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    石墨烯修飾的電化學免疫傳感器在腫瘤標志物檢測中的應用*

    2015-04-15 18:53:57綜述刁奇志審校重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院檢驗科402160
    檢驗醫(yī)學與臨床 2015年9期
    關鍵詞:電化學抗原靈敏度

    曾 莉 綜述,刁奇志 審校(重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院檢驗科 402160)

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    石墨烯修飾的電化學免疫傳感器在腫瘤標志物檢測中的應用*

    曾 莉 綜述,刁奇志 審校(重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院檢驗科 402160)

    石墨烯; 電化學免疫傳感器; 腫瘤標志物

    腫瘤標志物是指在腫瘤的發(fā)生和增殖過程中,由腫瘤細胞本身所產生的或者是由機體對腫瘤細胞反應而產生的,反映腫瘤存在和生長的一類物質。其在腫瘤普查、診斷、判斷預后、評價療效和高危人群隨訪觀察等方面都具有較大的實用價值。目前檢測方法主要有放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶標記免疫分析法、化學免疫發(fā)光分析法、時間分辨熒光免疫分析法、蛋白芯片檢測法,這些方法存在靈敏度低、特異度低、放射性損害、反應條件嚴格、操作繁瑣、分析困難等不足,限制其在臨床的進一步應用。發(fā)展高靈敏的免疫分析技術對于腫瘤標志物的檢測有至關重要的意義。電化學免疫傳感器利用抗原和抗體間的高度特異性結合,將免疫分析法和電化學傳感器相結合,具有靈敏度高,分析速度快,操作簡便、價格低廉及選擇性好等優(yōu)點,被廣泛應用于臨床診斷領域。其中石墨烯由于其獨特的二維結構、優(yōu)良的電化學性能、制備方法多樣化、成本低廉、適合于規(guī)?;苽?、可用于固定抗體等優(yōu)點,為電化學免疫傳感器性能的提高提供了一種全新方法。本文簡單介紹了石墨烯的特點、制備方法,重點綜述了近年來石墨烯修飾的電化學免疫傳感器在腫瘤標志物檢測的研究及應用,并對目前存在的問題及發(fā)展前景進行展望。

    1 石墨烯特點及制備

    1.1 石墨烯 自2004年Man大學的Geim等首次用機械剝離法獲得了單層石墨烯后,其獨特的結構和電化學性能就一直備受矚目。石墨烯是由碳原子以sp2雜化緊密連接包裹的六角晶體結構構成的單原子層,是現今已知的最薄的二維材料[1-2]。石墨烯大的比表面積(理論表面積2 630 m2/g)和極強的電導能力(64 ms/cm)可以保證對待測物的高效吸附及負載,提高基于石墨烯修飾的電化學免疫傳感器的靈敏度及信噪比。此外,石墨烯還具有大的電位窗口、低電荷傳遞電阻、快速電子傳遞速率等獨特的電化學性質,可作為電極的理想材料并廣泛應用于電化學傳感器新領域[3-4]。

    1.2 石墨烯的制備 石墨烯類材料包括石墨烯、氧化石墨烯和還原氧化石墨烯等?,F今制備石墨烯的方法層出不窮:氧化石墨還原法、外延生長法、電化學方法、電弧法、有機合成法、金屬表面生長法、氧化減薄石墨片法、肼還原石墨烯法、乙氧鈉裂解法和切割碳納米管法等[5]。在生物醫(yī)學領域研究較多的通常為功能化的石墨烯、氧化石墨烯。因為其表面帶有羥基、羧基等功能化基團,可改善石墨烯的分散性、水溶性及穩(wěn)定性等,并可以通過?;磻?、酯化反應等將其他基團或生物分子修飾到氧化石墨烯表面[6]。目前主要利用Hummers法制得氧化石墨后,將氧化石墨經高溫或者超聲處理,在其層間產生巨大能量而剝落形成氧化石墨稀片。由于超聲作用剝離程度高,而且處理過程無化學變化,能基本維持氧化石墨稀表面結構,成為氧化石墨剝離的主要方法。

    2 石墨烯修飾的免疫傳感器在腫瘤標志物檢測中的應用

    腫瘤標志物主要用于惡性腫瘤輔助診斷、病情和預后判斷、療效監(jiān)測和靶向定位治療。電化學免疫傳感器與傳統(tǒng)免疫測試相比,集免疫反應、信號產生、信號檢測一體化,具有結構緊湊、使用方便、靈敏度高、成本低、能微型化等特點,有利于對免疫反應進行動力學分析,尤其在臨床腫瘤標志物診斷領域,其作用越來越受到重視,成為目前較活躍的研究領域[7-8]。

    石墨烯納米材料的應用進一步提高了免疫傳感器的靈敏度。Wu等[9]將摻雜氮的石墨烯修飾到玻碳電極上固定鱗狀上皮細胞抗原一抗,通過夾心免疫法實現對鱗狀上皮細胞癌抗原的檢測。由于石墨烯是一種零帶隙材料,原子摻雜可以調控其能帶結構,提高電催化性能,由該方法修飾的傳感器檢出限低至15.30 ng/mL,線性范圍0.05~18.00 ng/mL。

    2.1 檢測癌胚抗原(CEA) CEA可作為結腸癌腫瘤標記物及惡性腫瘤的輔助診斷。Li等[10]團隊構建了一種檢測CEA的無標記電化學免疫傳感器。石墨烯與Nafion溶液超聲混勻后滴涂至玻碳電極,浸入含2.5 mmol/L的鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀磷酸鹽緩沖液中,通過電化學阻抗法初步探索免疫傳感器的性能,其具有高靈敏度(0.17 ng/mL),特異性好,干擾物質如乙肝核心抗原、葡萄糖氧化酶、抗壞血酸等對電化學檢測過程無影響,可視為用于臨床診斷十分有前途的替代工具。

    氧化石墨烯含有大量含氧官能團,功能化后可與納米粒子、聚合物、有機金屬化合物等多種功能材料聯合修飾制備電極。例如Zhong等[11]課題組制備了納米金包裹的石墨烯復合納米材料修飾到電極上,與辣根過氧化物酶-anti-CEA交聯后,研制出的免疫傳感器檢測CEA的線性范圍為0.05~350.00 ng/mL,與傳統(tǒng)的辣根過氧化物酶-抗CEA和納米金標記的辣根過氧化物酶-抗CEA相比,其靈敏度提高了100倍,檢測限可達到 0.01 ng/mL。結果充分表明,功能化的石墨烯大的表面積和良好的電子傳輸效率在提高抗體固定量的同時也增強了酶活性中心電子的傳輸速率,從而增強了電極響應信號,提高了免疫傳感器靈敏度。與標準的化學發(fā)光酶聯免疫分析方法共同檢測54例血清標本,檢測相符率高,對于腫瘤的早期診斷,提高腫瘤治愈率和預后具有重要應用價值。

    2.2 檢測甲胎蛋白 由于還原氧化石墨烯具有:(1)含大量缺陷和化學官能團,促進電荷轉移,具有高電化學活性;(2)其表面豐富的化學基團易于功能化,有助于提高傳感器性能;(3)化學性能和電子特性高度可調;(4)相比絕緣石墨烯,還原氧化石墨烯能高效傳輸電荷;(5)通過共價法或非共價法被官能化來增強傳感器的靈敏度、特異性、負載能力、生物相容性等優(yōu)點,所以多數基于石墨烯的電化學免疫傳感器選用還原氧化石墨烯修飾電極[12]。Xiao等[13]將非共價改性法制得的還原氧化石墨烯與苝四甲酸在堿性條件下一鍋法同時合成后,成功制備了釕/苝四甲酸/石墨烯修飾的固態(tài)電化學發(fā)光免疫傳感器。該方法獲得的還原氧化石墨烯既能保留石墨烯的結構和電子性質,又能有效提高石墨烯的化學性質。表現出較吸附衍生物釕復合物約21倍以上的發(fā)光量子效率,對甲胎蛋白檢測的靈敏度高達0.20 pg/mL,與傳統(tǒng)檢測方法相比,具有廣大的應用前景。氧化石墨烯也可以通過化學、電化學、熱還原等技術轉化成還原氧化石墨烯,提高其導電性與傳感性能。Qi等[14]在氧化石墨烯還原過程中注入一氧化碳氣體,利用一鍋法得到了還原氧化石墨烯,自主合成了以鈀還原氧化石墨烯修飾電極的免疫傳感器。試驗結果表明,其能有效促進電荷轉移,提高傳感器檢測甲胎蛋白的靈敏度至5.00 pg/mL。

    2.3 檢測其他腫瘤標志物

    2.3.1 糖類抗原125(CA125)為目前惟一被推薦作為卵巢癌標志物的腫瘤標志物,在卵巢癌患診斷、療效評價及監(jiān)測復發(fā)中地位明確[15]。Taleat等[16]課題組在聚茴酸修飾的石墨烯絲網印刷電極共價結合CA125抗體,在夾心結構的基礎上進行免疫測定。其最終檢測范圍為5~25 U/mL,靈敏度低至2 U/mL。

    2.3.2 CA15-3是乳腺癌最重要的特異性標志物。Li等[17]首先報道了制備靈敏檢測糖類抗原的無標記新型電化學免疫傳感器方法。與以往傳統(tǒng)免疫傳感器不同,高導電性的氮摻雜石墨烯片修飾電極的設計,無需標記并顯著增加了電子傳輸。最低檢測限為0.012 U/mL,線性范圍0.1~20.0 U/mL。

    2.3.3 人絨毛膜促性腺激素(HCG)在幾乎所有絨毛膜上皮細胞癌、70% 的非精原細胞性睪丸癌可見。Li[18]利用石墨烯和多孔納米金箔能雙重放大電化學效應的優(yōu)點,以對苯二酚為還原指示劑,多孔納米金箔固定HCG,得到了較寬的線性范圍0.5~40.00 ng/mL和較高的靈敏度0.034 ng/mL。

    2.3.4 前列腺特異性抗原可作為前列腺癌的特異性標記物。Chen等[19]新研發(fā)了一種無標記檢測前列腺特異性抗原的三維電化學免疫方法。利用高導電性的石墨烯納米金復合物修飾電極后,該免疫傳感器的電子轉移和靈敏度明顯升高至0.59 ng/mL,電流變化的最高水平與對應的濃度之比為5 μA/(ng/mL)。該三維免疫傳感器的制備為免疫傳感器新方法的研究提供了一種很好的借鑒。

    2.4 多種標志物聯合檢測 測量單一腫瘤標志物往往具有有限的診斷價值[20]。同時檢測多種分析物可以縮短分析時間,減少檢測成本,提高測試效率,具有更重要的臨床應用價值。Wu等[21]發(fā)明了一種在還原氧化石墨烯/四乙烯五胺修飾的玻碳電極上同時檢測CEA和鱗狀細胞抗原的電化學免疫法。在夾心免疫基礎上,分別在中性紅峰值電位0.62 V及硫堇峰值電位0.17 V下研究抗原濃度與峰值電流變化的關系,得到CEA和鱗狀細胞抗原最低檢測限分別為0.013 ng/mL和0.010 ng/mL,重復性好(相對標準偏差分別為3.3%、4.8%)。該免疫傳感器開發(fā)的策略為腫瘤標志物多項目聯合檢測提供了一種有前途的方法。

    3 展 望

    石墨烯修飾的電化學免疫傳感器為腫瘤標志物檢測的研究提供了一種全新的方法,但是如何大規(guī)模制備結構完整、尺寸和層數可控的高質量石墨烯仍然是當前需要重點攻克的課題。鑒于目前關于石墨烯修飾的電化學免疫傳感器的研究大多仍停留在基礎研究階段,如何實現由基礎研究轉向高通量、微型化、商業(yè)化方向發(fā)展仍需努力。伴隨著新的化學修飾方法、摻雜的石墨烯的制備和分子水平功能修飾等技術的不斷研究與引進,石墨烯修飾的電化學免疫傳感器在腫瘤標志物檢測等生物醫(yī)學領域將具有更廣闊的前景。

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    腎小管上皮細胞。有研究表明,長春西汀另一個保護作用機制就是它能夠清除羥自由基和其他活性氧而發(fā)揮顯著的抗氧化活性,這與本研究結果相符[10-11]。本研究發(fā)現,長春西汀干預組腎組織SOD活性升高,MDA水平有所降低,由此表明長春西汀能夠保護內源性SOD活性,抑制脂質過氧化,從而發(fā)揮保護作用。

    綜上所述,長春西汀干預處理能夠降低小鼠腎IR后的炎癥和氧化損傷,保護腎功能,為臨床預防治療急性腎損傷提供了新思路。

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    10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.056

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    1672-9455(2015)09-1314-02

    2014-11-12

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