家蠅幼蟲防御素基因MddⅠ在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗菌活性鑒定

傅小蒙，萬 玲，唐艷,孔令聰，裴志花，劉樹明，馬紅霞,2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118;2.動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130118)

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家蠅幼蟲防御素基因MddⅠ在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗菌活性鑒定

傅小蒙1，萬 玲1，唐艷1,孔令聰1，裴志花1，劉樹明1，馬紅霞1,2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118;2.動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130118)

根據(jù)家蠅幼蟲防御素基因(MddI)序列，設(shè)計合成含有KpnI和XbaI酶切位點的特異性引物，PCR擴(kuò)增出MddI基因全長序列?？寺〔y定序列后，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-MddI，將其在畢赤酵母(P.pastoris)GS115中分泌表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性分析。結(jié)果表明，MddI基因在P.pastoris中成功表達(dá)，分子量約為10.3kDa，抑菌結(jié)果顯示MddI基因的真核表達(dá)產(chǎn)物對豬源鏈球菌有抑制作用。該試驗成功構(gòu)建了表達(dá)MddI基因的P.pastoris菌株，為進(jìn)一步研究MddI真核表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性和免疫學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。

家蠅；防御素；P.pastoris；真核表達(dá)；抗菌活性

家蠅是地球上分布極其廣泛的一種昆蟲，長期生活在雜菌橫生的環(huán)境中，研究報道其獨(dú)特的抗病能力可能源于其體內(nèi)所含有的多種抗菌活性物質(zhì)，而防御素就是其中之一[1-2]。家蠅防御素可抑制多種病原微生物的生長，尤其對耐藥的革蘭氏陽性菌有很強(qiáng)的殺傷作用[3]，在抗生素耐藥性日趨嚴(yán)重的情況下，利用基因工程的方法大量制備抗菌肽產(chǎn)品具有廣闊的研究前景。由于防御素對細(xì)菌有很強(qiáng)的殺傷作用[4]而不易在細(xì)菌中高效表達(dá)，且其在原核系統(tǒng)中的表達(dá)具有不能正確折疊，缺少翻譯后的修飾等[5]缺點，而P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對真核基因表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，是一個較為理想的抗菌肽基因表達(dá)系統(tǒng)[6]。家蠅幼蟲防御素基因MddI是家蠅防御素Defensin-2家族中的一員，與GenBank中登錄號為AY260152的家蠅防御素基因同源性最高，達(dá)到76%。本研究構(gòu)建了表達(dá)MddI基因的重組酵母菌株，對MddI基因進(jìn)行了真核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與表達(dá)載體 大腸桿菌DH5α菌株、P.pastorisGS115菌株、pGAPZαA載體、豬源鏈球菌耐藥株、雞源大腸桿菌耐藥株與雞傷寒沙門氏菌耐藥株，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與酶 限制性內(nèi)切酶KpnI、XbaI、BlnI，T4 DNA連接酶，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker(14.3～97.2 kDa)，DNA Marker(DL2000，λ-HindⅢ)均購自寶生物工程有限公司；博來霉素(Zeocin)購置Invitorgen公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、溴酚藍(lán)、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、Tris、甘氨酸與十二烷基磺酸鈉,均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1MddI的克隆 根據(jù)MddI基因序列[7]，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計兩條特異性引物，序列為P1：ATTAGGTACC GCCACC ATGAAATTC，其中第一條與第二條下劃線序列分別為KpnI限制性內(nèi)切酶酶切位點與Kozak序列[8]；P2：GGCCTTAATTTCTAGATCAGTTACG，下劃線部分為XbaI限制性內(nèi)切酶酶切位點。設(shè)計的引物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。利用兩條特異性引物，PCR擴(kuò)增出MddI基因目的片段后與pMD-18T克隆載體進(jìn)行連接，對克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證分析，并將陽性克隆質(zhì)粒送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 重組畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-MddI的構(gòu)建 將T-A克隆成功的質(zhì)粒與pGAPZαA載體經(jīng)KpnI和XbaI雙酶切后，回收并連接，構(gòu)建pGAPZαA-MddI真核表達(dá)質(zhì)粒，并對其進(jìn)行雙酶切驗證和測序分析。

1.2.3 酵母的電擊轉(zhuǎn)化及重組酵母菌株的篩選P.pastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞的制備參照Invitorgen公司提供的畢赤酵母表達(dá)手冊進(jìn)行[9]。通過電擊轉(zhuǎn)化的方法將經(jīng)過BlnI單酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入GS115感受態(tài)細(xì)胞(電轉(zhuǎn)參數(shù)1500 V、25 μF、200 Ω)。轉(zhuǎn)化后將酵母細(xì)胞涂布于含100 μg/mL Zeocin的 YPDS平板上，30 oC培養(yǎng)2～3 d，挑取轉(zhuǎn)化子，用特異性引物對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定。再經(jīng)不同濃度梯度博來霉素的YPDS 平板篩選高拷貝重組轉(zhuǎn)化子。

1.2.4MddI基因在畢赤酵母中的表達(dá) pGAPZαA為組成型表達(dá)載體，非誘導(dǎo)表達(dá)參照Invitrogen 公司推薦的非誘導(dǎo)表達(dá)程序進(jìn)行[10]，挑取高拷貝重組表達(dá)酵母菌株于5 mL 的YPD (含100 μg/mL Zeocin)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，OD600nm達(dá)到2～6 時取1 mL 培養(yǎng)液，重懸于50 mL 的YPD液體培養(yǎng)基中，每隔24 h 取1 mL 培養(yǎng)液，收集上清進(jìn)行Tris-SDS-PAGE分析。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物抑菌活性檢測 大量收集酵母表達(dá)上清，并用3 kDa的超濾管進(jìn)行濃縮脫鹽，取濃縮后的上清進(jìn)行抑菌活性檢測。以本實驗室在臨床分離的幾種耐藥菌株(豬源鏈球菌耐藥株、雞源大腸桿菌耐藥株與雞傷寒沙門氏菌耐藥株，)為試驗菌，采用管碟法測定表達(dá)上清對這些耐藥菌株的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1MddI基因PCR擴(kuò)增結(jié)果MddI基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1% 瓊脂糖電泳檢測顯示，獲得約為282 bp的目的片段，與預(yù)期大小相符(圖1)。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000； 1：PCR擴(kuò)增的Mdd I基因

2.2MddI基因T-A克隆結(jié)果 pMD-18T-MddI克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果顯示，在282 bp處有一條清晰條帶，與目的片段預(yù)期大小一致(圖2)。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000； 1：pMD-18T-Mdd I雙酶切

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-MddI雙酶切鑒定結(jié)果 pGAPZαA-MddI經(jīng)KpnI和XbaI雙酶切后，在282 bp處切出目的條帶，證明真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖3)。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1： pGAPZαA-Mdd I質(zhì)粒雙酶切

2.4 重組陽性表達(dá)質(zhì)粒單酶切鑒定結(jié)果 pGAPZαA-MddI經(jīng)過BlnI單酶切線性化后，在3382 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖4)。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)λ-HindⅢ； 1：pGAPZαA-Mdd I單酶切

2.5 重組陽性酵母表達(dá)菌株GS115/ pGAPZαA-MddI PCR鑒定結(jié)果 挑取在YPDS平板上生長的菌落于YPD液體培養(yǎng)基中，利用特異性引物對過夜培養(yǎng)的菌液進(jìn)行PCR驗證，陽性酵母表達(dá)菌株在282 bp處出現(xiàn)目的條帶，證明重組表達(dá)質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入P.pastorisGS115中(圖5)。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：GS115陰性對照；2：GS115/ pGAPZαA-Mdd I

2.6 GS115/ pGAPZαA-MddI重組酵母表達(dá)產(chǎn)物Tris-SDS-PAGE檢測 收集酵母表達(dá)上清進(jìn)行Tris-SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，在14.3 kDa之下有一明顯重組表達(dá)條帶(圖6)。

M: Protein Marker；1：GS115/ pGAPZαA空載體對照；2：GS115/ pGAPZαA-Mdd I酵母表達(dá)上清

2.7MddI重組酵母表達(dá)產(chǎn)物抑菌活性檢測 抑菌活性檢測結(jié)果顯示MddI重組酵母表達(dá)產(chǎn)物對豬源鏈球菌耐藥株具有顯著的抑制作用，而對雞源大腸桿菌耐藥株、雞傷寒沙門氏菌耐藥株無明顯抑制作用(圖7)。

a：GS115/ pGAPZαA-Mdd I酵母表達(dá)上清；b：陰性對照

3 討論與小結(jié)

與傳統(tǒng)抗生素相比，防御素作為一種新型的抗菌肽，其獨(dú)特的作用方式使細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性[11]。本試驗在研究MddI基因的抑菌活性時，發(fā)現(xiàn)其對革蘭陰性菌無明顯抑制作用，而對革蘭陽性菌的抑制效果十分顯著，這與先前報道的家蠅防御素對革蘭陽性菌敏感度較高這一結(jié)論相符。防御素發(fā)揮抗菌作用主要有細(xì)胞膜滲透機(jī)制、與細(xì)胞內(nèi)生物大分子作用以及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)三種方式[12-13]，MddI基因致革蘭陽性菌死亡屬于上述哪種機(jī)制還有待于進(jìn)一步論證。

P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)具有許多原核表達(dá)系統(tǒng)無法比擬的優(yōu)點，例如分子遺傳操作技術(shù)簡單，具有多種翻譯后加工修飾能力等[14]。本研究選用P.pastorisGS115菌株和pGAPZαA載體表達(dá)MddI基因主要有兩點原因：一為P.pastorisGS115是組氨酸缺陷型酵母菌株，而表達(dá)載體上攜帶的組氨酸基因，可補(bǔ)償宿主的組氫酸缺陷，因此可以在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，二為pGAPZαA是組成型分泌表達(dá)載體，具有PGAP啟動子(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)，在它控制下的外源基因表達(dá)率比甲醇誘導(dǎo)下的以PAOX1為啟動子的產(chǎn)量更高，并且PGAP為組成型啟動子不需甲醇誘導(dǎo)，發(fā)酵工藝簡單且生產(chǎn)過程安全，是一個很有潛力的啟動子。

本研究為了提高防御素基因在P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量，設(shè)計合成引物時，在起始密碼子前加入了Kozak序列，有研究證明在起始密碼子前后加入Kozak序列(GCCACC)，基因開始轉(zhuǎn)錄翻譯的效率最高[8]。本研究Tris-SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，表達(dá)的目的蛋白相對分子量略微偏大，參考Invitrogen 公司酵母表達(dá)手冊分析得出原因，可能是由于蛋白在翻譯加工時，C-末端2.5 kDa的標(biāo)簽未能成功切割所致。本試驗結(jié)果為進(jìn)一步研究MddI基因真核表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性和免疫學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯：侯向輝)

Expression ofMuscadomesticaLarvae Defensin GeneMddI inP.pastorisand Identification of Its Antibacterial Activity

FU Xiao-meng1, WAN Ling1, TANG Yan1, KONG Ling-cong1, PEI Zhi-hua1, LIU Shu-ming1, MA Hong-xia1,2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.AnimalProduction&ProductQualityandSecurityoftheMinistryofEducation,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

A pair of primers with restriction sitesKpnI andXbaI were designed and synthesized according to the gene sequence ofMuscadomesticalarvae defensin geneMddI, then facilitated to amplify the full-length sequence ofMddI by polymerase chain reaction (PCR). After cloning and sequencing, the eukaryotic expression plasmid pGAPZαA-MddI was constructed and then expressed inP.pastorisGS115, subsequently the antimicrobial activity of recombinant protein was analyzed. The result showed that the expressed protein ofMddI was about 10.3 kDa, which possessed antibacterial activity against swine Streptococcus. Conclusively, the recombinantP.pastoriswith geneMddI was successfully constructed, which was a basis for further researchers in biological and immunologic activities of eukaryotic expression product ofMddI.

Muscadomestica; defensin;P.pastoris; eukaryotic expression; antimicrobial activity

國家自然科學(xué)基金資助項目(31140026)；吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項目(2011-Y05)

傅小蒙，碩士研究生，從事動物藥理與毒理學(xué)的研究。

馬紅霞。E-mail：hongxia0731001@163.com

2015-07-05

A

1002-1280 (2015) 10-0022-05

S852.743