基于氣相色譜－質(zhì)譜技術(shù)對(duì)用咪康唑處理的白念珠菌的代謝組學(xué)研究

楊 宇，王 慧，曹穎瑛，朱臻宇（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，.藥物分析學(xué)教研室；.新藥研究中心，上海 200433）

隨著免疫功能低下患者的增加、器官移植等醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展以及免疫抑制劑的使用，真菌感染率居高不下，其中白念珠菌成為真菌感染的主要病原菌［1］。

咪康唑因生物利用度好和不良反應(yīng)少成為防治真菌感染的一線藥物。研究表明，咪康唑可通過(guò)影響過(guò)氧化物酶和線粒體而發(fā)揮抗真菌活性［2］。同時(shí)，咪康唑可增加活性氧使細(xì)胞死亡［3］。然而，目前咪康唑的作用機(jī)制尚不明確，因此研究其作用機(jī)制顯得尤為重要。

在生命系統(tǒng)中，代謝組能將基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的微小變化放大。因此，代謝組學(xué)能更直接地反應(yīng)生物體的功能變化。

筆者基于氣相色譜－質(zhì)譜（GC－MS）代謝組學(xué)技術(shù)，研究咪康唑給藥前后白念珠菌的代謝特征譜，結(jié)合藥物作用機(jī)制，探討代謝物產(chǎn)生差異的原因，為闡明藥物作用機(jī)制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo Trace Ultra／DSQⅡGC－MS（美國(guó)賽默飛公司）；微型漩渦混合儀（美國(guó)賽默飛公司）；－80℃低溫冰箱（美國(guó)賽默飛公司）；凍干機(jī)（美國(guó)Virtis公司）；MJx型智能霉菌培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）。

1.2 試劑 甲氧基胺鹽酸鹽、N－甲基－N－（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA）、吡啶、三甲基氯硅烷（TMCS）、咪康唑均購(gòu)自Sigma公司；正庚烷（上海晶純實(shí)業(yè)公司）。

1.3 菌株和培養(yǎng)基 白念珠菌SC5314；YPD培養(yǎng)液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，溶解于1 000ml三蒸水，高壓滅菌（121 ℃，15min），4 ℃保存。

2 方法

2.1 真菌培養(yǎng)

2.1.1 咪康唑半數(shù)抑菌濃度（IC50）的確定 挑取白念珠菌單克隆，接種至1ml YPD培養(yǎng)液，于30℃，200r／min培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)后期，于紫外分光光度計(jì)600nm［4］下測(cè)菌液光密度（D）值，用 YPD培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至D值為0.1，取20ml加入各錐形瓶中培養(yǎng)，至D值為0.2時(shí)，給藥組中加入咪康唑，使其終濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32、64μg／ml，繼續(xù)培養(yǎng)（對(duì)照組中加入相同體積的二甲基亞砜，其濃度應(yīng)小于0.05%，以確保不影響白念珠菌的生長(zhǎng)），分別在3、4、5、6h測(cè)定各組的D值。與對(duì)照組的D值相比，選擇繼續(xù)培養(yǎng)4h，其中咪康唑的IC50為16μg／ml。

2.1.2 培養(yǎng)條件 按照IC50的測(cè)定方法和給藥濃度，培養(yǎng)給藥組和對(duì)照組各6份。

2.2 樣品前處理

2.2.1 樣品淬滅 向樣品中加入等體積的60%甲醇（預(yù)冷至－20 ℃），迅速搖勻，靜置5min（－40℃），6 000r／min離心。

2.2.2 樣品提取 樣品用超純水迅速清洗后，重懸于1ml沸水（含10μl 200mmol／L的α－氨基丁酸內(nèi)標(biāo)）［4］，靜置15min，放入 －80 ℃ 冰箱冰 凍15min，取出，60℃水浴溶解15min，再重復(fù)凍融操作2次，13 200r／min離心，取上清液，放置在－20℃冰箱預(yù)凍。后置于凍干機(jī)中凍干，獲得凍干粉。

2.2.3 衍生化 向凍干粉中加入75μl甲氧基胺鹽酸鹽／吡啶溶液，40℃溫孵90min，再加入75μl MSTFA 溶液 （1%TMCS），40 ℃ 溫孵 50min，13 200r／min離心，取上清液，裝入進(jìn)樣小瓶。

2.2.4 菌體干重的測(cè)定 將樣品沉淀在室溫下風(fēng)干至恒重，稱(chēng)樣品干重，至少稱(chēng)量3次以確保樣品完全干燥。

2.3 GC－MS條件 毛細(xì)管柱：HP－5MS石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：260℃；升溫程序：起始溫度為70℃，保持3min，4℃／min升至220℃，再8℃／min升至310℃，保持10min，圖譜從第7.6分鐘開(kāi)始采集；載氣：高純氮?dú)?；流速?.0ml／min。進(jìn)樣量為1μl。

電子轟擊源（EI）；離子源溫度：200℃；接口溫度：280℃；電子能量：70eV；調(diào)諧方式：標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧；質(zhì)譜掃描方式：掃描范圍15～800amu，掃描速度5s／dec。

2.4 數(shù)據(jù)處理 將原始數(shù)據(jù)（.RAW）經(jīng)Xculibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)轉(zhuǎn)化成CDF格式，利用XCMS軟件對(duì)數(shù)據(jù)峰校正和峰積分，并采用 MATLAB 7.0（The MathWorks，Inc.，USA）過(guò)濾離子峰，留下相同保留時(shí)間下峰度最大的離子峰。為校正質(zhì)譜響應(yīng)，每個(gè)樣品的各個(gè)峰面積先除以各自的細(xì)胞干重，再除以內(nèi)標(biāo)衍生化后峰度最大的離子峰。利用SIMCA－P V 11.0（Umetrics，Sweden）軟件將數(shù)據(jù)中心化和帕累托變換，標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法（PLS－DA）分析，根據(jù)variable influence in the projection（VIP）值來(lái)預(yù)測(cè)代謝物對(duì)模型的貢獻(xiàn)程度。VIP＞1的數(shù)據(jù)對(duì)模型有明顯貢獻(xiàn)。接著對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，保留P＜0.01的數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)與NIST數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，并用標(biāo)準(zhǔn)品定位，得到潛在的生物標(biāo)志物。

3 結(jié)果

3.1 GC－MS色譜圖 給藥組和對(duì)照組白念珠菌的胞內(nèi)代謝物，經(jīng)提取，衍生化后進(jìn)樣分析，其GC－MS色譜圖，如圖1所示。

圖1 給藥組和對(duì)照組的GC－MS色譜圖

3.2 PCA與PLS－DA結(jié)果 數(shù)據(jù)校正后，對(duì)給藥組和對(duì)照組進(jìn)行PCA和PLS－DA分析，如圖2A和2B所示，結(jié)果表明兩組明顯分開(kāi)。其載荷圖和S－plot圖，如圖2C和2D所示。載荷圖用于潛在生物標(biāo)志物的篩選，根據(jù)載荷圖所示，離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的離子對(duì)分類(lèi)貢獻(xiàn)越大。得到23個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，給藥組和對(duì)照組代謝物含量變化見(jiàn)圖3。

4 討論

根據(jù)給藥組和對(duì)照組的差異代謝物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別討論如下：

4.1 葡萄糖 給藥組與對(duì)照組相比，葡萄糖含量顯著升高。研究表明咪康唑通過(guò)影響線粒體ATP酶和鉀離子泵而發(fā)揮抗真菌活性［5］，其中鉀離子泵是主動(dòng)運(yùn)輸，消耗能量，而葡萄糖可產(chǎn)生能量。因此，葡萄糖含量的升高可能與咪康唑作用鉀離子通道有關(guān)。

圖2 給藥組和對(duì)照組的主成分分析圖（A）、偏最小二乘法得分圖（B）、載荷圖（C）和S－plot圖（D）

圖3 給藥組和對(duì)照組的差異代謝物柱狀圖

4.2 海藻糖 白念珠菌受到外界刺激時(shí)會(huì)采取保護(hù)性防御機(jī)制，其中氧化應(yīng)激刺激細(xì)胞內(nèi)非還原性二糖海藻糖明顯增加［6］。在本實(shí)驗(yàn)中，咪康唑可能是一種氧化應(yīng)激，給藥后使細(xì)胞內(nèi)海藻糖大量積累，從而起到抗氧化的作用。

4.3 三羧酸循環(huán)相關(guān)代謝物 三羧酸循環(huán)不僅是需氧生物體重要的代謝途徑，還是糖類(lèi)、脂質(zhì)和氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐。酸刺激下，胞外谷氨酸通過(guò)反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（GadT）轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)，在谷氨酸脫羧酶的作用下生成γ－氨基丁酸（GABA），該反應(yīng)消耗氫離子，使胞內(nèi)pH值升高。進(jìn)而GABA通過(guò)GABA支路在GABA／α－酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下脫氨基形成琥珀酸半醛（SSA），SSA在琥珀酸半醛脫羧酶的作用下生成琥珀酸，進(jìn)而影響三羧酸循環(huán)［7］，同時(shí)GABA支路可降低細(xì)胞內(nèi)活性氧［8］。這與前期的研究結(jié)果相符［9］。由此可知，三羧酸循環(huán)中琥珀酸和檸檬酸含量的降低可能與咪康唑影響GABA支路有關(guān)。

4.4 2－羥基戊二酸（2－HG） 研究表明，2－HG脫氫酶活性降低導(dǎo)致2－HG大量積累，而2－HG脫氫酶可降低DNA和組蛋白的甲基化，從而抑制正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化［10］。因此，咪康唑給藥組2－HG的大量積累可能與2－HG脫氫酶活性降低有關(guān)，從而促進(jìn)正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

4.5 氨基酸類(lèi) 天冬酰胺、天冬氨酸、酪氨酸在給藥組中含量升高。其中，酪氨酸磷酸化參與細(xì)胞信息傳遞，因此酪氨酸的增加可能與細(xì)胞信息傳遞有關(guān)。天冬氨酸和天冬酰胺可合成多種氨基酸。有研究表明，蘇氨酸生物合成中間體β－天冬氨酸半醛（ASA）的積累對(duì)細(xì)胞有一定的損傷作用，同時(shí)可加速Gcn4的降解，Gcn4可調(diào)控多種氨基酸和維生素的生物合成［11］。因此丙氨酸、二甲基甘氨酸、纈氨酸、蘇氨酸和甘氨酸含量的降低與咪康唑促使ASA積累有關(guān)。

4.6 磷酸、磷酸甘油、甘油類(lèi) 磷脂是細(xì)胞膜的重要組成部分。Pasrija等［12］報(bào)道藥物外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白傾向定位于細(xì)胞膜。因此，咪康唑可能通過(guò)影響細(xì)胞膜而導(dǎo)致藥物外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性降低，使細(xì)胞內(nèi)的藥物積累而發(fā)揮治療作用。

本實(shí)驗(yàn)基于GC－MS的代謝組學(xué)方法對(duì)咪康唑給藥前后白念珠菌的代謝物進(jìn)行研究，經(jīng)比較分析，得到23個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，它們主要參與了氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、氧化應(yīng)激、糖酵解和磷脂代謝等相關(guān)通路，對(duì)咪康唑抗真菌作用機(jī)制的闡明具有重要意義。

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