1株快速增殖的HAV分離株基因型分析

白冰珂，胡 燕，鄔順全，姜棋予，楊瑞創(chuàng)，柴燕濤，李瑞生，侯 俊

HAV屬于小RNA病毒科嗜肝病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，全長約7500個(gè)核苷酸。HAV開放讀碼框架編碼一個(gè)大的前體蛋白，在病毒蛋白酶的作用下裂解產(chǎn)生11個(gè)不同大小的具有不同功能的蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白 VP1、VP2、VP3、VP4 以及非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C。一般HAV毒株在細(xì)胞培養(yǎng)中增殖緩慢，培養(yǎng)周期較長，為HAV滅活疫苗的生產(chǎn)帶來不便。我們從一例甲型肝炎患者糞便中分離到1株HAV毒株，該病毒具有在細(xì)胞培養(yǎng)中快速增長的特性：其培養(yǎng)周期為13 d，而一般HAV在細(xì)胞中的生長周期為1個(gè)月。為了解其基因特點(diǎn)，為HAV疫苗生產(chǎn)打基礎(chǔ)，本文參照文獻(xiàn)報(bào)道方法，對(duì)HAV302株進(jìn)行了基因分型并對(duì)其編碼功能區(qū)序列進(jìn)行分析[1-2]，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病毒和試劑 HAV302株病毒為本室分離鑒定，QIAamp?Viral RNA mini kit購自Qiagen公司（德國凱杰公司），反轉(zhuǎn)錄酶SuperscraptШ和Taq酶購自Invitrogen公司（美國英駿公司），T載體購自Promega公司（美國普洛麥格公司），其他試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.2 病毒RNA的提取 用QIAamp?Viral RNA minikit提取病毒RNA，具體操作為：取140μl病毒培養(yǎng)液加入含carrierRNA的結(jié)合液AVL中，加入無水乙醇后過柱，用AW1、AW2溶液洗柱，14 000 r/m高速離心徹底去除乙醇，最后用洗脫液AVE洗脫病毒RNA。

1.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）

1.3.1 VP1/2A區(qū)段的 RT-PCR 取 2μl病毒RNA， 以 SuperscraptШ和 引 物 1 （序 列 ：5′-TTTTTTTTTTTTTGGTACCATTTACTGA）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增VP1/2A區(qū)段的168個(gè)核苷酸（上游引物：5′-GAATCAATGATGAGCAGA，下游引物：5′-AACCCCTTCATTTTCCTA），擴(kuò)增條件為94℃，2min；94℃，30 s；47℃，30 s；72℃，30 s；擴(kuò)增 40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小后進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3.2 2B/2C區(qū)段的RT-PCR 取2μl病毒RNA，以 SuperscraptШ和引物 1（序列：5′-TTTTTTTTTTTT TGGTACCATTTACTGA）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增2B/2C區(qū)段的1326個(gè)核苷酸（上游引物：5′-GGTGTTGGATTAATAGCAG，下游引物：5′-CTGAGACCACAACTCCATA），擴(kuò)增條件為 94℃，2min；94 ℃，30 s；50℃，30 s；72℃，2min；擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小后進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4 引物合成及序列分析 引物合成和核酸序列測(cè)定均由Invitrogen公司進(jìn)行，測(cè)序結(jié)果用DNA STAR和CLUSTAL序列分析軟件進(jìn)行處理。

1.5 用于序列比較的HAV病毒株的選擇 根據(jù)Robertson等[1]對(duì)世界各地HAV株進(jìn)行基因分型的結(jié)果，結(jié)合我國已分離的HAV病毒株基因型，我們從GenBank中選取了7種（Ⅰ～Ⅶ是HAV的7種基因型；ⅠA型和ⅠB型、ⅢA型和ⅢB型為同一基因型Ⅰ型和Ⅲ型的不同亞型）HAV基因型的14個(gè)代表毒株，包括PRC16（ⅠA型，GenBank序列號(hào)：L07716.1）、PRC37（Ⅰ A 型，GenBank 序 列號(hào)：L07717.1）、S85-1（ⅠA 型，GenBank 序 列號(hào)：L07715.1）、CHINA81（ⅠA 型，GenBank 序列號(hào)：L07712.1）、LCDC-1（ⅠA 型，GenBank 序列號(hào)：L07714.1）、MBB（ⅠB 型，GenBank 序列號(hào)：M20273.1）、HM175（ⅠB 型，GenBank序列號(hào)：U68700.1）、CF-53（Ⅱ型，GenBank序列號(hào)：L07693.1）、PA21（ⅢA型，GenBank序列號(hào)：L07730.1）、M-25（ⅢB 型，GenBank 序列號(hào)：L20544.1）、CY145（Ⅳ型，GenBank序列號(hào)：L07732.1）、AGM-27（Ⅴ型，GenBank 序列號(hào) ：D00924.1）、JM55 （Ⅵ 型 ，GenBank 序 列 號(hào) ：L07731.1） 和 SLF88（Ⅶ型，GenBank序列號(hào)：L07729.1）。

2 結(jié) 果

2.1 VP1/2A區(qū)序列的擴(kuò)增與鑒定 通過RT-PCR成功擴(kuò)增出目的片段，電泳顯示約170 bp，與預(yù)計(jì)大小相符。

2.2 HAV302株的基因型分析 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以VP1/2A區(qū)168個(gè)核苷酸序列為HAV基因分型標(biāo)準(zhǔn)[1]，運(yùn)用DNA STAR軟件將 HAV302與 GenBank中收錄的其他14株HAV VP1/2A區(qū)基因型序列進(jìn)行比較。結(jié)果顯示HAV302株與MBB株VP1/2A區(qū)序列有1個(gè)堿基不同（99C→T），與HM175株有8個(gè)堿基不同，而與其他9個(gè)病毒株則至少有10個(gè)堿基不同（圖1）。其相應(yīng)的氨基酸序列比較顯示與MBB株完全一致，而與其他10個(gè)病毒株則至少有1個(gè)氨基酸不同（圖2）。通過分析發(fā)現(xiàn)HAV302株與MBB株親緣性最高，初步推斷HAV302株與MBB株屬同一亞型，為基因Ⅰ型中的ⅠB亞型[3]。

將除HAV302株的14個(gè)病毒株VP1/2A區(qū)核苷酸和氨基酸序列用CLUSTAL軟件兩兩進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示不同基因型間的核苷酸同源性為69.6%（117/168）～91.1%（153/168），同一基因型內(nèi)不同亞型間核苷酸的同源性為 86.9%（146/168）～100%（168/168），同一亞型不同分離株間核苷酸同源性為 94.6%（159/168）～100%（168/168）；而同一基因型內(nèi)氨基酸序列的同源性為 96.4%（54/56）～100%（56/56），不同基因型之間氨基酸序列的同源性為 83.9%（47/56）～100%（56/56）（表 1）。HAV302株核苷酸序列與MBB株同源性為99.4%，與HM175株同源性為95.2%，與其他病毒株同源性為70.2%～93.5%；其氨基酸序列與MBB株同源性為100%，與其他病毒株同源性為85.7%～98.2%，進(jìn)一步證實(shí)HAV302株與MBB株同屬ⅠB亞型。

2.3 不同基因型HAV VP1/2A區(qū)序列的進(jìn)化樹分析 在初步判斷HAV302株基因型的基礎(chǔ)上，將其與從GenBank中選取的7種HAV基因型的14個(gè)代表毒株的VP1/2A區(qū)核苷酸序列進(jìn)一步用DNA STAR軟件進(jìn)行進(jìn)化分析，得到種系發(fā)生樹（phylogenetic tree）。進(jìn)化結(jié)果分析顯示，HAV302株與MBB和HM175株處于進(jìn)化樹的同一進(jìn)化枝上，同屬IB亞型，且與MBB株親緣關(guān)系最近；該病毒株與HAV其他基因型的病毒株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。

2.4 HAV302株編碼基因序列的分析 將HAV302株的編碼區(qū)各基因序列與MBB株相應(yīng)序列比較，發(fā)現(xiàn)2B和2C區(qū)核苷酸序列差異最大：其中2B區(qū)有4個(gè)核苷酸不同，同源性為98.96%（380/384）；2C區(qū)有17個(gè)核苷酸不同，同源性為98.28%（973/990）。推導(dǎo)的氨基酸序列比較，2B區(qū)有2個(gè)氨基酸變異，同源性為98.43%（126/128）；2C區(qū)有9個(gè)氨基酸變異，同源性為97.27%（321/330）。見表2。

3 討 論

HAV的基因組結(jié)構(gòu)和體外細(xì)胞培養(yǎng)特性不同于其他小RNA病毒，其VP1/2A連接物不被病毒蛋白酶裂解，而由細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶將2A蛋白降解，從而使VP1蛋白釋放出來，參與病毒的組裝和成熟[4]。VP1/2A連接區(qū)VP1的突變可能因影響病毒蛋白加工從而影響病毒的成熟，而2A蛋白則可能和病毒顆粒的組裝有關(guān)[5]。HAV抗原生產(chǎn)制備采用常規(guī)培養(yǎng)法，一般在1個(gè)月左右收獲病毒，黃麗娟等[6]采用轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)技術(shù)將HAV的培養(yǎng)時(shí)間縮短到18 d即可收獲病毒，其HAV抗原滴度為1∶8。我們分離的HAV302株雖然有快速繁殖能力（培養(yǎng)13 d即可收獲病毒，抗原滴度達(dá)1∶50），但是其VP1/2A區(qū)序列和MBB株同源性高達(dá)99.4%，而且相應(yīng)氨基酸序列同源性為100%，表明病毒的快速繁殖與VP1/2A區(qū)不相關(guān)。而文獻(xiàn)報(bào)道2B和2C蛋白在整個(gè)基因和RNA復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用，即和體外適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)及有效增殖相關(guān)，尤其是2B區(qū)的變異可能加快病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的生長速度[7]。另據(jù)研究報(bào)道2B/2C區(qū)基因的突變是細(xì)胞適應(yīng)所必需的，2B/2C的協(xié)同突變可使HAV適應(yīng)組織培養(yǎng)，促進(jìn)病毒繁殖，這可能與2B和2C在細(xì)胞中的獨(dú)特作用有關(guān)：2B及其前體2BC蛋白影響著細(xì)胞膜的改變，2B蛋白還可以通過阻斷干擾素調(diào)節(jié)因子-3的活化來抑制細(xì)胞內(nèi)干擾素β基因的轉(zhuǎn)錄，該機(jī)制被認(rèn)為對(duì)病毒的生存至關(guān)重要[8-11]。我們?cè)谘芯窟^程中也發(fā)現(xiàn)HAV302株的2B和2C區(qū)變異高于其他蛋白編碼區(qū)，提示其快速繁殖能力的獲得可能在于2B和2C蛋白的變異，尤其是其優(yōu)勢(shì)蛋白2B蛋白的變異。但目前該結(jié)論僅限于推測(cè)階段，其具體基因功能須在后續(xù)的研究中加以證實(shí)。

圖1 不同HAV病毒株VP1/2A區(qū)核苷酸序列比較Figure 1 Comparison of nucleotide sequences covering the adjacent region of VP1/2A fragments among different HAV strains

圖2 不同HAV病毒株VP1/2A區(qū)氨基酸序列比較Figure 2 Com parison of am ino acid sequences covering the adjacent region of VP1/2A fragments among different HAV strains

HAV基因分型方法及型別的建立，使HAV的流行病學(xué)研究從宏觀進(jìn)入到微觀分子水平。用HAV基因分型理論分析HAV的流行特征及其流行因素，確定暴發(fā)或流行與傳染源之間的內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)甲型肝炎的預(yù)防和控制具有重要意義。Robertson等[12]以HAV VP1/2A連接區(qū)168個(gè)核苷酸的不同序列作為分型標(biāo)準(zhǔn)對(duì)全球29個(gè)國家的152株HAV進(jìn)行分型比較，發(fā)現(xiàn)HAV各型間該區(qū)的核苷酸序列同源性為75%～85%，相應(yīng)的氨基酸序列同源性為82%～97%。我們將HAV302株和其他HAV毒株VP1/2A區(qū)的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該分離株核苷酸序列與MBB株的同源性最高為99.4%，與CY145株的同源性最低為70.2%；相應(yīng)的氨基酸序列同源性與MBB株最高為100%，同CY145株的同源性最低為85.7%。

表1 HAV302核苷酸序列(VP1/2A，168nt)及相應(yīng)氨基酸序列(VP1/2A，56aa)同源性比較(%)Table 1 Homology com parison of nucleotide sequences(HAV302 VP1/2A,168nt)and am ino acid sequences(HAV302 VP1/2A,56aa)(%)

圖3 HAV302株VP1/2A區(qū)遺傳進(jìn)化分析Figure 3 Phylogenetic tree for HAV302 based on the partial sequences of the VP1/2A fragments

表2 HAV302株與MBB株2B、2C區(qū)核苷酸及氨基酸序列比較Table 2 Comparison of the homology of nucleotide sequences and am ino acid sequences between HAV302 and MBB 2B and 2C fragments

我國屬于HAV高流行區(qū)，1992年Roberston等[12]對(duì)世界各地HAV株進(jìn)行基因分型，來自我國的5株病毒均為ⅠA 亞型（PRC16、CHINA81、S85-1、LCDC-1和CHINA83）。但是隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人員交流增多，我國HAV基因型分布也日益多元化，逐漸發(fā)展為以ⅠB亞型為主。以往報(bào)道的H2株HAV均屬于ⅠB亞型[6,13]，而我們分離的這株HAV也屬ⅠB亞型。當(dāng)前預(yù)防甲型肝炎發(fā)生和流行惟一有效的手段仍是接種疫苗，而目前常用的HAVH2株減毒活疫苗和HM175株滅活疫苗的基因型均為ⅠB亞型，與我們分離的HAV302株相同，而HAV302株擁有的快速繁殖能力則為其改造成高產(chǎn)HAV疫苗及HAV基因功能的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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