白藜蘆醇抑制結腸癌細胞系HT－29體外增殖作用的研究

王金英，秦蜜蜜，韓影影，張 燕，曹 璋

（1.濱州醫(yī)學院病理學教研室，山東濱州256603；2.東營市人民醫(yī)院藥劑科，山東東營257091）

白藜蘆醇抑制結腸癌細胞系HT－29體外增殖作用的研究

王金英1，2，秦蜜蜜1，韓影影1，張 燕1，曹 璋1

（1.濱州醫(yī)學院病理學教研室，山東濱州256603；2.東營市人民醫(yī)院藥劑科，山東東營257091）

目的通過觀察白藜蘆醇對結腸癌細胞系HT－29增殖的影響并檢測程序性細胞死亡4蛋白表達水平，探討白藜蘆醇的抗結腸癌增殖作用及部分相關機制。方法HT－29細胞經不同濃度白藜蘆醇作用后，流式細胞術檢測細胞周期分布及凋亡情況，Western blot法檢測程序性細胞死亡4蛋白表達水平變化。結果不同濃度的白藜蘆醇對HT－29細胞的增殖有抑制作用，并且呈現出一定的劑量依賴性（P＜0.01），白藜蘆醇改變細胞周期分布，細胞周期阻滯在S期，同時誘導HT－29細胞凋亡，試驗組與空白對照組相比，S期細胞比例及凋亡率明顯增高（P＜0.05），細胞周期被阻滯，增殖抑制。白藜蘆醇處理后HT－29細胞程序性細胞死亡4蛋白表達水平上調，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論白藜蘆醇能夠顯著抑制HT－29細胞株的增殖，細胞周期阻滯于S期，誘導腫瘤細胞凋亡，其腫瘤抑制作用可能與程序性細胞死亡4蛋白表達上調有關。

白藜蘆醇；HT－29；細胞增殖；程序性細胞死亡4

結直腸癌已經成為我國最常見的九大惡性腫瘤之一。隨著對結直腸癌的研究，認為結直腸癌發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多階段的過程，在這一復雜的過程中受到多個基因的調控［1，2］。目前在臨床治療中，主要運用手術和放化療的方案，但是預后往往較差。我國中醫(yī)藥資源豐富，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥中尋找抗腫瘤成分將有助于改善結直腸化療療效，提高腫瘤的綜合療效。

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是從植物毛葉黎蘆的根部分離得到的一種重要的植物抗毒素，它是一種對植物本身具有保護作用的多酚類物質［3］。具有保護心血管、抗氧化、抗自由基、抗癌等多種生物學效應，可以預防和緩解包括腫瘤在內的許多疾?。?～7］。程序性細胞死亡4（Programmed cell death4，PDCD4）基因在細胞發(fā)生程序性死亡過程時誘導產生，是在小鼠體內研究時發(fā)現的與細胞凋亡相關的基因，人的PDCD4基因定位于10q24，但是其功能尚未很好的明確［8～11］。

本研究觀察不同濃度的白藜蘆醇對結腸癌細胞系HT－29的影響，檢測細胞周期分布、增殖抑制情況及PDCD4的表達變化，以探討白藜蘆醇對結腸癌的抗癌作用及相關機制。

1 材料和方法

1.1 材料 結腸癌細胞系HT－29（上海生命科學院細胞和生物化學研究所）；白藜蘆醇（美國Sigma公司）；L15培養(yǎng)液（美國Gibicob公司）；二甲基亞砜（DMSO）（美國Biomol公司）；四甲基偶氮唑藍（美國Sigma公司）；兔抗人PDCD4單克隆體（Epitomics公司）；HRP標記的山羊抗兔二抗（北京中杉公司）；CCK－8試劑盒（日本Dojindo公司）；兔抗人β－Actin多克隆抗體（北京中杉公司）；化學發(fā)光試劑（Western Blotting Luminol Reagent，美國Santa Cruz）；蛋白質分子量標準（華美生物工程公司）；X－光片（柯達公司）；定影液、顯影液（碧云天生物科技公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) HT－29細胞用L15培養(yǎng)液（含10%的胎牛血清，100 U·mL－1鏈霉素，100 U·mL－1青霉素）在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，用0.25%胰酶－EDTA消化傳代。

1.3 CCK－8法檢測 取對數生長期細胞，按照5 ×104／孔接種于96孔板上，培養(yǎng)12 h，細胞貼壁生長后，按照不同濃度梯度30、60、120μmol·L－1加入白藜蘆醇（試驗組），空白組加入等體積的培養(yǎng)基，對照組加入含DMSO的等體積培養(yǎng)基。分別設24、48 h作為試驗終止時間點。不同濃度的白藜蘆醇作用不同時間后的HT－29細胞培養(yǎng)液中加入20 μg·L－1CCK－8試劑（5 g·L－1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液后置于空氣振蕩器上振蕩10 min，以酶標儀測定光密度值（D450nm），計算細胞增殖抑制率。

細胞增殖抑制率（%）＝（1－Res作用細胞D450nm／對照細胞D450nm）×100%

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期分布情況 加入白藜蘆醇的HT－29細胞和未經白藜蘆醇處理的HT－29細胞培養(yǎng)24 h，體積分數為0.25%胰酶消化、中和、離心、收集細胞。以PBS清洗3遍后，加入75%乙醇（冷）2 mL中固定，放置冰箱中，在4℃條件下過夜；再將細胞密度調整為5×105～1×106·L－1，PBS重懸2次后加PI染液1 mL，避光放置15 min，最后用流式細胞儀檢測。用CellQuent軟件對結果進行數據分析，分別讀取試驗組（120μmol·L－1白藜蘆醇）和對照組（未加白藜蘆醇）G0／G1期、S期和G2／M期細胞的百分比，上述試驗至少重復3次，并取平均數進行統(tǒng)計分析。

1.5 Western blot法檢測細胞PDCD4蛋白表達水平 取對數生長期的HT－29細胞，加入不同濃度的白藜蘆醇培養(yǎng)24 h后用細胞刮尺收集細胞，裂解后再對細胞的總蛋白質進行提取，采用BCA法測定各組細胞蛋白濃度。取總蛋白量為30μg的蛋白裂解液經SDS－PAGE恒壓電泳150 V，90 min后轉移到硝酸纖維素膜上，用TBST清洗3次，加入兔抗人PDCD4抗體（1∶2 000）、GAPDH抗體（1∶4 000），4℃過夜；HRP標記的山羊抗兔的抗體為二抗，室溫孵育3 h。通過凝膠成像分析系統(tǒng)掃描成像，圖像分析軟件Bandscan 5.0掃描雜交條帶的相對光密度值獲得PDCD4蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 不同濃度白藜蘆醇對結腸癌細胞系HT－29增殖抑制的影響 CCK－8試驗結果顯示在經不同濃度的白藜蘆醇作用24、48 h后，HT－29細胞增殖受到抑制，并且這種抑制作用具有劑量依賴性。同一時間點各實驗組OD值與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），結果見表1。

表1 不同濃度白藜蘆醇對HT－29細胞系的抑制率（%）

2.2 白藜蘆醇對細胞周期分布及凋亡的影響 白藜蘆醇處理后24 h，能誘導HT－29細胞產生凋亡，并呈劑量依賴性。與空白對照組比較，細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結果見表2、圖1。

2.3 白藜蘆醇對HT－29細胞PDCD4蛋白表達的影響 與空白對照組比較，不同濃度白藜蘆醇作用HT－29細胞24 h后，PDCD4蛋白的表達增加，且隨著藥物濃度增加有明顯增強的趨勢，見圖2。

表2 白藜蘆醇對結腸癌細胞系HT－29作用24 h后細胞周期比較

圖1 白藜蘆醇對HT－29細胞周期分布的影響

圖2 白藜蘆醇對PDCD4蛋白表達水平的影響

3 討論

結腸癌是嚴重危害人類健康的主要惡性腫瘤之一，結腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個復雜的過程，受多種因素影響，且過程涉及多個環(huán)節(jié)的復雜轉變。它包括多種細胞信號轉導通路的異常、癌基因的激活以及腫瘤抑制基因的失活。

我國中草藥資源豐富，從天然產物中尋找抗腫瘤活性成分是抗腫瘤藥物研發(fā)的重要途徑之一。臨床廣泛應用的一些抗腫瘤藥物都是從這一途徑獲得，如來源于植物的紫杉醇、喜樹堿、鬼臼毒素及長春新堿等抗腫瘤藥物已經被批準上市并獲得了肯定的效果。白藜蘆醇是葡萄和紅酒中的一種備受關注的天然產物，之前的研究發(fā)現這種酚類衍生物在糖尿病及肥胖癥的預防、改善方面可能發(fā)揮了重要作用。近年來其抗癌作用備受關注，對癌癥的起始、促進、發(fā)展3個階段均有明顯的抑制作用。

本試驗結果顯示，白藜蘆醇可以抑制結腸癌細胞系HT－29的增殖，且抑制作用呈現一定的劑量和時間依賴性。在細胞周期分布上，經白藜蘆醇作用后的結腸癌細胞系HT－29主要阻滯在S期及G2期。白藜蘆醇通過影響相關的周期素依賴激酶、蛋白激酶、抑制因子的活性來對正常細胞周期的運行產生干擾，使結腸癌細胞發(fā)生G2期和S期阻滯。有研究報道腸癌細胞HCT－116經白藜蘆醇作用后，出現線粒體膜破裂以及細胞凋亡，但是細胞的線粒體膜破裂出現較晚，凋亡幅度也小，這說明還可通過使得家族非依賴性線粒體損傷而誘導腫瘤細胞的凋亡［10］。也有研究顯示白藜蘆醇是通過抑制p34（CDC2）激酶和CDK7激酶實現G2期的阻滯［11］。白藜蘆醇可以通過抑制CDK2和CDK4活性，使得CyclinD1和p21的表達顯著增加，使多種腫瘤細胞停止于S期［12］。本研究對HT－29細胞用不同濃度的白藜蘆醇干預后，從細胞周期的分布結果來看，HT－29細胞主要阻滯在S期，抑制了DNA合成，從而抑制HT－29細胞的生長，研究結果與上述報道基本一致。

細胞凋亡是多細胞生物中去除體內異常的或者不需要的細胞的一種基本生物學現象，在生物體的進化、內環(huán)境的穩(wěn)定中起著重要的作用，具有重要的生物學意義，其調控機制也是一復雜的分子生物學機制。本研究結果顯示，對HT－29細胞用不同濃度的白藜蘆醇干預后，可以誘導HT－29細胞產生凋亡，研究結果與其他實驗室研究結果相近，Delmas等［9～12］報道白藜蘆醇具有通過caspase激活而促進人結腸癌細胞SW480誘導凋亡。凋亡是多基因嚴格控制的過程，程序性細胞死亡4基因與細胞凋亡有關的基因，在細胞發(fā)生程序性死亡時誘導產生。PDCD4在轉錄和翻譯水平調控多個與腫瘤進展、細胞周期和細胞分化相關的蛋白的表達。PDCD4可引起AP－1轉錄活性的降低以及誘導p21／Cip1的表達，從而降低細胞的增殖。本試驗結果顯示，經不同濃度的白藜蘆醇處理后，HT－29細胞PDCD4蛋白表達水平上調，且具有劑量依賴性，與對照組比較，有統(tǒng)計學意義。白藜蘆醇能夠顯著抑制HT－29細胞株的增殖，誘導凋亡，其作用機制可能與PDCD4蛋白表達上調有關。我們以前的結果顯示，白藜蘆醇通過miRNA－21調節(jié)PDCD4轉錄后水平，白藜蘆醇處理后PDCD4蛋白的表達增加可能與miRNA－21的下調相關［13］。

本試驗結果進一步驗證了白藜蘆醇抗結腸癌的作用及部分的機制，為結腸癌治療提供了理論依據。

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Effects and mechanisms of resveratrol on proliferation in human colonic adenocarcinoma cell line HT－29

ObjectiveTo evaluate the effect and mechanism of resveratrol inhibiting proliferation and inducing apoptosis on human colon cancer cells HT－29.MethodsThe proliferation ofhuman colon cancer line HT－29 wasmeasured by CCK－8 assay.Cell cycle and apoptosisweremeasured using Flow cytometer（FCM）.Western blotting was used to detect PDCD4 protein expression.ResultsDifferent concentrations of resveratrol on cell growth was inhibited in a dose－dependentmanner.The effect on cycle distribution and appotosis were significance difference（P＜0.05）.There was significant difference of the expression of PDCD4 on HT－29 cells before it treated by resveratrol and after that（P＜0.01）.ConclusionResveratrol could inhibite the proliferation，and induce cell cycle arrestand appotosis of HT－29 cell line，whichmay be related to overexpression of PDCD4 on HT－29 cells.

Resveratrol；HT－29；Cell proliferation；PDCD4

R285.5

A

2095－5375（2015）08－0439－003

WANG Jin-ying1，2，QIN Mi-mi1，HAN Ying-ying1，ZHANG Yan1，CAO Zhang1

（1．Department of Pathology，Binzhou Medical University，Binzhou 256603，China；2．Department of Pharmacy，Dongying People′s Hospital，Dongying 257091，China）

山東省自然科學基金（No.ZR2011HQ025、No.ZR2012HL32）；濱州醫(yī)學院科研啟動基金項目（No.BY2010KYQD10）

王金英，女，副主任藥師，研究方向：臨床藥學，E－mail：dywjy9909＠163.com

曹璋，男，博士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：病理學，Tel：0543－3258654，E－mail：2438747821＠qq.com