HPLC法測定補(bǔ)腎活血止痛丸中阿魏酸的含量

夏方亮

（濱州市食品藥品檢驗檢測中心，山東濱州256618）

HPLC法測定補(bǔ)腎活血止痛丸中阿魏酸的含量

夏方亮

（濱州市食品藥品檢驗檢測中心，山東濱州256618）

目的建立高效液相色譜法測定補(bǔ)腎活血止痛丸中阿魏酸的含量測定方法。方法用C18柱為固定相，以乙腈－0.085%磷酸溶液（14∶86）為流動相，檢測波長為316 nm。結(jié)果阿魏酸進(jìn)樣量在0.020 49～0.204 9μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r＝1（n＝7），其平均回收率（n＝6）為99.83%。方法的檢測限LOD為0.307 3 ng，定量限LOQ為1.024 3 ng。結(jié)論此方法可靠、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)。

補(bǔ)腎活血止痛丸；阿魏酸；高效液相色譜法

補(bǔ)腎活血止痛丸由濱州市中醫(yī)院配制，具補(bǔ)肝腎、活血、祛瘀和止痛之功效，用于頸、肩、腰、腿痛經(jīng)久不愈及緩解期。本品處方中有當(dāng)歸、川芎等18味藥材，而原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒有含量測定項，藥品質(zhì)量不能得到有效控制，本文采用高效液相色譜（HPLC）法測定當(dāng)歸和川芎中阿魏酸的含量，具有較高的準(zhǔn)確性，可作為該制劑的含量測定方法。

1 儀器與試藥

島津LC－20AT高效液相色譜儀；Prominence SPD－20A／UV－VIS檢測器；補(bǔ)腎活血止痛丸（濱州市中醫(yī)院，批號：20130716、20130813、20130919）；阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110773－201313，含量以99.6%計，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h以上后使用）；甲醇和乙腈（色譜純，美國Tedia公司），其余試劑為分析純；純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Thermo BDS Hypersil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈－0.085%磷酸溶液（14∶86）為流動相；檢測波長為316 nm［1～5］。柱溫：35℃，流速：1.0 mL·min－1。理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計算不低于3 000，阿魏酸峰與相鄰峰的分離度應(yīng)符合要求。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品25.71 mg，置25 mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液（濃度為1.024 3 mg·mL－1）。再精密量取上述對照品儲備液1 mL，置100 mL棕色量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（濃度為0.010 243 mg·mL－1）。

2.3 供試品溶液的制備 取本品研細(xì)，取細(xì)粉約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.4 陰性空白溶液的制備 取缺當(dāng)歸和川芎的處方量，按照制法項制備陰性樣品，按“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備陰性空白溶液。

照“2.1”項下色譜條件，分別精密量取對照品溶液、供試品溶液和陰性空白溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，色譜圖見圖1。結(jié)果表明：理論板數(shù)按阿魏酸峰計算為15 026，阿魏酸峰與相鄰峰分離度符合要求。

圖1 補(bǔ)腎活血止痛丸阿魏酸含量測定HPLC圖譜A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性空白溶液

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2”項下的對照品溶液（濃度為0.010 243 mg·mL－1）2、4、8、10、14、16、20μL注入液相色譜儀，分別測定峰面積。以阿魏酸對照品的進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y＝5 108 890X－5 003（r＝1）。結(jié)果表明，阿魏酸進(jìn)樣量在0.020 49～0.204 9μg之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 精密量取“2.2”項下的阿魏酸對照品溶液（濃度為0.010 243 mg·mL－1）10μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測其峰面積，RSD為0.44%。結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.7 溶液的穩(wěn)定性試驗 取“2.3”項下制備的供試品溶液，精密量取10μL，注入液相色譜儀，避光條件下每隔4 h進(jìn)樣1次，測定阿魏酸的峰面積，共考察24 h，峰面積RSD為0.92%。結(jié)果表明，避光條件下，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗 取樣品（批號：20130716），按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法，平行制備6份樣品溶液，按上述方法和條件進(jìn)行測定，計算每份樣品阿魏酸的含量（mg·g－1），RSD為1.2%。結(jié)果表明，本品含量測定方法的重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取已測知含量的補(bǔ)腎活血止痛丸（批號：20130716，阿魏酸含量為0.063 4 mg·g－1）約1.5 g，精密稱定，共取6份，置25 mL量瓶中，在每一份樣品中精密加入阿魏酸對照品溶液10 mL（濃度為0.010 243 mg·mL－1），加70%甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按上述測定方法進(jìn)行測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 阿魏酸加樣回收率試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明，阿魏酸用該測定方法回收率良好。

2.10 樣品測定 按“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，以“2.2”項下溶液作為對照品溶液，測定3批樣品中阿魏酸的含量，測定結(jié)果見表2。

表2 補(bǔ)腎活血止痛丸阿魏酸含量測定結(jié)果

2.11 檢測限LOD與定量限LOQ 取“2.2”項下對照品溶液，逐級減少進(jìn)樣量，以信噪比為3∶1時，計算檢測限；以信噪比為10∶1時，計算定量限。結(jié)果為：檢測限LOD＝0.307 3 ng，定量限LOQ＝1.024 3 ng。

3 討論

3.1 阿魏酸溶液在光照條件下穩(wěn)定性差，很快分解，反映在液相色譜上有2個峰，試驗中應(yīng)采用棕色量瓶并避光，對照品溶液應(yīng)臨用新配。

3.2 在制備供試品溶液時，本文考察了不同提取方法（超聲和回流）［6，7］、不同提取溶劑［甲醇、70%甲醇和乙醇∶水（1∶3）］［8～11］、不同提取時間（15、30和45 min）和不同取樣量（2.0、3.0、4.0 g）等條件下，樣品中阿魏酸的含量測定結(jié)果。

試驗表明，阿魏酸采用超聲提取30 min與回流提取1 h所測得結(jié)果沒有顯著性差異；采用70%甲醇提取所測樣品中阿魏酸的含量較高；超聲提取15 min測得阿魏酸含量偏低，30 min和45 min阿魏酸的含量測定結(jié)果沒有顯著差異；3種取樣量所測得的含量結(jié)果無顯著性差異。綜合考察試驗結(jié)果后確定了“2.3”項下供試品溶液的制備方法。

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Determ ination of ferulic acid in Bushen Huoxue Zhitong Pills by HPLC

XIA Fang-liang
（Binzhou Food and Drug Inspection and Testing Center，Binzhou 256618，China）

ObjectiveTo establish a method for the determination of ferulic acid in Bushen Huoxue Zhitong Pills by HPLC.MethodsThe C18column was used，themobile phase was consisted of acetonitrile－0.085%phosphoric acid（14∶86），and the detection wavelength was 316 nm.ResultsThe standard curves of ferulic acid was linear in range of 0.020 49～0.204 9μg，r＝1（n＝7），and the average recovery was 99.83%（n＝6）.The limit of detection was 0.307 3 ng and the limit of quantification was 1.024 3 ng.ConclusionThemethod was reliable，accurate and specific.

Bushen Huoxue Zhitong Pills；Ferulic acid；HPLC

R927.2

A

2095－5375（2015）08－0447－003

夏方亮，男，研究方向：藥品質(zhì)量研究，E－mail：xiafl1980＠126.com