長春西汀對小鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用*

孔曉君，王曉梅，高 鑫，李建遠(yuǎn)(.寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,銀川 750004；.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺 64005;3.煙臺毓璜頂醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺 64004)

?

長春西汀對小鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用*

孔曉君1，王曉梅1，高 鑫2，李建遠(yuǎn)3△(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,銀川 750004；2.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺 264005;3.煙臺毓璜頂醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺 264004)

目的 探討長春西汀對小鼠腎缺血再灌注(IR)損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法 將48只健康小鼠分成假手術(shù)組、IR組、長春西汀低劑量干預(yù)組和長春西汀高劑量干預(yù)組，采用雙側(cè)腎蒂夾閉45 min的方法建立小鼠腎IR損傷模型，HE染色后觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)變化，測定再灌注24 h后各組血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和IL-6水平，觀察腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，IR組出現(xiàn)腎小管管腔擴(kuò)張,刷狀緣消失，管腔內(nèi)有管型等病理改變，血清中SCr、BUN、TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，腎組織SOD活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MDA水平升高，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IR組相比，長春西汀10 mg/kg和20 mg/kg干預(yù)可呈劑量依賴性改善腎組織病理損傷，SCr、BUN、TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平減少，使腎組織SOD活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 長春西汀可通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激來減輕腎IR損傷。

長春西??； 腎缺血再灌注損傷； 炎癥因子； 氧化應(yīng)激

腎缺血再灌注(IR)是一常見的臨床問題，腎移植、腎部分切除術(shù)、腎部分血管成形術(shù)、休克復(fù)蘇等均可造成不同程度的腎IR損傷，是造成急性腎衰竭和移植腎功能恢復(fù)延遲的主要原因。其病理損傷機(jī)制比較復(fù)雜，主要涉及氧化應(yīng)激、炎癥因子的釋放和細(xì)胞凋亡等[1]。長春西汀是從夾竹桃科小蔓長春花提取的生物堿，臨床上一直用于缺血性腦血管疾病的治療和預(yù)防，它在腦、肝等IR損傷中的保護(hù)作用已被報(bào)道，但其在腎IR的作用還是未知的[2-3]。本研究旨在探討長春西汀在腎IR損傷中的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性昆明白小鼠，體質(zhì)量30～40 g(濱州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。長春西汀注射液購自山東瑞陽制藥有限公司。小鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白水平測定試劑盒購自煙臺賽爾斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型制備 將小鼠分成4組：(1) 假手術(shù)組(n=8)；(2)IR組(n=8)；(3)長春西汀低劑量干預(yù)組(n=8)；(4)長春西汀高劑量干預(yù)組(n=8)。小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪(80/10 mg/kg)腹腔麻醉后仰臥在手術(shù)臺上，腹部備皮、消毒后正中切口，游離左右腎蒂，假手術(shù)組不夾閉，其余3組分別用無損傷血管夾夾閉，45 min后松開恢復(fù)血流，以肉眼觀察腎臟顏色變化來判斷腎臟缺血或再灌注是否成功。長春西汀低劑量和高劑量干預(yù)組分別在術(shù)前1 h腹腔注射長春西汀10 mg/kg和20 mg/kg；假手術(shù)組和IR組同時(shí)給予等量生理鹽水。再灌注24 h后打開腹腔，下腔靜脈取血分離血清，取一部分腎組織Bouin氏液固定，剩余腎組織用冰磷酸鹽緩沖液漂洗后-70 ℃保存。

1.2.2 組織學(xué)評價(jià) 取小鼠腎組織，Bouin氏液固定24 h，常規(guī)制備石蠟切片，脫蠟水化后用HE試劑盒染色，光鏡下觀察腎臟的組織形態(tài)變化。

1.2.3 血清指標(biāo)檢測 血清中肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平采用全自動(dòng)生化分析儀(美國德靈Dimension RXL Max)測定。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.4 腎組織中MDA水平和SOD活性檢測 稱1 g腎組織，放入玻璃勻漿器中，加冷生理鹽水在冰上研磨成10%的組織勻漿，3 000 r/min低溫離心10 min后取上清液，分別按照試劑盒操作步驟對MDA水平和SOD活性進(jìn)行檢測。蛋白濃度用BCA蛋白水平測定試劑盒檢測。

2 結(jié) 果

2.1 腎組織形態(tài)學(xué)變化 見圖1。HE染色可見假手術(shù)組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，發(fā)現(xiàn)IR組腎小管排列紊亂，管腔擴(kuò)張，部分刷狀緣消失；腎小管上皮細(xì)胞腫脹，壞死；管腔內(nèi)可見管型；腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤。長春西汀干預(yù)后腎組織病理損傷減輕，其中高劑量干預(yù)組損傷改善更顯著，可見腎小管結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，管腔內(nèi)管型減少，炎癥細(xì)胞少見。

注：A為假手術(shù)組；B為IR組；C為長春西汀低劑量干預(yù)組；D為長春西汀高劑量干預(yù)組。

2.2 4組腎功能指標(biāo)變化 見表1。與假手術(shù)組相比，IR組SCr和BUN水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；長春西汀干預(yù)組SCr和BUN與IR組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；長春西汀高、低劑量干預(yù)組SCr和BUN差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 血清中TNF-α、IL-1β、IL-6結(jié)果比較 見表2。與假手術(shù)組相比，小鼠腎IR可引起細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。用長春西汀預(yù)處理后，與IR組相比，TNF-α、IL-1β 和IL-6表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組降低更顯著，與低劑量組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 腎組織中MDA水平和SOD活性變化 見表3。與假手術(shù)組比較，IR組腎組織中MDA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SOD活性明顯降低，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；長春西汀低劑量干預(yù)組與IR組相比，MDA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SOD活性雖有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高劑量干預(yù)組與IR組相比，MDA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SOD活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 4組SCr和BUN結(jié)果比較

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與IR組比較，*P<0.05；與長春西汀低劑量組比較，△P<0.05。

表2 4組TNF-α、IL-1β、IL-6結(jié)果比較

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與IR組比較，*P<0.05；與長春西汀低劑量組比較，△P<0.05。

表3 4組MDA和SOD結(jié)果比較

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與IR組比較，*P<0.05；與長春西汀低劑量組比較，△P<0.05。

3 討 論

本研究采用夾閉雙側(cè)腎蒂造成腎缺血45 min再恢復(fù)血供的方法建立小鼠腎IR損傷模型[4]。術(shù)后24 h，IR組小鼠SCr和BUN升高，腎組織病理損傷明顯，提示腎臟IR模型制備成功。給予長春西汀干預(yù)后，SCr和BUN水平降低，腎組織病理損傷減輕，由此提示長春西汀干預(yù)處理可以改善腎IR損傷程度。

腎IR損傷中有眾多的炎癥介質(zhì)和免疫因子參與，TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)升高已經(jīng)成為腎IR炎癥的重要標(biāo)志[5]。TNF-α是活化單核細(xì)胞產(chǎn)生的多活性細(xì)胞因子，其能刺激單核巨噬細(xì)胞合成和分泌IL-1β和IL-6等炎癥因子[6]。本研究中IR組TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)升高，證明有炎癥參與了組織損傷。長春西汀干預(yù)組相對IR組TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)降低，提示長春西汀可以通過抑制炎癥改善腎IR損傷。研究表明，長春西汀作為磷酸二酯酶抑制劑，能夠抑制炎癥相關(guān)因子，如核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和TNF-α的表達(dá)，從而降低IL-1β、IL-6和IL-8等炎癥因子的表達(dá)，起到保護(hù)組織的作用[2,7]。

氧自由基的生成被認(rèn)為是IR損傷中最重要的發(fā)病機(jī)制之一[8]。大量氧自由基能夠攻擊細(xì)胞膜的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，破壞組織的結(jié)構(gòu)和功能。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，能夠直接反映組織損傷程度[9]。SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基的攻擊。本研究中與假手術(shù)組相比，小鼠IR后腎臟中MDA水平升高，SOD活性降低，表明腎IR后氧自由基產(chǎn)生增多，損傷了生兒缺血缺氧性腦病預(yù)后的影響[J].臨床兒科雜志，2006，24(3)：188-190.

[3]鮑秀蘭.新生兒行為與0～3歲潛能開發(fā)指南[M].北京：中國商業(yè)出版社，2001：66-100.

[4]沈曉明，金星明.發(fā)育與行為兒科學(xué)[M].南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2005：22-47.

[5]朱華，彭珉娟，楊濤毅，等.神經(jīng)行為發(fā)育監(jiān)測及早期干預(yù)對高危兒智能發(fā)育影響的研究[J].四川醫(yī)學(xué)，2013，34(12)：1780-1783.

[6]鮑秀蘭.重視高危兒的發(fā)育風(fēng)險(xiǎn)和早期科學(xué)干預(yù)對策[J].中國兒童保健雜志，2011，19(5)：393-394.

[7]李德樂，施玉麒，高建慧，等.規(guī)范管理和早期干預(yù)對高危兒智能的影響[J].中國兒童保健雜志，2007，15(4)：401-402.

[8]李明.高危新生兒隨訪中的神經(jīng)發(fā)育評估及其意義[J].中國新生兒科雜志，2009，24(6)：324-327.

[9]Aderson LM,Shinn C,Fullilove MT,et al.The efectiveness of early childhood devempment programs A systematic reveiew[J].Am J Prey Med,2003,24(Suppl 3):32-46.

[10]李喬紅，鄒永蓉，龔放，等.新生兒缺血缺氧性腦病早期干預(yù)治療與預(yù)后分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，4(9)：816-817.

[11]中華醫(yī)學(xué)會科學(xué)會新生兒組.新生兒缺氧缺血性腦病診斷依據(jù)和臨床分度[J].中國實(shí)用兒科雜志，2006，15(6)：379-380.

[12]鄒為英.關(guān)于新生兒缺血缺氧性腦病的臨床觀察與護(hù)理分析[J].中國醫(yī)藥指南，2013，11(15)：338-339.

[13]李紅梅，吳靜，黃健蘭.新生兒缺血缺氧性腦病實(shí)施早期干預(yù)治療的療效與預(yù)后分析[J].中國婦幼保健，2010，25(23)：3291-3293.

Protective effect of vinpocetine on mice renal ischemia-reperfusion injury*

KONGXiao-jun1,WANGXiao-mei1,GAOXin2,LIJian-yuan3△

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China;2.SchoolofLifeScience,YantaiUniversity264005；3.CentralLaboratory,YantaiYuhuangdingHospital,Yantai,Shandong264004,China)

Objective To investigate the protective effect and mechanism of vinpocetine in renal ischemia-reperfusion injury.Methods Forty-eight healthy male mice were randomly divided into the sham operation group,ischemia-reperfusion (IR) group,low dose and high dose(10 mg/kg and 20 mg/kg) vinpocetine pretreatment groups.The renal ischemia-reperfusion injury models were established by clamping bilateral renal pedicle for 45 min.The renal morphology changes were observed by the HE staining.The Scr,BUN,TNF-α,IL-1β and IL-6 levels at 24 h after reperfusion were detected.The superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) contentrations were determined.Results Compared with the sham operation group,the pathological changes in the IR group were tubular dilatation,loss of brush border and casts in lumen.The levels of Scr,BUN,TNF-α,IL-1β and IL-6 in the IR group were significantly increased(P<0.05).The SOD activity of kidney tissue was significantly decreased and the MDA contentration was increased,the differences were statistical significant(P<0.05);compared with the IR group,vinpocetine10 mg/kg and 20 mg/kg could improve the pathological injury of renal tissue in a dose-dependent manner,the levels of Scr,BUN,TNF-α,IL-1β,IL-6 and MDA were decreased and the SOD activity was increased,the differences were statistically significant(P<0.05).Conclusion Vinpocetine can ameliorate the renal ischemia-reperfusion injury in mice by inhibiting inflammation and oxidative stress.

vinpocetine; renal ischemia reperfusion; inflammatory factor; oxidative stress

國家自然科學(xué)基金(31071262)。

孔曉君，女，碩士,初級檢驗(yàn)技師，主要從事腎缺血再灌注損傷機(jī)制研究。

△通訊作者，E-mail：sdsclj@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.002

A

1672-9455(2015)09-1183-02

2014-11-29

2015-01-20)