黎藥裸花紫珠在小鼠體內(nèi)止血活性部位的研究

易 博，張 旻，林 海，陳 濤，徐文彤，馮世秀（.解放軍87醫(yī)院藥劑科，海南?？?759；.深圳市中科院仙湖植物園，深圳市南亞熱帶植物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳58004；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌700）

黎藥裸花紫珠在小鼠體內(nèi)止血活性部位的研究

易 博1，張 旻2，3，林 海1，陳 濤2，徐文彤1，馮世秀2（1.解放軍187醫(yī)院藥劑科，海南?？?71159；2.深圳市中科院仙湖植物園，深圳市南亞熱帶植物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518004；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100）

目的確定黎藥裸花紫珠的止血活性部位，為其止血活性成分的研究提供依據(jù)。方法裸花紫珠經(jīng)醇提獲得醇提物（EtOH-extract）、醇提物經(jīng)大孔吸附樹脂處理分別獲得水洗脫物（HP-H2 O-elution）和乙醇洗脫物（HP-EtOH-elution），將EtOH-extract、HP-EtOH-elution和HP-H2 O-elution分別配制成高、中、低劑量的供試藥物，云南白藥為陽性對(duì)照。每日給小鼠灌胃1次，在連續(xù)給藥7 d后，記錄小鼠體質(zhì)量的變化，采用斷尾法和玻片法測(cè)定小鼠的出血時(shí)間和凝血時(shí)間，并以此為篩選指標(biāo)對(duì)各部位止血效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果與模型對(duì)照組相比，HP-EtOH-elution對(duì)縮短小鼠出血時(shí)間的作用效果顯著，并且其低劑量組和中劑量組的效果均優(yōu)于陽性對(duì)照組。EtOH-extract、HP-EtOH-elution和HP-H2 O-elution在縮短小鼠的凝血時(shí)間和增加小鼠的體質(zhì)量方面，效果均不顯著。結(jié)論裸花紫珠的止血活性成分主要集中在醇提物經(jīng)大孔樹脂處理后的乙醇洗脫部位，并且可能是通過影響內(nèi)源性凝血途徑發(fā)揮止血作用。

裸花紫珠；活性部位；出血時(shí)間；凝血時(shí)間；小鼠

裸花紫珠（Callicarpa nudif lora Hook et A rn）是馬鞭草科紫珠屬植物，別名紫珠草、止血草、賊仔葉白花茶等，為我國(guó)海南黎族同胞的習(xí)用藥材［1］。分布于海南、廣東、廣西等省，目前海南多地有大面積栽培種植，尤以海南五指山產(chǎn)的為上品。裸花紫珠主要取地上干燥部分入藥，具有止血消炎、散瘀消腫、解毒、祛風(fēng)濕之功效，民間主要用于治療創(chuàng)傷出血、呼吸道及消化道出血、化膿性炎癥等，外用治燒、燙傷及外傷出血［2，3］。我院前身之一解放軍162醫(yī)院在上世紀(jì)六七十年代已經(jīng)將裸花紫珠運(yùn)用于臨床，在燒、燙傷救治等方面取得良好效果［4，5］?，F(xiàn)代研究表明，裸花紫珠主要含有黃酮、鞣質(zhì)、萜類和酚類等成分［6-13］，其中總黃酮提取物具有抗血栓形成、降低全血黏度、抑制血小板凝集和抗炎等作用。目前市場(chǎng)上的裸花紫珠成藥主要為其水提物浸膏制成的片劑、膠囊等，在臨床應(yīng)用中，裸花紫珠片口服對(duì)肛腸病、鼻腔鼻竇、流產(chǎn)和上環(huán)等術(shù)后止血作用效果顯著［14，17］。然而，針對(duì)裸花紫珠不同溶劑提取部位的止血活性和止血機(jī)制卻鮮有報(bào)道。為了明確裸花紫珠止血活性的部位及效果，本研究以裸花紫珠地上部分的醇提物、醇提物經(jīng)大孔吸附樹脂處理后獲得的水洗脫物和醇洗脫物制備成供試藥物，經(jīng)小鼠灌胃給藥后，測(cè)定藥物對(duì)小鼠的止血作用及給藥期間小鼠體重的變化［18］。本研究最終將明確裸花紫珠止血作用的活性部位，為下一步止血活性成分和止血機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1試藥 裸花紫珠藥材（地上部位全株，于2013年4月采于海南省五指山，經(jīng)深圳市中科院仙湖植物園陳濤研究員鑒定，自然風(fēng)干備用）；云南白藥（4 g裝，云南白藥集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z53020798）；HP-20大孔吸附樹脂（日本三菱化工集團(tuán)）；其他試劑均為市售分析純。

1.2樣品制備 裸花紫珠1.0 kg，粉碎，經(jīng)70%乙醇于70℃水浴鍋回流提取3次，每次提取1 h，合并提取液并過濾，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮獲得醇提總浸膏（EtOH-extract 125.0 g）。取總浸膏80.0 g水溶解后經(jīng)大孔吸附樹脂柱處理，依次用水和95%乙醇洗脫，分別洗脫3個(gè)柱體積，合并洗脫液，減壓濃縮成浸膏狀，分別獲得HP-H2O-elution 26.0 g和HP-EtOH-elution 48.0 g。

EtOH-extract、HP-EtOH-elution和HP-H2O-elution浸膏冷凍干燥，各取10.0 g，用DMSO-蓖麻油（1∶1）配制成濃度為0.5 g／m l的儲(chǔ)備液；臨用前，以0.5%CMC-Na稀釋為相應(yīng)劑量濃度。

1.3動(dòng)物 昆明種SPF級(jí)KM小鼠，♀♂各半，體質(zhì)量（20±2）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)（大學(xué)城）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0020。飼養(yǎng)環(huán)境恒溫20℃，恒濕50%。飼料用60Co照射過，達(dá)SPF級(jí)。

2 方法

2.1對(duì)小鼠出血時(shí)間的影響 小鼠110只，♀♂各半，稱量體質(zhì)量，用苦味酸標(biāo)記［19］。按照給藥方案共分為模型對(duì)照組（0.5%CMC-Na）、陽性對(duì)照組（云南白藥，0.667 g／kg）以及EtOH-extract、HPEtOH-elution和HP-H2O-elution 3個(gè)給藥組，每個(gè)給藥組分低、中、高3個(gè)劑量組（0.5、1.0、2.0 g／kg），試驗(yàn)小鼠為每個(gè)劑量組10只，♀♂各半。采用灌胃法給藥1次／d，按小鼠體質(zhì)量計(jì)算灌胃量［20，21］：0.01 m l／（g?d），連續(xù)7 d，測(cè)定前再次記錄每只小鼠的體質(zhì)量。試驗(yàn)組在第7天給藥后1 h，采用斷尾法測(cè)定出血時(shí)間［21-23］。具體操作：剪去鼠尾5.0 mm，自血液流出時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔10 s用濾紙輕輕拭血1次，直到拭后不再出血為止。從開始出血至停止出血，記錄所用時(shí)間即為小鼠出血時(shí)間。

2.2對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響 分組及給藥情況同“2.1”項(xiàng)，末次給藥后1 h，選取玻片法測(cè)定凝血時(shí)間［23-25］。具體操作：采用眼眶取血法用眼科彎鑷迅速摘取一側(cè)眼球，在潔凈載玻片的兩端各滴1滴直徑為5～8 mm的血滴，立即計(jì)時(shí)［20］。每隔15 s用清潔大頭針自血滴邊緣向里輕輕撥動(dòng)1次，并觀察有無血絲（纖維蛋白絲）挑起［25］。從采血開始至挑起血絲，記錄所用時(shí)間即為小鼠凝血時(shí)間，另一滴血平行試驗(yàn)。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各組數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，檢驗(yàn)方差齊性，并進(jìn)行One-Way ANOVA分析差異的顯著性［26］，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。

3 結(jié)果

3.1裸花紫珠提取部位對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 給藥7 d后，計(jì)算給藥前后小鼠體質(zhì)量的變化。將EtOH-extract、HP-EtOH-elution和HP-H2O-elution低、中、高3個(gè)給藥濃度下小鼠體質(zhì)量的增加值與模型對(duì)照組體質(zhì)量增加值比較，各組小鼠體質(zhì)量的變化沒有明顯區(qū)別，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），呈平穩(wěn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

3.2裸花紫珠提取物對(duì)小鼠出血時(shí)間和凝血時(shí)間的影響

3.2.1 對(duì)小鼠出血時(shí)間的影響 與模型對(duì)照組比較，EtOH-extract中、高2個(gè)濃度對(duì)試驗(yàn)小鼠的出血時(shí)間無明顯影響（P＞0.05），低劑量組對(duì)其有一定的縮短作用（P＜0.05），但與陽性對(duì)照組比較均無顯著性差異（P＞0.05）。與模型組比較，HPEtOH-elution各劑量組可明顯縮短小鼠的出血時(shí)間，整體差異顯著，其中低、中劑量組的效果非常明顯（P＜0.001），高劑量組次之（P＝0.01）；并且低、中劑量組的出血時(shí)間均小于陽性對(duì)照組，其作用效果較陽性對(duì)照更為明顯（P＜0.05，P＝0.001）。與模型對(duì)照組比較，HP-H2 O-elution各劑量組也可不同程度地縮短小鼠的出血時(shí)間，其中中劑量組的出血時(shí)間縮短最為顯著（P＜0.001），相比較而言低劑量和高劑量組出血時(shí)間縮短程度較?。≒＜0.05）；與陽性對(duì)照組相比，只有中劑量組的出血時(shí)間有明顯的縮短（P＜0.01）。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

3.2.2 對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響 EtOH-extract、HP-EtOH-elution和HP-H2 O-elution低、中、高3個(gè)給藥濃度的凝血時(shí)間與模型組比較，均無顯著影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。僅陽性對(duì)照藥組比模型對(duì)照組凝血時(shí)間縮短較明顯（P＜0.05）。表明裸花紫珠各提取物對(duì)小鼠的凝血時(shí)間沒有顯著影響。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 裸花紫珠提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量、出血時(shí)間和凝血時(shí)間的影響（n＝10，ˉx±s）

4 討論

在上述止血活性試驗(yàn)中，出血時(shí)間（BT）是指穿破毛細(xì)血管，自出血到自然止血所需的時(shí)間，其止血時(shí)間長(zhǎng)短與毛細(xì)血管功能、組織收縮力、組織因子、血小板的數(shù)量和功能等因素相關(guān)，影響最大的是血小板和毛細(xì)血管功能，凝血因子次之；而凝血時(shí)間（CT）是指血液自離體至凝固所需的時(shí)間。血液離體后，接觸帶陰電荷的表面（玻璃器材）時(shí)，因子被激活，其后一系列凝血因子相繼活化，最后使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白而凝血，其時(shí)間的長(zhǎng)短主要與各種凝血因子的含量和凝血活性有關(guān)［26］。在藥物止血化瘀功效的研究中常以上述2個(gè)指標(biāo)作為考察對(duì)象，不僅常用于單味藥材提取物的止血或者活血活性部位的篩選，為進(jìn)一步明確相關(guān)活性成分及其作用機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)［9，25，26］，而且也多應(yīng)用于研究復(fù)方制劑和單一組分止血藥物的止血效果及有效劑量［24，27］。血液凝固可分為內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑，兩條途徑相互聯(lián)系，同時(shí)進(jìn)行［28］。在更為深入的止血機(jī)制研究中，還需結(jié)合血漿凝血酶原時(shí)間PT（用于檢測(cè)機(jī)體外源性凝血系統(tǒng)）和活化部分凝血活酶時(shí)間APTT（用于檢測(cè)機(jī)體內(nèi)源性凝血系統(tǒng)），用于開發(fā)安全有效的止血制劑和產(chǎn)品。

本研究的止血試驗(yàn)結(jié)果表明，裸花紫珠提取物有一定的止血作用，其中以大孔吸附樹脂處理后95%乙醇洗脫部位對(duì)出血時(shí)間的縮短作用最為明顯，其效果更是優(yōu)于陽性對(duì)照藥（云南白藥）；裸花紫珠提取物對(duì)凝血時(shí)間均無顯著影響。裸花紫珠70%乙醇提取物經(jīng)過大孔吸附樹脂柱處理，將提取物分為兩個(gè)部位，水洗脫物和醇洗脫物，其中水洗脫物主要是大分子的多糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸等水溶性成分，而醇洗脫物則主要集中了裸花紫珠的次生代謝產(chǎn)物，包括糖苷類成分［7，29］。由以上初步活性試驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，裸花紫珠止血的活性成分主要是其次生代謝產(chǎn)物，并且可以通過大孔吸附樹脂法進(jìn)行富集。結(jié)合前期文獻(xiàn)對(duì)裸花紫珠凝血途徑的研究，表明其化學(xué)成分可明顯縮短家兔活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT），由此推測(cè)提取物可能是通過影響內(nèi)源性凝血途徑來發(fā)揮止血作用［1，9］。因此，本研究明確了裸花紫珠止血作用的活性部位，推測(cè)可能是通過內(nèi)源性凝血途徑起效，并在低濃度下體內(nèi)無毒，為下一步分離和鑒定止血的有效成分提供了依據(jù)。

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Screening for the hemostatic active extractsof Callicarpa nudiflora，inmice in vivo

YIBo1，ZHANG M in2，3，LIN Hai1，CHEN Tao2，XU Wentong1，F(xiàn)ENG Shixiu2（1.Department of Pharmacy，No.187 Hospital of PLA，Haikou 571159，China；2.Key Laboratory of Southern Subtropical Plant Diversity，Shenzhen Fairy Lake Botanical Garden，Chinese Academy of Sciences，Shenzhen 518004，China；3.College of Life Science，Northwest A＆F University，Yangling 712100，China）

ObjectiveTo screen the hemostatic active extracts from Callicarpa nudif lora.MethodsThe powdered Callicarpa nudif lora was extracted w ith 70%EtOH and concentrated to give EtOH-extract.The EtOH-extract was further chromatographed over HP-20 macroporous resin column，eluting w ith aqua and 95%EtOH to get HP-H2O-elution and HPEtOH-elution，respectively.The obtained three extracts of EtOH-extrract，HP-EtOH-elution and HP-H2O-elution were set as large，middle and small dosage groups for drug preparation，respectively.Yunnan Baiyao was used as a positive control group.Theweight increment，bleeding time and clotting time of fed micewere detected by cutting tailand grass slidemethods after intragastric administration for 7 days.ResultsAs compared w ith blank model and positive control，each dosage groups of HPEtOH-elution could significantly shortened the bleeding time，ofwhich the small dosage group andmiddle dosage group even exhibited better results than the positive controlgroup.Whereas the EtOH-extract，HP-EtOH-elution and HP-H2O-elution didn′t demonstrated significanteffecton clotting time aswell as theweight increment.ConclusionThe HP-EtOH-elutionwas suggested to be themajor active extract possessing hemostatic activity tomice under tested dosages.The hemostaticmechanism may through intrinsic coagulation pathway.This study would be helpful for further phytochemical investigation of C.nudiflora.

Callicarpa nudif lora；active extracts；bleeding time；clotting time；m ice

R965

］ A

1006-0111（2015）03-0235-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.03.011

2013-10-27

2014-05-22

［本文編輯］ 陳 靜

2013年海南省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)基金資助（ZY201328）

易 博，博士，副主任藥師.研究方向：中藥現(xiàn)代制劑與醫(yī)院藥學(xué).Tel：0898）65920079；E-mail：boyicn＠126.com

徐文彤，副主任藥師.Tel：（0898）65920988；E-mail：yjk_187＠163.com