激活小膠質細胞α7－nAChR減少Aβ蛋白所致的神經(jīng)元毒性的研究

雷露雯，李偉煊，馮智敏，鄧 沖，陳 翔

（南方醫(yī)科大學附屬南海區(qū)人民醫(yī)院，廣東佛山528000）

·實驗研究·

激活小膠質細胞α7－nAChR減少Aβ蛋白所致的神經(jīng)元毒性的研究

雷露雯，李偉煊，馮智敏，鄧 沖，陳 翔

（南方醫(yī)科大學附屬南海區(qū)人民醫(yī)院，廣東佛山528000）

目的研究激活小膠質細胞上的α7－煙堿型乙酰膽堿受體對減少由于β－淀粉樣蛋白1－42沉積所致的慢性炎性反應對神經(jīng)元毒性作用。方法取孕18 d的胎鼠大腦皮質做原代神經(jīng)元的培養(yǎng)，選用微管相關蛋白－2與神經(jīng)元特異性烯醇化酶作為神經(jīng)元特異性標志物，用免疫細胞化學技術對神經(jīng)元進行鑒定。培養(yǎng)10 d的神經(jīng)元與小膠質細胞共同培養(yǎng)于帶有膜插件的培養(yǎng)皿中。試驗分空白對照組、β－淀粉樣蛋白組、共培養(yǎng)組、煙堿預處理組，各組添加β－淀粉樣蛋白1－42共培養(yǎng)96 h后，用流式細胞儀及免疫熒光法檢測神經(jīng)元的凋亡率。結果體外培養(yǎng)10 d的神經(jīng)元，用免疫熒光及DAB顯色鑒定神經(jīng)元均能顯色，細胞純度達到了94.49%。激活組與未激活組相比神經(jīng)元的凋亡率明顯下降（P＜0.05）。結論激活小膠質細胞上的α7－煙堿型乙酰膽堿受體能減少β－淀粉樣蛋白介導的神經(jīng)元凋亡，對神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用。

α7－煙堿型乙酰膽堿受體；神經(jīng)元；免疫細胞化學；細胞凋亡

Aβ蛋白沉積所致的慢性炎癥與阿爾茨海默病（AD）的發(fā)病有密切的關聯(lián)［1］?，F(xiàn)有研究表明外周迷走神經(jīng)釋放的遞質可以激活巨噬細胞α7－煙堿型乙酰膽堿受體（α7－nAChR），減少炎性介質的分泌，從而抑制外周炎性反應［2，3］。本試驗利用帶膜插件的培養(yǎng)皿將神經(jīng)元與小膠質細胞共同培養(yǎng)，然后利用β－淀粉樣蛋白1－42（Aβ1－42）作用于小膠質細胞產(chǎn)生炎性因子的方法誘導離體培養(yǎng)的神經(jīng)元損傷模型的建立，觀察激活小膠質細胞上的α7－nAChR對神經(jīng)元凋亡的影響，評價α7－nAChR對神經(jīng)元損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 懷孕18 d的SD大鼠（南方醫(yī)科大學實驗動物中心，動物合格證號：粵監(jiān)證字2006B023）；DMEM／F12高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司）；新生牛血清、胎牛血清、羊血清、胰蛋白酶／EDTA（Gibico公司）；L－谷氨酰胺、多聚賴氨酸、煙堿、Aβ1－42（Sigma公司）；小鼠抗大鼠MAP－2單克隆抗體（Abcom公司）；熒光標記二抗（Calbiochem公司）；神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體和SP免疫組化試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司）；Fluorescein FragELTM DNA Fragmentation Detection Kit（Merker公司）。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)元的分離培養(yǎng) 將SPF級孕18 d的SD大鼠麻醉。無菌方法取出胎鼠放入盛有DHanks液的無菌燒杯。用75%的酒精消毒后，取出胎鼠的大腦皮質，去除腦膜，然后剪碎，放于37℃的孵箱中用0.25%的胰酶消化10 min。最后用加有血清的完全培養(yǎng)基終止消化，將細胞混懸液置于離心機中，按1 000 rpm的速度離心，棄上清，加入含20%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基懸浮細胞，轉移至已包被好的細胞培養(yǎng)皿中，放入孵箱中培養(yǎng)，第2天換用含有神經(jīng)營養(yǎng)因子B27，但沒有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后3 d換液1次。

1.2.2 皮質神經(jīng)元的鑒定 首先采用免疫熒光的方法對培養(yǎng)于蓋玻片上第10天的神經(jīng)元進行鑒定。具體操作如下：用0.01 mol·L－1PBS充分洗滌，然后用多聚甲醛于室溫下固定30 min，PBS液清洗；加0.3%的Triton－100于室溫下放置30 min；最后加10%羊血清放在37℃的孵箱中封閉30 min。加入以1∶250稀釋的MAP－2單克隆抗體，放于4℃的冰箱中，48 h后用PBS液清洗，再加DEXAS紅色熒光標記的IgG二抗，避光、37℃1～2 h。用Hoechst 33258染細胞核。在高倍顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)陽性細胞的個數(shù)，取其均值作為陽性神經(jīng)元的百分率。

然后采用DAB顯色方法對原代培養(yǎng)的神經(jīng)元進行鑒定，以NSE多克隆抗體作為神經(jīng)元的特異性標志物，采用免疫細胞化學技術SP法標記神經(jīng)元，具體方法參照試劑盒的說明書，以胞質及突起染成棕黃色為陽性神經(jīng)元。

1.2.3 用帶膜插件的培養(yǎng)皿共同培養(yǎng)神經(jīng)元與小膠質細胞 為了能達到神經(jīng)元與小膠質細胞共同培養(yǎng)，把帶有孔徑為0.22μm的膜插件放入培養(yǎng)有神經(jīng)元的培養(yǎng)皿中，將分離純化好的小膠質細胞培養(yǎng)在位于神經(jīng)元上層的膜插件上，由于有膜插件的存在，神經(jīng)元與小膠質細胞沒有直接的接觸，并且不能通過這種膜插件，但可溶性的蛋白可以通過。

1.2.4 分組及細胞處理 根據(jù)實驗要求分為空白對照組、Aβ蛋白組、共培養(yǎng)組、煙堿預處理組。其中空白對照組不施加任何干預，Aβ蛋白組是在培養(yǎng)的神經(jīng)元中加入終濃度為500 ng·mL－1的Aβ1－42，共培養(yǎng)組是在共同培養(yǎng)有神經(jīng)元與小膠質帶膜插件的培養(yǎng)皿中加入終濃度為500 ng·mL－1的Aβ1－42，煙堿預處理組是在加終濃度為500 ng·mL－1的Aβ1－42前24 h加入10μmol·L－1煙堿預激活與神經(jīng)元共培養(yǎng)的小膠質細胞上的α7－nAChR。加Aβ1－42后，各組繼續(xù)37℃、5%CO2孵箱中共培養(yǎng)96 h。

1.2.5 神經(jīng)元凋亡的檢測 首先選用流式細胞儀測定神經(jīng)元的凋亡率。各組細胞培養(yǎng)96 h之后先用胰酶消化，計數(shù)0.5×106～1×106個細胞，用PBS洗滌2次，依次加入Binding Buffer和FITC標記的Annexin－V于室溫避光條件下放置30 min，再加入PI（50μg·mL－1）5μL，避光5 min，最后加400μL Binding Buffer，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測。

其次選用免疫熒光顯微鏡檢測神經(jīng)元的凋亡率用Fluorescein FragEL DNA Fragmentation Detection Kit試劑盒檢測神經(jīng)元的凋亡數(shù)。詳細操作按試劑盒說明書來做。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件統(tǒng)計處理，計量數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用單因素方差分析，凋亡百分率采用卡方分析。

2 結果

2.1 觀察原代培養(yǎng)的神經(jīng)元 用倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)7～10 d的神經(jīng)元，可見胞體豐滿，清晰的突起，神經(jīng)元有單突起也有多突起者，漸連接在一起形成網(wǎng)絡。

2.2 神經(jīng)元的鑒定 用NSE免疫細胞化學染色，能清楚地見到神經(jīng)元突起及胞質被染成棕褐色。MAP－2免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下可見明顯的紅色胞質及突起，并用Hoechst 33258進行核染，胞核著藍色；經(jīng)過軟件疊加后可見Hoechst 33258核染的細胞上大部分MAP－2都呈陽性表達。按公式MPA－2陽性數(shù)／核染陽性數(shù)為細胞純度，結果神經(jīng)元的純度幾乎達到了94.49%±1.22%，見圖1。

圖1 神經(jīng)元的鑒定結果A.MAP－2染色陽性的神經(jīng)元（×200）；B.用Hoest 33258核染陽性的細胞（×200）；C.圖A與B進行疊加的效果圖（×200）

2.3 流式細胞儀檢測神經(jīng)元的凋亡 結果見圖2。空白對照組、Aβ蛋白組、共培養(yǎng)組、煙堿預處理組凋亡率分別為14.93%±6.40%、37.57%±15.54%、51.20%±12.43%、32.07%±7.67%。共培養(yǎng)組高于Aβ蛋白組（P＜0.05），煙堿預處理組低于共培養(yǎng)組（P＜0.05），見圖3。

圖2 流式細胞儀檢測神經(jīng)元的凋亡A.空白對照組；B.Aβ蛋白組；C.共培養(yǎng)組；D.煙堿預處理組

圖3 流式細胞儀檢測各組神經(jīng)元凋亡之間的比較

2.4 免疫細胞熒光檢測凋亡 在高倍顯微鏡觀察用TUNNEL標記的凋亡細胞，隨機選取5個視野，統(tǒng)計陽性細胞的數(shù)量。凋亡率分別為13.28%±2.92%、18.65%±2.06%、30.18%±1.26%、20.53%± 1.27%。共培養(yǎng)組高于Aβ蛋白組（P＜0.05），煙堿預處理組低于共培養(yǎng)組（P＜0.05）。

3 討論

小膠質細胞是參與中樞炎性反應最主要的細胞，這些細胞激活后可釋放多種細胞因子、趨化因子、補體及其激活物，如IL－1α、IL－1β、IL－6和TNF、IL－8、MIP－1α、MCP－1等［4］，導致非特異性炎細胞浸潤，產(chǎn)生慢性炎癥，使神經(jīng)系統(tǒng)受損。在Aβ斑塊周圍，常積聚大量激活的膠質細胞，甚至在星形膠質細胞內也有Aβ堆積［5］。Aβ形成后可對神經(jīng)細胞產(chǎn)生直接毒性作用［6］。激活的神經(jīng)系統(tǒng)中膠質細胞和少突膠質細胞釋放炎性介質，觸發(fā)神經(jīng)細胞損傷的信號通路，導致神經(jīng)細胞受損，激活的膠質細胞可以通過釋放活性氧、NO、蛋白水解酶等介質對鄰近的神經(jīng)元產(chǎn)生殺害作用［7，8］，同時炎性因子介導的炎性反應又可以促進淀粉樣前體蛋白（APP）代謝為Aβ蛋白，從而加重炎性反應，形成惡性循環(huán)。本課題的前期研究采用RT－PCR及免疫熒光雙染技術，從mRNA及蛋白水平證實了體外培養(yǎng)的小膠質細胞均能表達α7－nAChR［9］，并且進一步的證明激活該受體可以減少Aβ介導的炎性介質的分泌。

為觀察激活α7－nAChR對減少Aβ介導的神經(jīng)元損傷作用，在本試驗中我們特別采用了transwell這種特殊裝置，實現(xiàn)非接觸性細胞通訊，觀察共培養(yǎng)體系中小膠質細胞在Aβ作用下釋放的可溶性炎性介質對神經(jīng)元的作用。結果顯示，神經(jīng)元在正常培養(yǎng)狀態(tài)下也有一定程度的凋亡，但若在培養(yǎng)神經(jīng)元中直接加入Aβ，神經(jīng)元凋亡率較空白對照組明顯增加，提示Aβ對神經(jīng)元有直接損傷作用。如果將小膠質細胞與神經(jīng)元細胞共培養(yǎng)再用Aβ作用于小膠質細胞，由此引起的神經(jīng)元凋亡不僅比空白對照組高，而且也明顯高于Aβ組，說明Aβ可通過小膠質細胞加重對神經(jīng)元的損傷。由于我們采用transwell共培養(yǎng)的小膠質細胞與神經(jīng)元細胞不能直接接觸，只能通過細胞分泌的可溶性介質實現(xiàn)細胞間的相互作用［10］。所以小膠質細胞加重神經(jīng)元損傷可以通過細胞介質來實現(xiàn)。在這些介質中，Aβ介導小膠質細胞分泌的細胞因子也許是重要的因素。因激活小膠質細胞α7－nAChR能削弱這些細胞介質的分泌，故我們期望通過預激活α7－nAChR，對Aβ通過小膠質細胞造成的神經(jīng)元損傷起保護作用，研究結果正好與我們的預期目的一致。對神經(jīng)元凋亡的統(tǒng)計，為避免研究者主觀影響，我們通過流式細胞儀，采用Annexin－V／PI檢測早期細胞凋亡，該方法較靈敏，受主觀影響較小，且適合定量的檢測。流式細胞檢查結果顯示，Aβ蛋白作用于共培養(yǎng)組的神經(jīng)元96 h之后，神經(jīng)元的凋亡數(shù)量達到了47.86%±6.7%，而Aβ直接作用組的凋亡率為30.90%±4.27%相比，明顯低于共培養(yǎng)組（P＝0.001）。用煙堿預激活小膠質細胞上的α7－nAChR之后，神經(jīng)元的凋亡率為28.73%±2.80%，與共培養(yǎng)組相比明顯下降，接近Aβ直接作用組（P＝0.554）。這進一步佐證了我們的研究結果，并提示在AD患者腦內沉積的Aβ除可以直接對神經(jīng)元產(chǎn)生損傷外，也許通過作用小膠質細胞釋放炎性介質及趨化因子對神經(jīng)細胞損傷更為嚴重，因此激活小膠質細胞α7－nAChR，減少炎性介質及趨化因子的釋放，削弱Aβ對神經(jīng)細胞的損傷，可能是預防和治療AD的有效措施，這一研究結果有可能對開發(fā)AD治療新的策略產(chǎn)生影響。

［1］ Findeis MA.The role ofamyloid beta peptide42 in Alzheimer′s disease［J］.Pharmacol Ther，2007，116（2）：266－286.

［2］ Tracey KJ.The inflammatory reflex［J］.Nature，2002，420（6917）：853－859.

［3］ Wang H，Yu M，Ochani M，et al.Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunite is an essential regulator of inflammation［J］.Nature，2003，421（6921）：384－388.

［4］ Town T，Nikolic V，Tan J.Themicroglial＂activation＂continuum，from innate to adaptive response［J］.JNeuroinflammation，2005，Oct31（2）：24.

［5］ Nagele RG，D′Andrea MR，Lee H，et al.Astrocytes accumulate A beta 42 and give rise to astrocytic amyloid plaques in Alzheimer disease brains［J］.Brain Res，2003，971（2）：197－209.

［6］ Jen LS，Hast AJ，Jen A，et al.Alzheimer′s peptide kills cells of retina in vivo［J］.Nature，1998，392（6672）：140－141.

［7］ Savage MJ，Lin YG，Ciallella JR，et al.Activation of c－Jun N－terminal kinase and p38 in an Alzheimer′s diseasemodel is associated with amyloid deposition［J］.J Neurosci，2002，22（9）：3376－3385.

［8］ Halliday G，Robinson SR，Shepherd C，et al.Alzheimer′s disease and inflammation：a review of cellular and therapeutic mechanisms［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2000，27（1／2）：1－8.

［9］ 雷露雯，王勇.小膠質細胞α7－nAChR表達及意義［J］.山東醫(yī)藥，2008，48（48）：1－2.

［10］Zujovic V，Taupin V.Use of cocultured cell systems to elucidate chemokine－dependent neuronal／microglial interactions：control of microglial activation［J］.Methods，2003，29（4）：345－350.

Study on activation m icroglia′sα7－nAChR for reducing neuron toxicity induced by Aβprotein

LEILu-wen，LIWei-xuan，F(xiàn)ENG Zhi-ming，DENG Chong，CHENG Xiang
（Nanhai People Hospital，Southen Medical Unversity，F(xiàn)oshan 520000，China）

ObjectiveTo investigate the activation ofmicroglia′sα7neuromal acetylcholine receptor（α7－nAChR）for reducing neuron toxicity，which resulted from accumultation ofβ－amyloid peptide 1－42（Aβ1－42）increased levels of pro－inflammatory factors，contributed to the local jnflammatory response.MethodsThe cortex of fetation 18 days rats were isolated andminced.The growth ofneuronswas observed with contrastphasemiroscop.The cellswere identified by immunocytochemistry after immunostaining with MAP－2 and NSE on the tenth day.The tenth day neurons coculture withmicroglai cells in the transwells.The cells randomly divided into four groups：blank control，Aβprotein group，coculture group；nicotin pretreat group.Neurons apoptosismodel was established by added Aβ1－42protein in each group after 96 hours，and the apoptosis ratswas analysed by FCM and fluorescencemicroscopy.ResultsNeuron cells after 10 days incubation were identified by immunocytochemistry，immunofluorescence staining and DAB staining show neuron cells stainning positive，purity ratio reached 94.49%.The neuron apoptosis ratio in activativemicroglia′sα7－nAChR group was lower than that in inactivative group.ConclusionActivativemicroglia′sα7－nAChR reduced neuron apoptosis ratio，so that protected neuron from the toxic effect induced by pro－inflammatory factors.

α7－nAChR；Immunocytochemistry；Neuron；Apoptosis

R965

A

2095－5375（2015）08－0435－004

廣東省自然科學基金資助項目（No.07005203）

雷露雯，女，主管藥師，研究方向：臨床藥學，E－mail：leiluwen618＠163.com