一種康氏木霉內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的分離純化及酶學性質(zhì)

葉 錦， 張靜茹， 覃益民， 劉幽燕

(廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004)

纖維素是葡萄糖以β-1，4糖苷鍵組成的大分子多糖，是最豐富的天然可再生生物資源［1-3］。纖維素可通過纖維素酶水解轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，繼而轉(zhuǎn)化為燃料乙醇及相關(guān)化學品［4］。

纖維素酶是多組分酶系，主要由內(nèi)切β-葡聚糖苷酶(EG)、外切 β-葡聚糖苷酶(CBH)和 β-葡萄糖苷酶3個主要成分組成［5］。盡管大量研究結(jié)果已表明，只有在這3個主要成分酶的協(xié)同作用下，纖維素分子最終才能被降解成葡萄糖。但由于纖維素酶的多樣性及不易分離純化，致使人們對纖維素酶的結(jié)構(gòu)、功能，特別是降解纖維素的作用機制還缺乏足夠的了解，對纖維素酶各成分是如何協(xié)同起作用的，學者們的看法還不盡相同［6］，近年來人們還發(fā)現(xiàn)了一些不具有纖維素酶活性的蛋白質(zhì)也能與纖維素酶起協(xié)同作用，并最終能促進纖維素的降解［7-8］。因此，開展對相關(guān)纖維素酶組分的分離純化及其酶學性質(zhì)研究，無論是對纖維素酶系各成分酶的協(xié)同作用機理還是對纖維素酶系與其他非酶蛋白質(zhì)的協(xié)同增效作用的更深入了解，都將提供重要的方法和理論基礎。

康氏木霉GIMP3.444是1株產(chǎn)纖維素酶系的真菌菌株，覃益民等最近從該菌株中分離純化出一種纖維素酶協(xié)同增效蛋白質(zhì)［9］。本研究對康氏木霉GIMP 3.444菌株產(chǎn)的纖維素酶系各組分酶進行分離純化，并對其中1種內(nèi)切β-葡聚糖苷酶酶學性質(zhì)進行研究，為纖維素酶的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)條件

康氏木霉(Trichodermakoningii)GIMP3.444購于廣東省微生物菌種保藏中心，現(xiàn)保藏于廣西大學化學化工學院生物化工實驗室。

斜面活化培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g 、瓊脂粉 20.0 g，加自來水至1 000 ml，調(diào) pH 6.0，121 ℃ 滅菌 20 min。

搖瓶種子培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，加自來水至1 000 ml，調(diào) pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:甘蔗渣(過80目篩)15.0 g、麥麩粉 8.0 g、(NH4)2SO44.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，加自來水至1 000 ml，調(diào) pH 6.0，121 ℃滅菌 20 min。

取保藏的康氏木霉接種于斜面活化培養(yǎng)基，28℃條件下活化培養(yǎng)3～7 d，刮取平面孢子，用無菌水制成孢子懸浮液，按1%(體積比)接種至種子培養(yǎng)液中，于180 r/min、28℃下培養(yǎng)30～36 h。將搖瓶種子按5%(體積比)接種量接種至裝有150 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，于180 r/min、28℃下培養(yǎng)120 h。

1.2 粗酶的預處理

發(fā)酵液在4℃，8 000 r/min下離心20min，收集上清液，經(jīng)過10 000濾膜壓濾，將濾液用超濾膜濃縮，得到粗酶液。粗酶液用20%飽和度的硫酸銨沉淀，4℃下靜置過夜后，于8 000 r/min離心20 min，取上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為85%，4℃下靜置過夜，離心棄上清液，收集沉淀，加入少量0.1 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液復溶，再次離心除去不溶的雜質(zhì)，濃縮酶液于4℃下充分透析后保存。

1.3 纖維素酶的純化

1.3.1 DEAE Sepharose FF離子交換層析 粗酶液先用DEAE Sepharose FF離子交換層析法進行初步分離，分離柱規(guī)格為 1.6 cm×40.0 cm，用 NaCl濃度梯度從 0 mol/L到 0.8 mol/L的 Tris-HCl(0.1 mol/L、pH 8.0)緩沖液分步洗脫收集，測定各峰纖維素內(nèi)切酶活力，收集有酶活力的峰，4℃保存。所有的操作都在4℃下進行。

1.3.2 Sephadex G-75凝膠過濾層析 用G75凝膠過濾層析法進一步分離DEAE Sepharose FF離子交換層析得到的目標峰，采用 AKTA pure層析系統(tǒng)，用pH 4.8、0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗脫，收集每個峰，測定內(nèi)切β-葡聚糖酶活力，收集有酶活力的洗脫峰，4℃保存。所有的操作都在4℃下進行。

1.4 測定方法

1.4.1 蛋白質(zhì)濃度的測定［10］以牛血清白蛋白質(zhì)為標準，用考馬斯亮藍G-250法測蛋白質(zhì)濃度。

1.4.2 內(nèi)切 β-葡聚糖苷酶活力測定 采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定內(nèi)切酶活性［11］。向試管中各加入1.5 ml 1%(質(zhì)量體積比)的羧甲基纖維素鈉檸檬酸-檸檬酸鈉溶液(0.1 mol/L，pH 4.8)及0.5 ml酶液，在50℃水浴中保溫30 min，取出后，加入3.0 ml DNS試劑終止反應，再沸水浴5 min后，取出流水冷卻，定容至25 ml，在540 nm波長處測定吸光度。以1 ml酶液每30 min催化底物產(chǎn)生出相當于1 mg葡萄糖的還原糖量為1個酶活力單位，以U/ml表示。

1.4.3 蛋白質(zhì)純度鑒定及相對分子量測定 采用SDS-PAGE法測定蛋白質(zhì)純度。聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量分數(shù)12%，蛋白質(zhì)標準品的相對分子質(zhì)量范圍14 400～97 400。

1.5 MALDI-TOFMS分析

蛋白質(zhì)的鑒定和肽段分析采用MALDI-TOFMS方法［12］。將目標電泳條帶切下，37℃用胰蛋白酶處理過夜后，將生物大分子電離后檢測。肽段的信息在NCBInr數(shù)據(jù)庫中搜索。

1.6 最適pH值和溫度

最適反應pH值:取純酶液在 pH 3.0～7.5條件下(pH 3.0～6.0為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、pH 6.5～7.5為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液)，50℃保溫30 min，分別測定內(nèi)切β-葡聚糖苷酶活力，確定酶的最適反應pH值。

最適反應溫度:取純酶液在溫度35～70℃條件下，pH4.8保溫30 min，分別測定內(nèi)切β-葡聚糖苷酶活力，確定酶的最適反應溫度。

1.7 底物動力學參數(shù)測定

分別配制濃度為 0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.7%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的羧甲基纖維素鈉懸浮液(pH 4.8)，與內(nèi)切酶在50℃水浴中保溫30 min，DNS法測定不同濃度底物產(chǎn)生的還原糖，然后按照Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖，得出該酶作用于羧甲基纖維素鈉時的 Km值。

1.8 金屬離子對酶活性的影響

取不同的金屬離子0.3 mmol/L與纖維素酶在pH 4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，在30℃水浴保溫30 min后，50℃下反應30 min，測量有金屬離子作用下的酶活性，以不加金屬離子的酶活性為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的分離純化

將20%～85%硫酸銨沉淀和透析后獲得的粗蛋白質(zhì)經(jīng)DEAE Sepharose FF離子交換層析后，出現(xiàn)5個峰(圖1)。經(jīng)測定，峰2和峰3均有內(nèi)切β-葡聚糖苷酶活力，其中峰3內(nèi)切β-葡聚糖苷酶比活力較高，這說明康氏木霉的發(fā)酵液中至少含有2種內(nèi)切β-葡聚糖苷酶。

將離子交換層析得到的蛋白質(zhì)峰3經(jīng)過Sephadex G-75凝膠過濾層析，得到5個峰(圖2)。經(jīng)測定，峰3-4為主要的內(nèi)切酶組分。

圖1 總蛋白質(zhì)DEAE sepharose FF離子交換層析洗脫曲線Fig.1 Elution profile of the total protein on DEAE sepharose FF

圖2 Sephadex-G75凝膠過濾層析曲線Fig.2 Filtration profile of peak 3 of the protein on sephadex-G75

內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的整個分離純化過程結(jié)果如表1。最終得到的這種內(nèi)切酶組分比活力達到19.65 U/mg，與粗酶液相比，提高了3.65倍，回收率為2.83%。

2.2 內(nèi)切β-葡聚糖苷酶純度、分子量測定及其蛋白質(zhì)種類鑒定

純化的內(nèi)切β-葡聚糖苷酶組分經(jīng)SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)只有1條帶(圖3)，表明該組分已達電泳純。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，該酶的相對分子量約為44 600。

表1 內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的純化結(jié)果Table 1 Purification of endo-β-glucanase

圖3 內(nèi)切β-葡聚糖苷酶SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 Identification of endo-β-glucanase by SDS-PAGE

將該酶進行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索，只有當?shù)鞍踪|(zhì)得分大于65和得分可信度大于95%時，才能說明2種蛋白質(zhì)可能匹配。但從質(zhì)譜結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mascot得分最高的前5個蛋白質(zhì)得分也分別只有 62、59、55、55、55 分，得分可信度都為 0。兩項數(shù)值與我們分離得到的酶匹配度都很低。另外，從數(shù)據(jù)庫搜索出的結(jié)果中并沒有關(guān)于纖維素酶的信息，表明此酶是一種在數(shù)據(jù)庫中沒有登記的未知蛋白質(zhì)，也說明本試驗中分離到的內(nèi)切酶是一種新的內(nèi)切β-葡聚糖苷酶組分。

2.3 內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的酶學性質(zhì)

2.3.1 最適pH值和溫度 pH值和溫度對內(nèi)切酶活力影響結(jié)果見圖4、圖5。結(jié)果(圖4)顯示，該酶催化反應的最適pH值為4.5(檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)，pH值在4.0到5.0之間酶活力較好，當pH值上升到6.0后，酶活力下降比較快。

圖5顯示，該酶的最適反應溫度為55℃，在50℃時，酶活力達到99%，在60℃時，酶活力仍有98%，說明該酶在50℃到60℃之間的穩(wěn)定性好。超過60℃之后，酶活力下降很快，說明該酶對熱比較敏感。

4 pH值-酶活力曲線圖ig.4 The relationship between p H value and enzymatic activities

圖5 溫度-酶活力曲線圖Fig.5 The relationship between temperature and enzymatic activities

2.3.2 金屬離子和試劑對酶活力的影響及動力學參數(shù) 金屬離子和其他試劑對酶活力的影響如表2所示，從加入不同離子后的酶活力可以看出，乙二胺四乙酸(EDTA)、鎂離子(Mg2+)、銅離子(Cu2+)和鋅離子(Zn2+)基本對酶活力沒有影響，而鈣離子(Ca2+)對酶的抑制作用較強，抑制了近35%的酶活力。二價鐵離子(Fe2+)、錳離子(Mn2+)、鉛離子(Pb2+)、銨離子(NH+4)則都有不同程度的抑制作用。

表2 金屬離子和試劑對酶活力的影響Table 2 Effect of chemical reagent and ions on activities of endo-βglucanase

以羧甲基纖維素鈉作為底物，在pH 4.8、50℃條件下測定酶活力，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖，根據(jù)回歸曲線得出反應速率v與底物濃度［S］的標準方程為:1/v=8.633 9(1/［S］)+1.195 8。進而求得以羧甲基纖維素鈉為底物時，內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的米氏常數(shù)Km值為7.22 mg/ml。最大反應速率Vmax為3.72 mg/(min·ml)。

3 討論

由于微生物來源的纖維素酶是多組分酶系，且各組分酶之間的分子量和等電點等相差不大，要將內(nèi)切β-葡聚糖苷酶組分從纖維素酶系中分離純化出來較為困難。本試驗從康氏木霉GIMP3.444菌種的發(fā)酵產(chǎn)物中，通過(NH4)2SO4分級沉淀、DEAE Sepharose FF陰離子交換層析、Sephadex G-75凝膠過濾層析等方法分離純化出一種內(nèi)切β-葡聚糖苷酶組分，電泳檢測僅顯示1條蛋白質(zhì)條帶，說明該方法比較適宜該菌株內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的分離純化。

本試驗分離得到的新內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的相對分子質(zhì)量為44 600，比活力為19.65 U/mg，最適反應pH值和最適反應溫度分別為4.5和55℃，Ca2+對酶有較強抑制作用，抑制了近35%的酶活力。以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為底物時，酶的米氏常數(shù)(Km)為7.22 mg/ml。該酶的質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果表明，分離到的內(nèi)切酶蛋白質(zhì)是一種在數(shù)據(jù)庫中沒有登記的未知蛋白質(zhì)，即一種新的內(nèi)切酶組分。與文獻報道的內(nèi)切β-葡聚糖苷酶相比，該酶在分子量及一些酶學性質(zhì)上存在著差異，且這些差異不僅存在于不同來源微生物的酶中，還存在于相同來源微生物的酶中。由于這些差異的存在，就要求我們在研究和利用這些酶的過程中必須明確其酶學性質(zhì)，才能更好地發(fā)揮酶活性。正是由于纖維素酶系的復雜性，導致到目前為止對纖維素酶水解作用的機理尚未完全研究清楚，而這種新的纖維素酶組分的發(fā)現(xiàn)也能夠加深我們對纖維素酶系的組成及其在水解過程中的作用的了解。

從目前的研究看，真菌產(chǎn)生的纖維素酶普遍具有多樣性，如 Wood 等［13］、朱年青等［14］和陳冠軍等［15］分別從康氏木霉 Trichodermakoningii、里氏木霉Trichodermareesei和棘孢曲霉Asgergillusaculeatus中純化出了3種、2種和5種內(nèi)切β-葡聚糖酶，分子量和酶學性質(zhì)也各不相同。同樣從本試驗的分離純化過程中也發(fā)現(xiàn)，康氏木霉GIMP3.444除了分泌本試驗得到的新內(nèi)切β-葡聚糖酶外，至少還分泌另外1種內(nèi)切β-葡聚糖酶組分。因此，在研究纖維素酶系各成分酶的協(xié)同作用機理或研究纖維素酶系與其他非酶蛋白質(zhì)的協(xié)同增效作用時，需考慮這種同工酶存在的影響。

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