股骨干硬度不夠影響實驗準確性。通過兔股骨的解剖研究證明兔股骨可以用外固定架可靠固定。實體解剖發(fā)現(xiàn)股骨外觀略成橢圓，其前側(cè)骨面較扁，故采用直徑1.5mm固定螺釘。實驗中要盡量避免發(fā)生骨質(zhì)劈裂、外固定架脫出等問題以便保證外固定架的穩(wěn)定。

3.3造模缺損長度的確定 實驗中模型的建立存在長度不一等問題，對各項結(jié)果的準確性和科學性造成影響。因此，制備一個科學的標準的缺損性骨折不連實驗動物模型是實驗研究十分重要的一步。

骨缺損是否可以自行愈合首先決定于其缺損長度，此外還包括動物的種屬、年齡等。Schmize得出結(jié)論，造成骨不愈合的缺損范圍為長骨干直徑的1.5～2.5倍以上或其長度的1/10以上。一旦骨缺損超過這個長度即超出了骨自行修復的最大能力。國內(nèi)有些學者曾經(jīng)制作過長度為15mm的大段骨缺損模型[6]。根據(jù)解剖測量得到其直徑平均值為5.85mm，根據(jù)上述理論可以確定當骨缺損長度為10mm時，骨折不能愈合，可以制成兔股骨缺損性骨不連模型。

參考文獻：

[1]Borrelli JJr，Prickett WD， Ricci WM.Treatment of nonunion and osseous defects With bone graft and calcium sulfate[J].Clin Orthop Relat Res，2003，411：245-254.

[2]張元平，崔繼秀，裴國獻，等.兔股骨缺損模型的建立[J].中國臨床康復，2006，10（5）：87- 89.

[3]Murar k.The effect of definitive continuous distraction employed with the type external fixation systemon fracture healing ：an experiment rabbit model[J]. Acta Orthop Traumatol Turc，2005，39：247-257.

[4]李志躍，孫運才.骨基質(zhì)明膠復合紅霉素及同種骨修復節(jié)段性骨缺損的實驗研究[J].中華骨科雜志，2000，20：（7）440-443.

[5]Robert RS，Weit zman AM， T racey WJ，et al . Simultaneous treatment of tibial bone and soft- tissue defects with the IIizarov method[J].J orthop Trauma，2006，20（3）：197.

[6]彭吾訓，王蕾，鄧進，等.一種組織工程骨修復兔股骨頭壞死模型的效果評價[J].第三軍醫(yī)大學學報，2010，32（7）：661-664.

編輯/康潔