四棱豆抗氧化活性研究

朱曉娣，連朋麗，張　丹，康文藝

(河南大學(xué) 中藥研究所，河南 開封 475004)

四棱豆抗氧化活性研究

朱曉娣，連朋麗，張丹，康文藝*

(河南大學(xué) 中藥研究所，河南 開封 475004)

摘要：目的研究四棱豆不同提取部位的抗氧化活性。方法采用DPPH法、ABTS法和FRAP分析方法對(duì)四棱豆體外抗氧化活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，并分析其總多酚與總黃酮含量與其抗氧化活性的相關(guān)性。結(jié)果四棱豆石油醚部位和正丁醇部位抗氧化活性分別為ABTS：IC50=70.14 mg/L，TEAC=105.37 μmoL/g和ABTS：IC50=46.91 mg/L，TEAC=596.62 μmoL/g，其活性均弱于陽(yáng)性對(duì)照藥物BHT(ABTS：IC50=6.56 mg/L，TEAC=2 503.17 μmoL/g)。結(jié)論四棱豆石油醚部位和正丁醇部位均有一定的抗氧化活性，且后者抗氧化活性高于前者。正丁醇部位清除ABTS自由基及還原Fe3+的能力可能與總多酚含量較高有關(guān)。

關(guān)鍵詞：四棱豆;抗氧化活性;總多酚;總黃

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：識(shí)碼： A

文章編號(hào)：號(hào)： 1672-7606(2015)01-0017-04

收稿日期：2014-10-12

基金項(xiàng)目：海南省科技廳(瓊農(nóng)科：2013065)。

作者簡(jiǎn)介：朱曉娣(1989-)，女，河南洛陽(yáng)人，在讀碩士研究生，從事中藥活性成分研究工作。

通訊作者：*康文藝(1971-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥活性成分及新藥研究工作。

Abstract:ObjectiveTo study the antioxidant activity of different extracts from Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC. MethodsThe antioxidant activity of P. Tetragonolobus was evaluated by DPPH free radical scavenging, ABTS free radical scavenging and FRAP assay methods, and the correlation of the antioxidant activity and total polyphenols and flavonoids was studied. ResultsThe results showed that the antioxidant activity values of its petroleum ether extract and n-butanol extract were ABTS:IC50= 70.14 μg/mL,TEAC=105.37 μmol/g和ABTS:IC50=46.91 μg/mL,TEAC=596.62 μmol/g, respectively.And they were lower than that of BHT (ABTS: IC50was 6.56 μg/mL, TEAC was 2503.17 μmol/g, respectively). Conclusion The petroleum ether extract of P. Tetragonolobus and n-butanol extract had certain antioxidant activity, and the latter was higher than the former. ABTS radical scavenging activity and Ferric reducing antioxidant power of n-butanol extract of P. tetragonolobus might be related to its high polyphenols content.

Antioxidant activities of Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC

ZHU Xiaodi, LIAN Pengli, ZHANG Dan, KANG Wenyi*

(InstituteofChineseMateriaMedica,HenanUniversity,Kaifeng,Henan475004,China)

Key words: Psophocarpus tetragonolobus (L.)DC; antioxidant activity; total polyphenols; total flavonoid

四棱豆 [Psophocarpus tetragonolobus (L.)DC]，又名翅豆、翼豆和楊桃豆等，是一種熱帶豆科植物，其種子、塊根、嫩莢、花、莖和葉均可食用，全株富含人體必需的多種營(yíng)養(yǎng)成分，被譽(yù)為“綠色金子”“熱帶大豆”及“奇跡植物”[1]。人們對(duì)四棱豆在引種、新品種選育、栽培技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)成分和功能因子等方面研究較多[2-7]，對(duì)藥理活性的報(bào)道較少，未見對(duì)四棱豆抗氧化活性的報(bào)道。

我們用清除DPPH、ABTS自由基和鐵離子還原/抗氧化 (FRAP) 能力測(cè)定四棱豆的體外抗氧化活性，并測(cè)定其總酚類和總黃酮類的含量，分析其與抗氧化活性的關(guān)系，為四棱豆的進(jìn)一步研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1　儀器

Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Electron公司)；LRH-150恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；電子天平(美國(guó)Mettler-Toledo公司)；CS-H1型混合器(北京博勵(lì)陽(yáng)科技公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph公司)。

1.2　試藥

四棱豆嫩豆莢于2013年1月采集于海南省萬寧市興隆農(nóng)場(chǎng)種植基地，由河南大學(xué)中藥研究所李昌勤教授鑒別為豆科蝶形花亞科四棱豆屬四棱豆Psophocarpus tetragonolobus ( L. ) DC；1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)(日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社)；2,2′-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)(美國(guó)Fluka公司)；Fe3+-三吡啶三啞嗪(tripyridyl-triazine, TPTZ)(比利時(shí)Acros organics公司)； BHT (Butylated hydroxytoluene，二丁基羥基甲苯)(比利時(shí)Acros organics公司)；6-羥基-2, 5, 7, 8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox)(美國(guó) Aldrich公司)；鄰苯二酚(北京化學(xué)試劑公司)；斐林酚試劑(Merck公司)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(河南大學(xué)中藥研究所提供)(純度98%)；其他試劑均為分析純。

2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1　實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1活性成分的提取四棱豆粉碎，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，合并、過濾、濃縮得總浸膏。總浸膏分散于適量水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取并分別濃縮干燥，最終得到石油醚部位、乙酸乙酯部位(量極少)和正丁醇部位。因乙酸乙酯部位提取的量極少，所以，我們只對(duì)其石油醚部位和正丁醇部位進(jìn)行了研究。

2.1.2總多酚的含量測(cè)定在文獻(xiàn)[8]的基礎(chǔ)上稍微改變反應(yīng)時(shí)間、試劑體積，于765 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度 (Y) 對(duì)鄰苯二酚濃度 (X，mg/mL) 作圖，得鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算四棱豆2個(gè)部位所含的總多酚含量。

2.1.3總黃酮的含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[8]，于510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度 (Y) 對(duì)蘆丁濃度 (X，mg/L)作圖，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算四棱豆2個(gè)部位所含的總黃酮含量。

2.1.4抗氧化活性篩選方法

2.1.4.1DPPH方法參照文獻(xiàn)[9]，取10 μL樣品溶液加入到96微孔板中，隨后加入200 μmol/L的DPPH溶液175 μL，陰暗處反應(yīng)20 min，在515 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。每份樣品平行操作3次，取平均值，計(jì)算出清除率及半數(shù)抑制率IC50值。按照公式計(jì)算清除率:

DPPH清除率(%) = [(Acontrol-Asample)/Acontrol]×100

式中，Acontrol為DPPH本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收度，Asample為樣品對(duì)DPPH作用后的吸收度數(shù)值(除去樣品自身吸收)。

2.1.4.2ABTS方法參照文獻(xiàn)[10]，將ABTS配制成7 mmol/L的溶液，K2S2O8配制成2.45 mmol/L的溶液，兩溶液混合后在暗處放置12 h以上，用時(shí)需使溶液的吸光度在734 nm為0.78~0.82 (甲醇稀釋)。樣品的初始濃度為2.0 g/L。將10 μL樣品加入到96微孔板中，然后加入200 μL ABTS 自由基工作液，混勻后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。每份樣品平行3次，取平均值。按照以下公式計(jì)算清除率：

ABTS清除率(%) = [(Acontrol-Asample)/Acontrol]×100

式中，Acontrol為ABTS自由基本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收度，Asample為樣品對(duì)ABTS自由基作用后的吸收度數(shù)值(除去樣品自身吸收)。

2.1.4.3FRAP方法參照文獻(xiàn)[11]，將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取10 μL樣品加入到96微孔板中，隨后加入200 μL新鮮配制的TPTZ工作液，混勻后37 ℃反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在595 nm測(cè)定吸光度。每份樣品平行操作3次，取平均值。若所測(cè)定樣品吸光度值超過線性范圍，則需要進(jìn)一步稀釋樣品。結(jié)果以抗氧化當(dāng)量(即每克樣品的自由基清除能力相當(dāng)于Trolox的自由基清除能力的微摩爾數(shù):TEAC)表示。

2.1.4.4依據(jù)上述公式計(jì)算得到的清除率，用origin軟件處理，得到樣品清除DPPH自由基和ABTS自由基的半數(shù)抑制率IC50值。

2.2　結(jié)果與分析

2.2.1清除DPPH自由基能力

注：NT為未測(cè)定；BHT為陽(yáng)性對(duì)照；同一列數(shù)值中不同字母表示在0.05水平上有顯著性差異。

由表1可以看出，四棱豆石油醚部位和四棱豆正丁醇部位無IC50值，因其清除DPPH自由基初篩率低于50%，故其IC50未測(cè)定。

2.2.2清除ABTS自由基能力由表1可看出，四棱豆石油醚部位和四棱豆正丁醇部位清除ABTS自由基的能力 (IC50分別為70.14和46.91 mg/L) 弱于陽(yáng)性對(duì)照BHT (IC50為6.56 mg/L)，具有顯著性差異(P<0.05)，且四棱豆石油醚部位清除ABTS自由基的能力弱于四棱豆正丁醇部位。

圖1顯示，當(dāng)質(zhì)量濃度為23.80 mg/L時(shí)，四棱豆石油醚部位對(duì)ABTS自由基的清除率為14.46%，隨其質(zhì)量濃度的增加清除率增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為95.23 mg/L時(shí)，清除率為62.53%；當(dāng)質(zhì)量濃度為5.95 mg/L時(shí)，四棱豆正丁醇部位對(duì)ABTS自由基的清除率為6.33%，隨其質(zhì)量濃度的增加清除率增大，質(zhì)量濃度為95.23 mg/L時(shí)，清除率增大到96.75%?？梢姡趯?shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，四棱豆提取部位對(duì)ABTS自由基的清除率與其質(zhì)量濃度呈正量效關(guān)系，即隨著提取部位濃度的增加，對(duì)ABTS自由基的清除率也增大。

2.2.3還原Fe3+能力表1顯示，四棱豆石油醚部位和四棱豆正丁醇部位還原Fe3+的能力(TEAC分別為105.37 μmol/g和596.62 μmol/g)，均弱于陽(yáng)性對(duì)照BHT(TEAC為2 503.17 μmol/g)，具有顯著性差異 (P<0.05)，四棱豆石油醚部位還原Fe3+的能力弱于四棱豆正丁醇部位。

2.2.4總多酚和總黃酮的含量按照上述實(shí)驗(yàn)方法，繪制總多酚和總黃酮含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度 (Y) 對(duì)鄰苯二酚濃度 (X，mg/L) 作圖，得鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=119X-0.049 (r=0.998 5)，以吸光度 (Y) 對(duì)蘆丁濃度 (X，mg/L) 作圖，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=9.309X-0.004(r=0.999 5)，以此計(jì)算四棱豆中總多酚和總黃酮的含量結(jié)果,見表2。

注：同一列數(shù)值中不同字母表示在0.05水平上有顯著性差異。

由表2可以看出，四棱豆石油醚部位的總多酚含量低于正丁醇部位，而總黃酮含量高于正丁醇部位。綜合四棱豆抗氧化結(jié)果可得出，四棱豆石油醚部位中總黃酮含量較高而抗氧化活性較低，可能與其含黃酮類成分的結(jié)構(gòu)、其他成分或多成分之間協(xié)同作用有關(guān)。

3結(jié)論

四棱豆石油醚部位和正丁醇部位清除ABTS自由基的能力和還原Fe3+的能力均弱于陽(yáng)性對(duì)照BHT，有一定的抗氧化活性能力，正丁醇部位抗氧化活性強(qiáng)于石油醚部位。學(xué)界罕見有關(guān)四棱豆抗氧化研究，此次研究結(jié)果為四棱豆天然抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳東明,艾辛,王佩芝,等.四棱豆的主要農(nóng)藝性狀和品種親緣關(guān)系研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2005,31(5):521-523.

[2] 黨選民,楊衍,劉維俠,等.四棱豆新品種“翠綠”[J].園藝學(xué)報(bào),2008,35(11):1 714.

[3] 吳軍,卞曉東,徐媛.無錫地區(qū)四棱豆引種試驗(yàn)初報(bào)[J].長(zhǎng)江蔬菜,2010(23):45-46.

[4] 任曉霞,裴順強(qiáng).四棱豆日光溫室高產(chǎn)栽培技術(shù)[J].上海蔬菜,2010(5):37-38.

[5] 蔣立文,鄭兵福,廖盧燕,等.四棱豆種子及其發(fā)酵物揮發(fā)性風(fēng)味成分變化[J].食品科學(xué),2010,31(14):221-224.

[6] 趙則海,肖小瓊,邱卓榮,等.四棱豆葉中凝集素的提取及其凝集活性研究[J].現(xiàn)代食品科技,2010,26(12):1 341-1 344.

[7] Roy S, Mandal C, Dutta S K. Site-directed mutagenesis toidentify key residues in structure-function relationship ofwinged bean chymotrypsin-trypsin inhibitor and 3-D structure prediction[J]. Protein Pept Lett, 2011,18(5):471-479.

[8] Kang W Y, Li C F, Liu Y X. Antioxidant phenolic compounds and flavonoids of Mitragyna rotundifolia (Roxb.) Kuntze in vitro[J]. Med. Chem. Res, 2010(19):1 222-1 232.

[9] Wei J F, Yin Z H, Shang F D, et al. Antioxidant activities in vitro and hepatoprotective effects of Lysimachia clethroides Duby on CCl4-induced acute liver injury in mice[J]. Afr J Pharm Pharmacol, 2012,6(10):743-750.

[10] Kang W Y, Wang J M. In vitro antioxidant properties and in vivo lowering blood lipid of Forsythia suspense leaves[J]. Med. Chem. Res, 2010(19):617-628.

[11] Yin Z H, Wang J J, Kang W Y, et al .Antioxidant and a-glucosidase inhibitory activity of red raspberry (Harrywaters) fruits in vitro[J]. Afr J Pharm Pharmacol, 2012,6(45):3 118-3 123.

[責(zé)任編輯李武營(yíng)]